專利名稱：鉀離子濃度檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體而言涉及一種鉀離子濃度檢測方法。
背景技術：
人體內的鉀是維持細胞生理活動的主要陽離子，是保持機體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質代謝，保證神經肌肉的正常功能所必需，其含量是人體生理活動的重要指標。尿液、血清中鉀離子的含量水平在臨床上可用了診斷一些腎臟、心臟等方面的疾病。正常情況下，人體的鉀離子濃度有一個合理的參考范圍，如血清中3.5
5.5mmol/L ;尿液中25 125mmol/24h。當鉀離子高于參考值，表現出高鉀癥，其原因主要 有急性腎功能衰竭、嚴重溶血或組織損傷、急性酸中毒或組織缺氧、腎上腺皮質功能減退、醛固酮缺乏、長期應用利尿劑、家族性高血鉀等。血清鉀高還可引起嚴重的肌肉、心肌和呼吸功能的抑制性應激紊亂，以及特異的心電圖改變。血清鉀高于7mmol/L時，就有這些現象出現，超過lOmmol/L時，即可發生心室纖顫，心臟停搏而導致死亡。反之當鉀的攝入量不足、鉀丟失嚴重、腎臟疾病轉入多尿期等情況時則會出現低鉀癥。現有技術中測定鉀離子濃度的方法主要有中子活化法、同位素稀釋質譜法、化學測定法、火焰光度法、離子選擇電極法、酶動力學法、原子分光光度法等。目前，臨床上經常使用的方法是火焰光度法和離子選擇電極法。(I)火焰光度法火焰光度法是一種發射光譜分析法，利用火焰中激發態原子回降至基態時發射的光譜強度進行含量分析，可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經典的標準參考法，優點是結果準確可靠，廣為臨床采用。通常采用的定量方法有外標準法和內標準法。外標準法一般操作誤差較大，不常采用。內標法是標本及標準液采用加進相同濃度的內部標準元素進行測定，一般是加入鋰內標，測定的是鋰/鉀電流的比值，而不是單獨鉀的電流，這樣，可減小燃氣和火焰溫度波動等因素引起的誤差，因而有較好的準確性。(2)離子選擇電極法(ISE法):在專用儀器上進行血清和尿液的鉀、鈉離子測定。因其具有標本用量少，快速準確，操作簡便等優點，是目前所有方法中最為簡便準確的方法，幾乎有取代其他方法的趨勢。其原理是離子選擇電極是一種電化學傳感器，其結構中有一個對特定離子具有選擇性響應的敏感膜電極，將離子活度轉換成電位信號，在一定范圍內，其電位與溶液中特定離子活度的對數呈線性關系，通過與已知離子濃度的溶液比較可求得未知溶液的離子活度，按其測定過程又分為直接測定法和間接測定法，目前大部分采用間接測定法，由于間接測定法將待測樣本稀釋后測定，所測離子活度更接近離子濃度。目前主要的電極種類有玻璃膜電極，感應材料為玻璃膜；固相電極，由難溶金屬物質加壓成型；液態膜電極，將環氧樹脂或內裝聚氯乙烯作為感應膜；纈氨霉素膜制成的K+電極。這些電極都具有一定壽命，使用一段時問后，電極會老化，且價格昂貴。(3)化學測定法目前K+的化學測定主要利用復環王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進行測定，由于大環結構內有空穴，分子內部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結合，根據空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。(4)酶法酶法測定鉀的原理是利用對丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸變為乳酸同時伴有還原型輔酶I的消耗，在波長340nm處測NADH的吸光度下降。(5)原子分光光度法也可用于檢測血清中鉀、鈉離子，但操作復雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。
發明內容
本發明的目的提供一種利用菁染料超分子與鳥嘌呤四鏈體(G-四鏈體)作用體系檢測鉀離子濃度的新方法，以及應用該方法配制而成的鉀離子濃度檢測試劑盒。利用該試劑盒中的試劑，可通過溶液的顏色判斷樣品中的鉀離子濃度范圍，現可視化檢測。
本發明的總體技術路線為通過加入鉀離子來調控G-四鏈體結構的形成或構象轉變，隨之菁染料識別G-四鏈體結構的變化，從而反映出鉀離子的濃度水平。具體為在沒有鈉離子及其他金屬陽離子存在的環境下，鉀離子促使單鏈的DNA序列轉變為G-四鏈體結構，隨著G-四鏈體結構的生成，菁染料的聚集形態發生變化，從而在顏色上發生改變，達到肉眼觀測；或者在鈉離子存在的環境下，DNA序列形成反平行結構G-四鏈體，加入鉀離子反平行G-四鏈體則發生構象轉變，隨著G-四鏈體構象轉變，菁染料的聚集形態發生變化，從而在顏色上發生明顯的變化，從而半定量地判斷樣品中鉀離子濃度范圍。本發明的第一方面提供一種檢測液體樣品中鉀離子濃度范圍的方法，所述方法包括以下步驟(I)用pH6. 2 8. 