專利名稱：神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物類免疫檢測試劑領域，具體涉及一種神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒及其制備方法與應用，更具體地說，是涉及一種基于磁微粒分離化學發光法定量檢測腫瘤標志物神經元特異性烯醇化酶(NSE)的試劑盒及其制備方法，以及應用該試劑盒定量檢測腫瘤標志物神經元特異性烯醇化酶的方法。
背景技術：
神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，存在于神經組織和神經內分泌組織中。NSE在腦組織細胞的活性最高，夕卜周神經和神經分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經組織、血清和脊髓液。含NSE的細胞破壞后會使NSE釋放入血清，因此可以檢測出來，正常人血清NSE水平為5 15ng/ml。細胞免疫化學的研究結果揭示，NSE高特異性的定位于神經元和神經內分泌細胞，如APUD細胞系。通過監測因基因表達活性改變和細胞表型轉換所致代謝異常的疾病患者的生物體液，如血清和脊髓中的NSE活性水平，可對疾病提供診斷的有用信息。1982年Carney等人首先報道,小細胞肺癌的大多數患者顯示血清NSE活性明顯增高。其后，許多研究者也相繼證明，NSE用于小細胞肺癌診斷，是一個具有高特異性和高靈敏性的腫瘤標記物，其特異性高達80% 90%，診斷靈敏度達80%。雖然NSE的異常表達并不真正構成是小細胞肺癌的早期診斷指標。但是，最重要和最有意義的是，NSE活性水平改變同小細胞肺癌的臨床過程具有很好的相關性。相關臨床資料分析結果顯示，絕大多數患者經化療或合并放療后，腫瘤縮小，NSE明顯降低，與治療前相比具有顯著性差異。相反，若NSE在治療過程中不降低，臨床上腫瘤也不見治療反應。紀樹國等人指出，經化療和放療后，病情穩定的絕大多數病例NSE活性在正常值范圍內波動。NSE活性不見降低的病例，表明病情控制不理想。NSE在神經母細胞瘤診斷中也得到應用，神經母細胞瘤是兒童中常見的實體瘤，它起源于神經脊，通常對它較難做出確切診斷。因為諸如橫紋肌肉瘤、Wilms腫瘤等同神經母細胞瘤一樣，有時也是由未分化的小燕麥細胞組成。近年來，研究者們應用NSE做出鑒別診斷，當患神經母細胞瘤時，NSE陽性率可達96% 100%，其測定值明顯增高。類似的研究證明，NSE活性水平分析，同樣可以用來監測神經母細胞瘤的病情改變，評價治療效果和預報復發。即在治療后，病情緩解時NSE活性降低，而復發時，NSE活性復又升高。這里有一點特別引人興趣，Zeltzer等人發現,如果患者血清NSE的初始水平低于100ng/ml,其預后良好，存活率高。反之，如果NSE初始水平高于上述數值，其預后狀況不佳，存活率明顯為低。因此，臨床中十分注意分析患者血清NSE的初始水平，對于實施分類救治方案是有重要意義的。在其他惡性腫瘤中，應用細胞免疫化學方法證明，NSE在非小細胞肺癌的各類型肺癌及其他一些內分泌腫瘤亦會顯示出不同的免疫原性反應，為此，Tapia等人認為NSE活性幾乎可以在所有的神經內分泌腫瘤中檢出。Nakajima認為是腫瘤發生后酶學表達的變化，但可以歸結為某些神經內分泌系統的細胞是來源于內胚層細胞，顯示出雙相或多相分化所致。總之，NSE在小細胞肺癌和神經母細胞瘤等內分泌腫瘤中顯示出很高的免疫活性，并可在血清中直接檢出，可以用來監測小細胞肺癌和神經母細胞瘤患者的病情發展，評價治療效果，預報復發，其方法要比X線胸透檢查來得早和方便，因此，NSE在臨床中已被做為一個十分有用的血清學的腫瘤標記物予以應用。在國內，神經元特異性烯醇化酶(NSE)檢測臨床上主要以國外進口試劑和免疫組化試劑應用為主，國外進口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經濟負擔，不利于在基層普及。具有自主知識產權的國產神經元特異性烯醇化酶(NSE)免疫化學發光檢測試劑盒目前還較少，也僅停留在96孔微孔板式技術水平上。該技術靈敏度較低、線性窄、特異性較差，也不利于高通量的全自動檢測。另外，由于板式檢測試劑的特性，相對效期較短，加上神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗原容易失活，實際使用上，可靠性較低。因此，有待開發對神經元特異性烯醇化酶檢測靈敏度高與可靠性并能降低檢測成本的檢測技術。
發明內容
本發明的一個目的在于針對上述現有技術檢測神經元特異性烯醇化酶所存在的問題，提供一種新的可定量檢測神經元特異性烯醇化酶的試劑盒，提高檢測靈敏度及可靠性，并降低成本，延長有效期。本發明的另一目的在于提供制備神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒的方法。本發明的另一目的在于提供利用所述的試劑盒檢測神經元特異性烯醇化酶的方法。一方面，本發明提供了一種神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑組分
