專利名稱：競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁bnp檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及的是生物技術領域，具體涉及的是競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒，本發明還涉及該試劑盒的制備方法。
背景技術：
B型尿鈉肽又稱腦尿鈉肽(Brain natriuretic peptide, BNP)。BNP作為心衰定量標志物，不僅反映左室收縮功能障礙，也反映左室舒張功能障礙、瓣膜功能障礙和右室功能障礙情況。以BNP 100pg/ml作為臨界值的陰性預測值達到90%，可以減少74%的臨床不確定性；而8冊超過400pg/ml提示患者存在心力衰竭的可能性達95%。而BNP在100_400pg/ml時可能由肺部疾病、右心衰、肺栓塞等情況弓I起。呼吸困難患者急診就診時的BNP水平以 及治療后的變化也可以反映其出院時風險。因此，及時準確測量BNP含量十分重要。目前市場上已有的BNP (腦尿鈉肽)以及ProBNP (腦尿鈉肽前體)還有Nt-ProBNP(N端-腦尿鈉肽前體)測定方法有化學/電化學發光免疫檢測、放射免疫檢測、酶聯免疫檢測，其缺點是檢測時間普遍較長(約30min)，檢測費用昂貴。另外膠體金法檢測BNP項目，雖然快速，但目前不能定量，檢測費用同樣昂貴，對于醫生診斷貢獻有限。據Hytest公司專家分析目前市面上的上述后兩種BNP檢測可能會因為ProBNP以及Nt-ProBNP的糖基化造成漏檢；而BNP相對不穩定，半衰期較短。因此，相對快速的對于BNP檢測尤為重要。傳統的膠乳顆粒增強免疫比濁法檢測抗原物質時采用的是夾心法檢測原理，即被檢測物抗原與樣本稀釋液(試劑I)混合后孵育一定時間，再與包被有對應抗體的納米顆粒(試劑2)發生抗原抗體反應，形成不容性的免疫復合物，在全自動生化儀上表現為吸光度上升(形成一定的吸光度變化值)，這種吸光度的變化值與被測物質抗原含量正相關，使用已知濃度的標準品繪制標準曲線，則可根據被測標本的反應吸光度變化計算出其含量。其要求是抗原物質要有兩個以上的無空間位阻的抗原表位。但是，BNP (腦尿鈉肽)中無糖基化且和心臟疾病關系密切的抗原表位只有7個氨基酸，采用夾心法檢測難度較高。
發明內容
本發明的目的在于解決目前夾心法檢測BNP難度較高，檢測時間長的問題，提供一種速度快、檢測簡便的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒及其制備方法。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下
競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒，由膠乳顆粒以及反應緩沖液組成，所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的氨基酸序列
FGRKMDR-X ;X由2 4個K組成。進一步，所述反應緩沖液中含有抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體。更進一步地，所述競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒是基于免疫競爭法對檢測樣本中的BNP進行定量測定。
競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒的制備方法，包括膠乳顆粒的制備和反應緩沖液的制備，所述膠乳顆粒的制備方法由以下步驟組成
(al)活化膠乳顆粒，離心，去上清，使用HEPES緩沖液復溶；
(a2)加入人工合成的氨基酸序列FGRKMDR-X，室溫下反應2小時；
(a3)加入上述反應體積1/100的IM甘氨酸，以及10%BSA溶液，反應30min ；
(a4)離心，去上清，使用HEPES緩沖液復溶即制成成品。為了更有效的得到所需膠乳顆粒；所述離心的條件為22000rpm，離心的時間為IOmin0作為一種優選，所述(al)中活化膠乳顆粒所采用的試劑為EDC和S-NHS。進一步，所述反應緩沖液制備過程如下
在IOOmM的MES緩沖液中加入終濃度為0. 001 0. lmg/ml的抗FGRKMDR抗原表位的
單克隆抗體。本發明原理是納米顆粒包被的是和被測抗原物質相同或相似的抗原，與一定量的對應的抗體發生抗原抗體反應，形成不容性的免疫復合物，在全自動生化儀上表現為形成一定的吸光度變化值。當被測物中含有此種抗原時，由于競爭原理，所形成的吸光度變化值與無被測物質時相比下降，在競爭法中吸光度的變化值與被測物質抗原含量負相關，使用已知濃度的標準品繪制標準曲線，則可根據被測標本的反應吸光度變化計算出其含量。 本發明具有以下優點及有益效果
I、在BNP的抗原測定中，由于其抗原太小，無法提供形成夾心免疫復合物的多個抗原表位；使用本發明無需形成多個抗原表位，即可有效的對BNP進行檢測，使檢測方法更簡便，檢測結果更準確。2、采用本發明的試劑盒可快速對BNP進行檢測，檢測時間僅需要lOmin。3、本發明采用包被有人工合成的氨基酸FGRKMDR-X的膠乳顆粒以及含有抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體的反應緩沖液對BNP進行檢測；因此，本發明具有特異性好、準確性高的優點。4、通過本發明的試劑盒進行檢測，其檢測成本相對低廉，適合推廣應用。5、本發明的免疫競爭法同時適用于其他小分子抗原的測定。
圖I為本發明不同含量的BNP參考標準的標準曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不限于下列實施例。實施例I
本發明由膠乳顆粒以及反應緩沖液組成。所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的氨基酸序列FGRKMDR_X ;X由2 4個K組成。所述反應緩沖液中含有抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體。該FGRKMDR為現有的氨基酸序列。
所述人工合成的氨基酸序列FGRKMDR_X，由生工生物工程(上海)有限公司合成。抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體由Abcom公司提供。(a)所述膠乳顆粒的制備方法由以下步驟組成
