檢測自身免疫性肝病相關抗體抗ama-m2型抗體的試劑盒及其檢測方法

專利名稱：檢測自身免疫性肝病相關抗體抗ama-m2型抗體的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，尤其是涉及一種檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，本發明還涉及使用該試劑盒檢測抗AMA-M2型抗體的方法。
背景技術：
自身免疫性肝病(autoimmune liver dise ases)主要包括三種與自身免疫密切相關的、以肝膽損傷為主的疾病自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)和原發性硬化性膽管炎(primarysclerosing cholangitis, PSC)。AIH是一種伴循環自身抗體和高免疫球蛋白血癥、病因未明、呈慢性炎性壞死的肝臟疾病，PBC是以自身免疫介導的肝內膽管損傷、以后呈肝纖維化、最終導致肝功能衰竭為特征的一類病因不明的自身免疫性肝臟疾病，PSC是一種原因不明的慢性綜合征，其特征是肝外和/或肝內膽管彌漫性炎癥及纖維化所引起的慢性膽汁淤積癥。近年來，國際上對自身免疫性肝病基礎與臨床的研究高度重視，并且進展迅速，主要涉及自身免疫性肝病的發病機制、遺傳背景、相關自身抗體及其靶抗原性質、臨床流行病學、臨床診斷及治療和預后等方面。自身免疫性肝病的診斷主要依靠病史、臨床表現、體征和實驗室檢查結果。肝組織病理學檢查被認為是AIH，PBC診斷的“金標準”，但此項檢查臨床應用具有局限性，例如，自身免疫性肝病的肝活檢組織病理學表現特異性不強，非自身免疫性肝病所特有；患者不愿或不適接受此項創傷性檢查；此外，目前多數醫院采用B超引導下細針穿刺取材進行肝組織病理學檢查，此檢查受取材標本局限，是否能取得病變組織，對檢查結果影響很大。盡管如此，肝組織病理學檢查對自身免疫性肝病診斷、鑒別診斷及病變程度的判斷至關重要，仍是診斷的重要標準之一。AIH，PBC早期病變(膽管炎期、慢性膽汁淤積期)屬臨床治療可逆轉期或可部分逆轉期，后期或終末期(肝纖維化/肝硬化期、肝衰竭期)屬臨床治療不可逆轉期，愈后不佳。因此，早期診斷、早期治療尤為重要。自身免疫性肝病發病機制與免疫功能異常密切相關，自身抗體在發病機制中起重要作用。每種自身免疫性肝病都具有特征性自身抗體譜，自身抗體檢測對自身免疫性肝病的診斷、分型及鑒別診斷具有重要意義。近年來，國外對自身免疫性肝病相關自身抗體譜靶抗原性質、臨床診斷應用價值(尤其是無癥狀期的早期診斷)、與疾病臨床特點及活動性的關系等方面研究進展迅速，有關自身抗體譜的研究已引起臨床高度重視，自身抗體檢測已成為自身免疫性肝病臨床診斷的常規檢查項目。近年來，由于臨床經驗的積累和實驗室診斷技術的進步，發現我國人群中自身免疫性肝病患者逐漸增多。國內有關自身免疫性肝病的發病機制、相關自身抗體靶抗原、病例報道、臨床病例討論和臨床病理分析的文章逐漸增多，以上的工作說明自身免疫性肝病在中國并不少見。抗線粒體抗體(AMA)為一組可同線粒體內膜或外膜上多種酶復合物成分相結合的自身抗體的總稱。AMA是一種以線粒體為靶抗原、無種屬和器官特異性的自身抗體，在PBC中的敏感性和特異性都高于90% 95%，已成為診斷PBC (原發性膽汁性肝硬化)的主要檢查項目。PBC早期AMA常為低滴度，隨著病情進展，AMA可逐漸升高，但其滴度高底與疾病嚴重度或預后并不相關。若AMA高滴度陽性，即使無PBC癥狀及生化異常，亦強烈提示為PBC。極少數患者臨床、生化及組織學均符合PBC診斷但AMA陰性，其自然病程及相關的自身免疫狀況和AMA陽性的PBC患者無差異。AMA可分為M1-M9共9個亞型，與PBC密切相關的是M2、M4、M8、M9，其中M2診斷PBC的特異性最高。以線粒體內膜上的2-酮酸脫氫酶復合物為靶抗原的AMA-M2抗體(抗線粒體抗體M2亞型)，是PBC患者的高度特異性自身抗體，敏感性為95% 98%，特異性達97%。有學者認為當AMA-M2亞型抗體高滴度時，確診PBC不再需要肝組織活檢病理證實。臨床上常用間接免疫熒光法(HF)檢測患者中出現的抗AMA-M2抗體，其實驗基質通常為不同靈長類動物的肝臟、胃、腎臟組織冰凍切片，含有完整的抗原譜，但是對間接免疫熒光分析法著染得鑒定具有一定的主觀性，因而對結果的解釋可能在不同時間點、不同觀察者之間、新老組織切片之間存在差異，并且需要熒光顯微鏡等儀器的輔助，在一般的中小醫院 難以開展。所以，目前對抗AMA-M2抗體(抗線粒體M2型抗體)的診斷方法還需進一步改進。

發明內容