校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑以及化學發光底物；其中所述校準品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到校準品；其中，所述還原劑為含有二硫鍵的化合物，優選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇(2-ME)、二巰基乙醇(DTT)、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、Triton X100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01% O. 5% ；所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的將鏈霉親和素和磁微粒偶聯制得鏈霉親和素磁微粒，利用長臂生物素標記神經元特異性烯醇化酶捕獲抗體制得生物素化抗體，然后將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定，制得磁分離試劑；所述酶反應物包括堿性磷酸酶標記的神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體；所述穩定增強劑包括抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物，該多組分免疫復合物是按照以下方法制備得到的新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按I : 1.5 2.5 0.4 O. 6的體積比混合，加入硫酸銨沉淀過夜,離心’去上清,將沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，70 75°C放置O. 5 2小時，干燥，制得抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物；所述化學發光底物為經緩沖液稀釋的APS-5化學發光底物。根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒還可進一步包括質控品，質控品的配制同標準品。具體地，該質控品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到質控品；其中， 所述還 原劑為含有二硫鍵的化合物，優選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、三(2-甲酰乙基)瞵鹽酸鹽、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、TritonX 100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01 % O. 5%。根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒中，所述校準品是按照以下方法配制得到的(如包含質控品，質控品的具體配制也可按照該方法進行)將神經元特異性烯醇化酶抗原溶解于含5mM 80mM 二硫蘇糖醇的PBS pH7. 2緩沖液中至O. 5mg/ml, 15分鐘后,加入終濃度為ImM賴氨酸反應5 120分鐘；將上述反應物，按不同濃度用含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液稀釋成不同濃度點，并定標，得到校準品；所述含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液組分為磷酸二氫鈉 50mM，氯化鈉 75mM，Tween 20 O. 02%,Triton XlOO O. 03%，蔗糖 I%，酪蛋白 O. 15%，牛血清白蛋白3%，Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉pH 6.8。根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒中，所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的磁性微粒與鏈霉親和素的偶聯取磁微粒，加入MES緩沖液中，加入su lfo-NHS,EDC,反應，之后去上清，洗滌，再加入鏈霉親和素反應過夜，制得鏈霉親和素磁微粒；更具體的操作可以是取250μ1 5%的磁微粒；用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；去上清后加入 20mM MES ρΗ6· O 緩沖液 400 μ 1，80mg/ml 的 sulfo-NHS 5 100 μ 1，25mg/ml EDC5 100 μ 1，反應30分鐘；去上清，用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；加入2mg/ml鏈霉親和素150 1000 μ I反應過夜；長臂生物素標記神經元特異性烯醇化酶捕獲抗體將神經元特異性烯醇化酶捕獲抗體透析至PBS ρΗ7. 2緩沖液中，濃縮至2 10mg/ml，得抗體溶液；將Biotin-LC-LC-NHS溶于PBS ρΗ7· 2至5mg/ml得Biotin-LC-LC-NHS溶液；按摩爾比I : 5 I : 100的比例在抗體溶液中加入Biotin-LC-LC-NHS溶液，反應過夜；次日，透析至PBS pH7. 2緩沖液中，得生物素化抗體；生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定將鏈霉親和素磁微粒用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至0. 05%，每毫升加入用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至0. 5 20 μ g/ml的生物素化抗體I毫升，反應4小時；加入含0. 03% TritonXlOOU %蔗糖、5%聚乙二醇6000的PBS pH7. 2緩沖液5毫升；濃縮并真空干燥；再用含0. 15%酪蛋白、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 2% Tween20、0. 02% Proclin300的PBS ρΗ7· 2緩沖液復溶；制得磁分離試劑。