2的緩沖溶液以一定的鉀離子濃度梯度配制多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的能夠形成G-四鏈體的DNA分子、相同濃度的鈉離子以及相同濃度的菁染料；將配制好的溶液樣本作為標準比色樣品備用；(2)在待測液體樣品中加入能夠形成G-四鏈體的DNA分子、菁染料以及緩沖液，以使待測液體樣品中的能夠形成G-四鏈體的DNA分子的濃度、菁染料的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液，并記錄待測液體樣品被稀釋的比例；(3)將測試溶液與步驟(I)中獲得的標準比色樣品的顏色進行對比，顏色與測試溶液相同的標準比色樣品的鉀離子濃度與測試溶液的鉀離子濃度一致，并通過待測樣品的稀釋比例計算待測樣品的鉀離子濃度。本發明的方法可以方便地用于檢測各種溶液樣品中的鉀離子濃度，例如，可以檢測人或動物血液、尿液或其他體液中的鉀離子濃度。根據本發明第一方面的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。在本發明的實施方案中，對緩沖液中緩沖劑的濃度并不做特別的限定，但是優選的濃度范圍為10 SOmmoI /I,η根據本發明第一方面的方法，其中所述菁染料為下式I的化合物
權利要求
1.一種檢測液體樣品中鉀離子濃度的方法，所述方法包括以下步驟 (1)用PH6.2 8. 2的緩沖溶液以一定的鉀離子濃度梯度配制多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的能夠形成G-四鏈體的DNA分子、相同濃度的鈉離子以及相同濃度的菁染料； (2)在待測液體樣品中加入能夠形成G-四鏈體的DNA分子、菁染料以及緩沖液，以使待測液體樣品中的能夠形成G-四鏈體的DNA分子的濃度、菁染料的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液，并記錄待測液體樣品被稀釋的比例； (3 )將測試溶液與步驟(I)中獲得的標準比色樣品的顏色進行對比，顏色與測試溶液相同的標準比色樣品的鉀離子濃度與測試溶液的鉀離子濃度一致，并通過待測樣品的稀釋比例計算待測樣品的鉀離子濃度。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述菁染料為式I的化合物，
3.如權利要求2所述的方法，其中所述C1-C6的烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
4.如權利要求2所述的方法，其中R1選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5獨立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戍基、異戍基、正己基或異己基。
5.如權利要求2所述的方法，其中所述5元至7元環結構為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環結構。
6.如權利要求2所述的方法，其中Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。
7.如權利要求2所述的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-I-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。
8.如權利要求I所述的方法，其中所述溶液樣本中鉀離子濃度在O至300mmol/L的范圍，優選在(TlOOmmol/L的范圍,進一步優選在(TlOmmol/L的范圍,最優選在(T2mmol/L的范圍；鈉離子濃度在O至200mmol/L的范圍，優選在4(Tl60mmol/L的范圍；所述菁染料在所述溶液樣本中的濃度在5至30 μ mo I /L的范圍，優選在5 20 μ mo I/L的范圍，所述能夠形成G-四鏈體的DNA分子在溶液樣本中的濃度在5 50 μ mo I/L的范圍，優選在5至30 μ mol/L。
全文摘要
本發明涉及鉀離子濃度的檢測方法。利用鉀離子調控可形成G-四鏈體DNA結構轉變的特性以及菁染料超分子聚集體識別G-四鏈體結構轉變的特性，將待測樣品加入可形成G-四鏈體的DNA與菁染料混合溶液，根據溶液的顏色半定量地判斷樣品中的鉀離子濃度范圍。該方法實現了鉀離子濃度的可視化檢測，可開發成檢測試紙。試劑成分簡單，反應過程簡單、不需要特殊或額外儀器，檢測成本低廉，便于行業內推廣應用。
文檔編號G01N21/78GK102866148SQ20121020584
公開日2013年1月9日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者唐亞林, 孫紅霞, 楊千帆, 尚倩, 姜薇, 蓋偉, 向俊鋒 申請人:中國科學院化學研究所