專利名稱：納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法
技術領域：
本發明涉及ー種內毒素檢測方法，尤其涉及一種納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法，屬于細 菌內毒素檢測領域。
背景技術：
細菌內毒素為脂多糖，也被稱為脂質體，其是革蘭氏陰性菌細胞外壁的成分，廣泛存在于自然界中，該物質進入人體血液會引起發熱，俗稱熱原反應。由于此類物質可能致人產生嚴重的不良反應，因此在藥物注射劑中需要嚴格控制。細菌內毒素檢測可以分為定性檢測和定量檢測兩類。常規的檢測方法為家兔法，將供試品靜脈注入家兔體內，在規定的時間內觀察體溫的變化情況。該方法干擾因素多，靈敏度差，特別是對退熱作用的藥物或清熱解毒類的注射劑可能還會出現假陰性。藥典中的內毒素檢測均采用鱟試劑法，其中鱟試劑凝膠法是在適宜的條件下(溫度、PH值及無干擾物質)，細菌內毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠；鱟試劑濁度法是依據鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化與內毒素濃度呈線性關系，從而測定內毒素含量。這些方法準備期長，檢測耗時，成本高，不能實現快速、連續、在線檢測。另有些方法的探索性研究較多，還未能形成應用，或者不能克服需添加試劑或使用昂貴儀器等缺點，無法實現對樣品的直接檢測。
發明內容
本發明針對現有技術的缺陷，而提出一種納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法，以降低成本并提高檢測速度。該方法包括如下步驟步驟I :制備系列濃度的內毒素標準溶液，采用納米粒徑分析儀對這些內毒素標準溶液進行粒徑檢測；步驟2 :對檢測所得的粒徑數據與相應內毒素標準溶液的濃度作回歸分析，建立標準曲線ln(d)=k · C+b,式中d為粒徑，C為內毒素濃度，k為校正系數，b為修正系數；步驟3 :根據標準曲線計算出待測樣品中的內毒素含量。所述步驟I中的系列濃度包括至少三個稀釋濃度；所述步驟2中的標準曲線的曲線評價系數大于O. 98。技術效果I、每個樣品的檢測周期在2 5分鐘，大大縮短了內毒素檢測的時間，檢測速度快。2、無需消耗檢測試劑(鱟試劑)，可大幅降低內毒素的檢測成本。3、檢測方法簡便，檢測結果較為準確，可靠性高，適用于注射用水、注射劑半成品及成品中的內毒素含量測定。
具體實施例方式下面對本發明作進ー步說明。由于內毒素的結構一端是疏水的脂鏈，一端是親水的糖鏈，類似表面活性劑的疏水端和親水端。細菌內毒素在水溶液中以團聚的形式存在，團聚分子量在幾千到百萬的范圍內，根據溶液的納米膠粒子的特征，其粒徑大小隨濃度的增加而増大。納米粒徑分析儀是常用的檢測粒徑的儀器，而細菌內毒素分子團的粒徑可以被粒徑分析儀所檢測是我們偶然發現的。本發明方法具體包括如下步驟步驟I :采用參考標準、國際標準、國家標準或工作標準內毒素作為標準內毒素，確定所需的標準內毒素系列濃度，該系列濃度包括至少三個稀釋濃度，制備系列濃度的內毒素標準溶液，采用納米粒徑分析儀對這些內毒素標準溶液進行粒徑檢測。步驟2 :對檢測所得的粒徑數據與相應內毒素標準溶液的濃度作回歸分析，建立標準曲線ln(d)=k*C+b，該標準曲線的曲線評價系數需大于O. 98，式中d為粒徑(単位nm), C為內毒素濃度(單位EU/ml), k為校正系數，b為修正系數。步驟3 :在相同條件下檢測待測樣品溶液中的內毒素粒徑，根據標準曲線計算出待測樣品中的內毒素含量。下面提供本發明的一個實施例I、細菌內毒素標準曲線的建立設備材料a、馬爾文Nano ZS ZEW3600型激光粒徑分析儀；b、細菌內毒素工作標準品(批號150601-201070，規格140EU · Amp—1，中國藥品生物制品檢定所)；c、細菌內毒素檢查用水(批號100130，湛江博康海洋生物有限公司)。方法步驟取工作標準內毒素，使用檢查用水配制成濃度為100EU/ml的內毒素標準溶液，再使用檢查用水逐步稀釋成系列濃度的內毒素標準溶液，系列濃度分別為50EU/ml、10EU/ml、lEU/ml、0. 25EU/ml。打開粒徑分析儀電源，預熱30min以上，將系列內毒素標準溶液按低濃度到高濃度依次加入到檢測池中進行檢測，對所測得的粒徑分布圖中的峰強、峰面積和粒徑分布范圍進行數據模型運算，得到內毒素粒徑的對數In(d)。以ln(d)作為縱坐標Y，以內毒素濃度作為橫坐標X進行回歸分析，線性方程為ln(d)=0. 061C+0. 846，R2 = O. 996，曲線評價系數大于O. 98,標準曲線成立,標準曲線結果如表I所示。 表I
權利要求
1.一種納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法，其特征在于 該方法包括如下步驟 步驟I :制備系列濃度的內毒素標準溶液，采用納米粒徑分析儀對這些內毒素標準溶液進行粒徑檢測； 步驟2 :對檢測所得的粒徑數據與相應內毒素標準溶液的濃度作回歸分析，建立標準曲線ln(d)=k · C+b,式中d為粒徑，C為內毒素濃度，k為校正系數，b為修正系數； 步驟3 :根據標準曲線計算出待測樣品中的內毒素含量。
2.根據權利要求I所述的納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法，其特征在于所述步驟I中的系列濃度包括至少三個稀釋濃度。
3.根據權利要求I所述的納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法，其特征在于所述步驟2中的標準曲線的曲線評價系數大于O. 98。
全文摘要
本發明公開了一種納米粒徑分析儀用于內毒素檢測的方法，屬于細菌內毒素檢測領域。該方法依據內毒素在水溶液中可團聚成納米膠粒的特征，先制備至少三個稀釋濃度的系列內毒素標準溶液，采用納米粒徑分析儀對這些標準溶液進行粒徑檢測，然后對檢測所得的粒徑數據與相應標準溶液的濃度作回歸分析，建立出標準曲線，最后根據該標準曲線以及待測樣品中的內毒素粒徑計算出樣品的內毒素含量。本發明檢測速度快，不消耗檢測試劑，檢測成本低，可靠性高。
文檔編號G01N33/483GK102692494SQ20121019665
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月14日 優先權日2012年6月14日
發明者彭國平, 李紅陽, 鄭云楓 申請人:南京中醫藥大學