根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒中，所述酶反應物是按照以下方法配制得到的堿性磷酸酶標記神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體將堿性磷酸酶透析至PBSpH7. 2緩沖液中；將神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體透析至PBS pH6. 8緩沖液中；在堿性磷酸酶溶液中加入預先用二甲基亞砜溶解的SMCC溶液，反應5分鐘后透析至PBS pH7. 2緩沖液，得活化的堿性磷酸酶溶液；在示蹤抗體溶液中加入預先用的用PBS pH6. 8緩沖液溶解的2-IT溶液,反應15分鐘后,透析至PBS pH7. 2緩沖液,得活化的示蹤抗體溶液；將活化的堿性磷酸酶溶液和活化的示蹤抗體溶液混合，反應過夜，得堿性磷酸酶標記的神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體；將上述堿性磷酸酶標記的神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體稀釋至如下組分的緩沖液中磷酸二氫鈉50mM、氯化鈉75mM、Tween 20 O. 02%、蔗糖I %、酪蛋白O. 15%、牛血清白蛋白O. 5%、Proclin 300 O. 02%、氫氧化鈉pH 6. 8，制得所述酶反應物。根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒·中，所述穩定增強劑是按照以下方法配制得到的制備抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物將新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按I : 2 : O. 5的體積比混合；加入終濃度為57%的飽和硫酸銨，4攝氏度過夜；次日將處理后的混合血清離心，去上清，將沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，放置于溫箱中，72°C放置I小時；用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至50mg/ml，分裝后冷凍干燥；按如下配方配制穩定增強劑磷酸二氫鈉50禮，氯化鈉75禮，三乙醇胺2%，多組分免疫復合物6 μ g/ml，酪蛋白O. 15%，牛血清白蛋白O. 5% ,Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉 pH 6.8。根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒中，所述化學發光底物是按照以下方法配制得到的按I : 4 10的比例將APS-5化學發光底物稀釋至下列組分的緩沖液中三乙醇胺2 %，二乙醇胺0.75%，CTAB2 %，N，N- 二甲二叮呢硝酸鹽0.3%，牛血清白蛋白O. 15 %，BronidoxO. 5%,鹽酸 ρΗ9· 5。根據本發明的具體實施方案，本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，還進一步包括清洗液。該清洗液主要是用于在檢測過程中清洗與磁分離試劑反應后的樣品，清洗液的具體組分可以參照所屬領域的常規操作進行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、Tween 20、Proclin300的混合溶液,在試劑盒制品中可以濃縮清洗液的形式存在,檢測時適當稀釋后使用。另一方面，本發明還提供了所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒的制備方法，該方法包括步驟分別配制校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、以及化學發光底物；各試劑組分的配制參見前面的記載，此處不再贅述；將校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、化學發光底物等各試劑組分獨立地置于包裝容器內，得到神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒。另一方面，本發明還提供了利用所述的試劑盒定量檢測神經元特異性烯醇化酶的方法，該方法包括步驟
-分別加30μ I神經元特異性烯醇化酶標準品、待測樣本至對應試管底部；-加45μ I酶反應物至每一試管中；-加45μ I穩定增強劑至每一試管中；-加30μ I磁分離試劑至每一試管中；-用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴15分鐘；-試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