本發明的目的在于提供一種檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，使用該試劑盒可以定量和定性檢測抗AMA-M2抗體，從而準確診斷出自身免疫性肝病的類型及嚴重程度，指導醫生用藥；本發明還公開了使用該試劑盒檢測抗AMA-M2型抗體的方法，該方法靈敏度高、特異性強、準確性好，適用于半自動或全自動檢測系統或肉眼判讀。為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案
本發明所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，包括固相載體，酶標二抗工作液，陽性對照品，陰性對照品，校準品，樣品稀釋液，底物和洗滌液，所述固相載體為固定有抗AMA-M2型抗體靶抗原的微孔板、磁微粒或磁球，即將AMA-M2抗體特異性結合的靶抗原作為捕獲抗體結合到相同固相載體上，形成抗原-載體結合物；所述酶標二抗工作液中所用二抗為鼠或羊或兔抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，所用二抗標記物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶，吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。所述樣品稀釋液由濃度小于10%的氯化鈉緩沖液和濃度小于1%的保護蛋白組成。所述保護蛋白為酪蛋白、白蛋白、蛋白胨、明膠、動物血清或人血清。所述祀抗原為天然抗原、重組抗原、合成肽、HepG2細胞、Hep2細胞、Hela細胞或細胞裂解抗原。所述底物為發光底物或顯色底物。所述發光底物為發光底物A和發光底物B，所述發光底物A由O. 2M Tris-HCUO. 15mM Luminol.O. 59mM羥基香豆素、O. 35mM沒食子酸組成；所述發光底物B由O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C組成。本發明試劑盒的檢測方法，包括下述步驟
第一步，將待檢測血清用樣品稀釋液稀釋成血清樣本，分別將陽性對照品、陰性對照品、校準品和血清樣本加入到固相載體中孵育，使待測血清樣本與抗原-載體結合物接觸，使得血清樣本中的AMA-M2抗體(如果存在的話)被捕獲，形成抗體-抗原-載體結合物；如果樣品是血漿時，需要離心后進行檢測；
第二步，樣本反應結束后，棄去反應液，用洗滌液洗板；
第三步，將酶標二抗工作液于第二步洗板后加入固相載體的每一反應孔中，孵育；該步驟可使酶標二抗和上述的抗體-抗原-載體結合物接觸，反應；
第四步，反應結束后，棄去反應液，用洗滌液洗板；
第五步，加入相應的底物(如發光底物或顯色底物)檢測，儀器檢測信號值來定性或定量判斷樣本中被測抗體，或通過免疫層析或免疫滲濾法肉眼或儀器讀取樣本定性或定量結果O本發明的優點在于通過化學發光法或酶標法或金標法或時間分辨法或熒光法可以定量和定性檢測抗AMA-M2抗體，當AMA-M2抗體濃度大于或等于lAU/ml時，可判斷為PBC陽性，病情嚴重度與檢測樣本濃度值正相關，適用于半自動或全自動檢測系統或肉眼判讀結果，從而準確診斷出自身免疫性肝病的類型以及嚴重程度，指導醫生用藥，為病人早期診斷、早期治療提供保障。
具體實施例方式下面分別舉出板式結構試劑盒和磁微粒結構試劑盒，并說明其檢測使用方法。應該理解的是，下述實施例僅用于例證的目的，絕不僅限制本發明的范圍。實施例I :
本發明檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體(抗線粒體抗體M2亞型)的試劑盒(板式)包括
1、靶抗原-載體結合物的制備將不高于10ug/ml的靶抗原(天然抗原、重組抗原、合成肽、HepG2細胞、H印2細胞、Hela細胞或細胞裂解抗原)100 μ I加入到96孔板中，4°C包被16-24h或37°C包被2h，之后用配制好的(PBST)洗滌液洗滌兩遍；
2、封閉用50-200 μ I 的含 O. 05-0. 5%Tween20, 1_5%BSA，l_5%Casein，1-5% 蛋白胨，5-10%的蔗糖的O. 01-0. IM的磷酸緩沖液，4°C封閉16_24h或37°C封閉2h，之后甩去多余的緩沖液，置于干燥的環境中晾干，晾干后，密封于2-8°C保存；
3、校準品、陽性對照品和陰性對照品的配制取臨床上定值的高值樣本，用校準品稀釋液(PBS+3%BSA)按不低于I :50倍稀釋，取線性較好的4 8個點作為校準品，選擇不低于2AU/ml濃度的校準品作為陽性對照品，選擇OAU/ml濃度的校準品作為陰性對照品；