(al)采用EDC和S-NHS活化膠乳顆粒，活化時間為15min，活化后的物質在22000rpm的條件下離心lOmin，去上清，使用HEPES緩沖液復溶；
(a2)加入人工合成的氨基酸序列FGRKMDRKK，在室溫下反應2小時；
(a3)加入上述反應體積1/100的IM甘氨酸，以及10%BSA溶液，反應30min ； (a4)在22000rpm的條件下離心lOmin，去上清，使用HEPES緩沖液復溶。根據上述步驟即可制備出本發明所需的膠乳顆粒。上述步驟中EDC為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；上述S-NHS為N-羥基硫代琥珀酰亞胺。(b)所述反應緩沖液制備過程如下
在IOOmM的MES緩沖液中加入終濃度為0. OOl 0. lmg/ml的抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體。所述MES為脂肪酸甲酯磺酸鹽；MES緩沖液的pH為5. O 7. 5。本實施例中抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體的終濃度為0. OOlmg/ml 0采用上述步驟制備出的膠乳顆粒和反應緩沖液，檢測出不同濃度下的BNP標準品的吸光度，通過該濃度和吸光度制成本發明的標準曲線；其檢測過程如下
往日立7060全自動生化分析儀器中加入本發明的膠乳顆粒和反應緩沖液，膠乳顆粒200ul,反應緩沖液50ul。再向該全自動生化儀中加入30ul的樣本。進行檢測,檢測參數反應時間IOmin, 18 31讀點，570nm單波長。標準曲線的制作過程如下采用以下標準樣本校準點濃度0. 0pg/ml、50pg/ml、150pg/ml、300pg/ml、600pg/ml ;用5點Spline或Log4p模式校準,通過檢測結果制作出本發明標準曲線。本實施例的標準曲線如圖I所示，其中X軸代表BNP含量，Y軸表示吸光度
變化值。完成標準曲線后，即可進行標本測定，由儀器可自動計算出樣本中BNP含量。本實施例對9份樣本進行檢測；同時,采用Roche cobas e 411電化學發光全自動免疫分析系統和pro BNP II腦利鈉肽前體對樣本進行檢測作為對照實驗，檢測結果如表I。實施例2
本實施例與實施例I的不同點在于膠乳顆粒包被的人工合成的氨基酸序列不同；同時，本實施例中所采用的抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體的終濃度為0.05 mg/ml。本實施例采用的人工合成的氨基酸序列為FGRKMDRKKK。檢測結果如表I。實施例3
本實施例與實施例I的不同點在于膠乳顆粒包被的人工合成的氨基酸序列不同；同時，本實施例中所采用的抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體的終濃度為0. lmg/ml。本實施例采用的人工合成的氨基酸序列為FGRKMDRKKKK。檢測結果如表I。表I
樣本j實施例I j實施例2 j實施例3 j對照實驗
1133.6 141. 3 137. 5 128.3
225.2 21. 3 26.4 22. 3~ KOO. I 丨440. 2 丨439. 7 丨419. 權利要求
1.競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒，由膠乳顆粒以及反應緩沖液組成，其特征在于所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的氨基酸序列 FGRKMDR-X ;X由2 4個K組成。
2.根據權利要求I所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒，其特征在于，所述反應緩沖液中含有抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體。
3.根據權利要求I或2所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒，其特征在于，是基于免疫競爭法對檢測樣本中的BNP進行定量測定。
4.根據權利要求I 3任一項所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒的制備方法，包括膠乳顆粒的制備和反應緩沖液的制備，其特征在于，所述膠乳顆粒的制備方法由以下步驟組成 (al)活化膠乳顆粒，離心，去上清，使用HEPES緩沖液復溶； (a2)加入人工合成的氨基酸序列FGRKMDR-X，室溫下反應2小時； (a3)加入上述反應體積1/100的IM甘氨酸，以及10%BSA溶液，反應30min ； (a4)離心，去上清，使用HEPES緩沖液復溶即制成成品。
5.根據權利要求4所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述離心的條件為22000rpm，離心的時間為lOmin。
6.根據權利要求5所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述(al)中活化膠乳顆粒所采用的試劑為EDC和S-NHS。
7.根據權利要求4 6任一項所述的競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述反應緩沖液制備過程如下 在IOOmM的MES緩沖液中加入終濃度為0. 001 0. lmg/ml的抗FGRKMDR抗原表位的單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了競爭法膠乳顆粒增強免疫比濁BNP檢測試劑盒及其制備方法，解決了目前夾心法檢測BNP難度較高，檢測時間長等問題。本發明的試劑盒，由膠乳顆粒以及反應緩沖液組成，其特征在于所述膠乳顆粒包被有以下人工合成的氨基酸序列FGRKMDR-X；X由2～4個K組成。本發明還提供了該試劑盒的制備方法。本發明具有準確性高、檢測時間短、可靠性高等優點。
文檔編號G01N21/31GK102680712SQ201210200339
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者王釗 申請人:王釗