-加清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻；-加200μ I化學發光底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測。本發明的關鍵包括首先，采用還原劑處理神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗原增加其體外穩定性，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖組分中，增加其分散性，防止自身凝集，保持活性，效期至一年以上；其次，將鏈霉親和素和磁微粒偶聯，并長臂生物素標記捕獲抗體，通過長臂生物素標記抗體和偶聯鏈霉親和素的磁微粒的免疫結合，延長抗體在磁微粒上的臂展和正確定向，大大提高了免疫固相的應用性能，整體上提高了試劑盒的靈敏度；并且采用了優化的固定化方法，使磁分離組分穩定性良好，效期可至一年以上；進一步，本發明采用不同種屬血清球蛋白和少量白蛋白的提取，以及對提取組分和牛血清白蛋白之間相互熱聚合，制備多組分免疫復合物，通過含免疫復合物的特別組分體系可解決腫瘤標志物夾心法檢測中異嗜性抗體干擾的問題，提高了終產品的特異性；更進一步，本發明優選采用異官能團的兩步活化方法，分別活化抗體和堿性磷酸酶的氨基位點，再通過硫基的結合將活化的堿性磷酸酶和活化的抗體結合，結合效率優異，自身交聯極低，提高了最終試劑盒的靈敏度和特異性性能；此外，在化學發光底物方面，本發明采用了靈敏度高和平臺穩定期長的APS-5底物，并進一步優化了化學發光增強體系，保證了終產品的信號靈敏度高和穩定性好、變異小。本發明的試劑盒中未詳細提及的試劑組分(例如清洗液、一些必要的緩沖液等)、試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨立包裝容器等均可以按照所屬領域的常規操作進行，符合相關行業規定即可。本發明的方法中未詳細提及的操作步驟也可參照所屬領域的常規操作進行，例如，在檢測前，可將各試劑放至室溫(18 25V )，加樣前充分混勻；所用檢測儀器設備例如化學發光類測定儀的使用按照說明書操作進行。本發明中，未特別注明單位的比例與含量，固體組分為質量比例與含量，液體組分為體積比例與含量。本發明的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，具有以下有益效果利用本發明的試劑盒定量檢測神經元特異性烯醇化酶，樣本和試劑一次加入，SP方便手動操作也利于提高全自動操作效率的神經元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒分離化學發光免疫測定；各試劑組分包括標準品、質控品、磁分離試劑、化學發光底物等穩定性良好，效期可至一年以上；檢測靈敏度高，特異性能好、變異小。在本發明中，經過大量實驗的工藝優化，得到完善統一工藝，并嚴格按照標準生產操作規程和質量控制規程進行生產。用戶僅需按照操作說明進行規范操作，就可得到可靠的結果。目前該試劑盒已獲得國家食品藥品監督管理局診斷試劑三類注冊證，在臨床研究中與國外進口試劑的符合相關性高達95%以上，且費用僅為其1/3。
圖I是神經元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒化學發光檢測試劑盒標準曲線圖。圖2是神經元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒化學發光檢測試劑盒正常值分布的直方圖。圖3是神經元特異性烯醇化酶(NSE)磁微粒化學發光檢測試劑盒與進口試劑的性能對比。·
具體實施例方式為了更清楚地理解本發明，現參照下列實施例及附圖進一步描述本發明。實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發明。實施例中所用各試劑材料均可商購獲得，所用各儀器設備也是所屬領域的現有儀器設備，未注明具體條件的實驗方法為所屬領域熟知的常規方法和常規條件，或按照制造商所建議的條件。實施例I本發明中，所述的捕獲抗體為能與人體內神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗原特異結合的單克隆抗體，所述的示蹤抗體為能與神經元特異性烯醇化酶抗原特異結合的單克隆抗體。捕獲抗體和示蹤抗體除能與神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗原特異性結合外，配對使用時可與抗原形成“三明治”夾心結構。I、本實施例所用的神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗原采購自天健生物制藥(天津)有限公司，本實施例所用的神經元特異性烯醇化酶(NSE)捕獲抗體和示蹤抗體采購自天健生物制藥(天津)有限公司。本實施例中所述的各種緩沖液的配方如下PBS ρΗ7· 2緩沖液
試劑廠商終濃度 IOOOml試劑用量~
憐酸二氧納 Sigma5OmM 6. Og
氯化納Sigma75mM 4. 39g
4M 氫氧化納 SigmaPH 7.2 25mlPBS ρΗ6· 8緩沖液
權利要求
1.一種神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑組分 校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑以及化學發光底物； 其中 所述校準品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到校準品；其中，所述還原劑為含有二硫鍵的化合物，優選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01% O. 5% ； 所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的將鏈霉親和素和磁微粒偶聯制得鏈霉親和素磁微粒，利用長臂生物素標記神經元特異性烯醇化酶捕獲抗體制得生物素化抗體，然后將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定，制得磁分離試劑； 所述酶反應物包括堿性磷酸酶標記的神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體； 所述穩定增強劑包括抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物，該多組分免疫復合物是按照以下方法制備得到的新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按I : I. 5 2.5 : O. 4 O. 6的體積比混合,加入硫酸銨沉淀過夜,離心，去上清,將沉淀溶于含O. 5 %牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，70 75°C放置O. 5 2小時，干燥，制得抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物； 所述化學發光底物為經緩沖液稀釋的APS-5化學發光底物。
2.根據權利要求I所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，該試劑盒還包括質控品，該質控品是按照以下方法配制得到的采用還原劑溶液處理神經元特異性烯醇化酶抗原，并稀釋至含非離子表面活性劑的蛋白緩沖液中配制得到質控品；其中，所述還原劑為含有二硫鍵的化合物，優選地，該還原劑選自二硫蘇糖醇、二巰基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽、賴氨酸中的一種或多種，所述還原劑溶液中還原劑的濃度為5mM 80mM ;所述非離子表面活性劑選自Tween 20、Triton X 100、Bronidox中的一種或多種，非離子表面活性劑在蛋白緩沖液中的濃度為O. 01% O. 5%。
3.根據權利要求I或2所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，其中，所述校準品是按照以下方法配制得到的 將神經元特異性烯醇化酶抗原溶解于含5mM 80mM 二硫蘇糖醇的PBS pH7. 2緩沖液中至O. 5mg/ml, 15分鐘后，加入終濃度為ImM賴氨酸反應5 120分鐘； 將上述反應物，按不同濃度用含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液稀釋成不同濃度點，并定標，得到校準品；所述含非離子表面活性劑的PBS蛋白緩沖液組分為磷酸二氫鈉50mM，氯化鈉 75mM，Tween 200. 02%, Triton XlOO O. 03%，蔗糖 I %，酪蛋白 O. 15%，牛血清白蛋白 3%，Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉 pH 6.8。
4.根據權利要求I或2所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，其中，所述磁分離試劑是按照以下方法制備得到的 磁性微粒與鏈霉親和素的偶聯取磁微粒，加入MES緩沖液中，加入sulfo-NHS、EDC，反應，之后去上清，洗滌，再加入鏈霉親和素反應過夜，制得鏈霉親和素磁微粒；更具體的操作可以是取250 μ I 5%的磁微粒；用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；去上清后加入20mM MES卩冊.0緩沖液40(^ l,80mg/ml 的 sulfo-NHS 5 100 μ l，25mg/ml EDC5 100 μ I，反應 30分鐘；去上清，用20mM MES pH6. O緩沖液洗滌；加入2mg/ml鏈霉親和素150 1000 μ I反應過夜； 長臂生物素標記神經元特異性烯醇化酶捕獲抗體將神經元特異性烯醇化酶捕獲抗體透析至PBS ρΗ7. 2緩沖液中，濃縮至2 10mg/ml，得抗體溶液；將Biotin-LC-LC-NHS溶于PBS ρΗ7· 2至5mg/ml得Biotin-LC-LC-NHS溶液；按摩爾比I : 5 I : 100的比例在抗體溶液中加入Biotin-LC-LC-NHS溶液，反應過夜；次日，透析至PBS pH7. 2緩沖液中，得生物素化抗體； 生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定將鏈霉親和素磁微粒用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至O. 05%，每毫升加入用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至O. 5 20 μ g/ml的生物素化抗體I毫升，反應4小時；加入含O. 03% TritonX100、l%蔗糖、5%聚乙二醇6000的PBS pH7. 2緩沖液5毫升；濃縮并真空干燥；再用含O. 15%酪蛋白、O. 5%的牛血清白蛋白、O. 2%Tween20、0. 02% Proclin300的PBS pH7. 2緩沖液復溶；制得磁分離試劑。
5.根據權利要求I或2所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，其中，所述酶反應物是按照以下方法配制得到的 堿性磷酸酶標記神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體將堿性磷酸酶透析至PBS pH7. 2緩沖液中；將神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體透析至PBS pH6. 8緩沖液中；在堿性磷酸酶溶液中加入預先用二甲基亞砜溶解的SMCC溶液，反應5分鐘后透析至PBS pH7. 2緩沖液，得活化的堿性磷酸酶溶液；在示蹤抗體溶液中加入預先用的用PBS pH6. 8緩沖液溶解的2-IT溶液，反應15分鐘后,透析至PBS pH7. 2緩沖液,得活化的示蹤抗體溶液；將活化的堿性磷酸酶溶液和活化的示蹤抗體溶液混合，反應過夜，得堿性磷酸酶標記的神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體； 將上述堿性磷酸酶標記的神經元特異性烯醇化酶示蹤抗體稀釋至如下組分的緩沖液中磷酸二氫鈉50mM、氯化鈉75mM、Tween 20 O. 02%、蔗糖1%、酪蛋白O. 15%、牛血清白蛋S O. 5%, Proclin 300 O. 02%、氫氧化鈉pH 6. 8，制得所述酶反應物。
6.根據權利要求I或2所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，其中，所述穩定增強劑是按照以下方法配制得到的 制備抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物將新生牛血清、小鼠血清、綿羊血清按1:2: O. 5的體積比混合；加入終濃度為57%的飽和硫酸銨，4攝氏度過夜；次日將處理后的混合血清離心,去上清,將沉淀溶于含O. 5%牛血清白蛋白的PBS pH7. 2緩沖液中，放置于溫箱中，72°C放置I小時；用PBS pH7. 2緩沖液稀釋至50mg/ml，分裝后冷凍干燥； 按如下配方配制穩定增強劑磷酸二氫鈉50禮，氯化鈉75禮，三乙醇胺2%，多組分免疫復合物6 μ g/ml，酪蛋白O. 15%，牛血清白蛋白O. 5% ,Proclin 300 O. 02%，氫氧化鈉pH6. 8。
7.根據權利要求I或2所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，其中，所述化學發光底物是按照以下方法配制得到的 按I : 4 10的比例將APS-5化學發光底物稀釋至下列組分的緩沖液中三乙醇胺2%，二乙醇胺O. 75%, CTAB2%, N，N-二甲二叮呢硝酸鹽O. 3%，牛血清白蛋白O. 15%,BronidoxO. 5%,鹽酸 ρΗ9· 5。
8.根據權利要求I或2所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒，該試劑盒還包括清洗液。
9.權利要求I 8任一項所述的神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒的制備方法，該方法包括步驟 分別配制校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、以及化學發光底物； 將校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、化學發光底物獨立地置于包裝容器內，得到神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒。
10.利用權利要求I 8任一項所述的試劑盒定量檢測神經元特異性烯醇化酶的方法，該方法包括步驟 -分別加30 μ I神經元特異性烯醇化酶標準品、待測樣本至對應試管底部； -加45 μ I酶反應物至每一試管中； -加45 μ I穩定增強劑至每一試管中； -加30 μ I磁分離試劑至每一試管中； -用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30S后，置37°C水浴15分鐘； -試管連架放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘；緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的試管連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； -加清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻； -加200 μ I化學發光底物溶液至試管中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測。
全文摘要
本發明涉及一種神經元特異性烯醇化酶定量檢測試劑盒及其制備方法與應用，該試劑盒包括校準品、磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑以及化學發光底物；校準品是采用還原劑溶液處理NSE抗原并稀釋至含非離子表面活性劑的緩沖液中制得；磁分離試劑是將生物素化抗體與鏈霉親和素磁微粒免疫固定制得；酶反應物包括堿性磷酸酶標記的NSE示蹤抗體；穩定增強劑包括抗異嗜性抗體干擾的多組分免疫復合物。本發明還涉及該試劑盒的制備方法以及應用該試劑盒定量檢測腫瘤標志物神經元特異性烯醇化酶的方法。試劑盒性能可靠，靈敏度高，線性范圍寬，可配合全自動儀器儀器使用。目前該試劑盒已獲得國家食品藥品監督管理局診斷試劑三類注冊證。
文檔編號G01N33/573GK102914650SQ201210199398
公開日2013年2月6日 申請日期2012年6月14日 優先權日2012年6月14日
發明者劉勁, 呂納新, 周昊, 張小平, 陳 峰, 趙鑫, 宋旭紅, 仲維新 申請人:北京大成生物工程有限公司