4、酶標二抗工作液的配制所述酶標二抗工作液中所用二抗為抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，用酶稀釋液(PBS+l%Casein)按不高于1:200倍稀釋制備酶標二抗工作液；所用二抗標記物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。5、組裝將上述96孔抗原包被板一塊，校準品6X1. Oml,陰性對照1X1. Oml,陽性對照1X1. Oml,酶標二抗工作液IX 12ml，樣品稀釋液(PBS+3%BSA) IX 100ml，濃縮洗液20X50ml(PBST),發光底物Α(0· 2Μ Tris-HCl.O. 15mM Luminol、0· 59mM羥基香豆素、O. 35mM沒食子酸)和發光底物B (O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C)各lX7ml組裝在一起形成完整的試劑盒。檢測方法測試樣本的處理
血清使用不含熱原和內毒素的試管取靜脈血2-5ml,操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉/min離心IOmin,將血清和紅細胞迅速小心的分離,血清標本保存于2-8 V，在24h內不能測試的標本應放在-20 V冰箱內保存，嚴重溶血、有絮狀物的血清標本會影響測試結果。血漿使用EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝，3000轉/min離心30min取上清，保存方法
同血清。I、加樣用樣品稀釋液(含有BSA的Tris-NaCl緩沖液)按照1:100稀釋待檢樣本，充分混勻后各加入100 μ I不同濃度(I 100AU/ml)的校準品和100 μ I稀釋后的待檢樣本到靶抗原-載體結合物中，放入37°C恒溫箱中孵育30min ； 2、洗板樣本反應結束后，棄去反應液，用配制好的洗液手工或在自動洗板機洗滌6XImin ；
3、加入酶標二抗辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG抗體1:500倍稀釋，向每一反應孔中加入100 μ 1，放入37°C恒溫箱中孵育30min ；
4、洗板樣本反應結束后，棄去反應液，用配制好的洗液手工或在自動洗板機洗滌6XImin ；
5、加入底物檢測向每一反應孔中加入配制好的發光底物A和B各50μ1，震蕩混勻后，室溫5min用發光儀檢測結果，以校準品濃度為橫坐標，對應發光值為縱坐標，繪制出校準品線性回歸曲線，按曲線方程計算待測樣本的濃度值。當計算出的濃度值小于lAU/ml時，標本呈陰性，說明診斷PBC的可能性比較小。當計算出的濃度值大于或等于lAU/ml時，標本呈陽性，說明診斷PBC的可能性比較大。實施例2
本發明所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型(抗線粒體抗體M2亞型)抗體的試劑盒(磁微粒)包括
1、革巴抗原-載體結合物的制備取IOmg磁微粒,用磷酸鹽緩沖液洗漆5遍,加入不低于
O.15mlEDC或(和)NHS或戊二醛(和)活化劑活化2h后，洗滌3遍，之后加入O. Img的靶抗原，室溫震蕩包被2h ；
2、封閉用Iml 的含 O. 05-0. 5%Tween20,1_5%BSA，l_5%Casein，1-5% 蛋白胨，5-10% 的蔗糖的O. 01-0. IM的磷酸緩沖液，室溫振蕩封閉lOmin，連續封閉四次，之后加入2ml封閉液于2-8°C保存；
3、校準品、陽性對照品和陰性對照品的配制取臨床上定值的高值樣本，用校準品稀釋液(PBS+3%BSA)按不低于I :50倍稀釋，取線性較好的4 8個點作為校準品，選擇不低于2AU/ml濃度的校準品作為陽性對照品，選擇OAU/ml濃度的校準品作為陰性對照品；
4、酶標二抗工作液的配制所述酶標二抗工作液中所用二抗為抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，用酶稀釋液(PBS+l%Casein)按不高于1:200倍稀釋制備酶標二抗工作液；所用二抗標記物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶，吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。5、試劑盒的組裝將2ml祀抗原_磁微粒結合物，校準品6X1. Oml>陰性對照I X I. Oml、陽性對照I X I. Oml、樣品稀釋液I X IOOml、濃縮洗液20 X 50ml (PBST)、發光底物A (O. 2M Tris-HCl、0. 15mM Luminol、0. 59mM羥基香豆素、0. 35mM沒食子酸)和發光底物B (O. 85mM 氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM 維生素 C)各 I X 7ml 組裝在一起即可。檢測方法
測試樣本的處理同實施例I。I、加樣用樣品稀釋液(含有BSA的Tris-NaCl緩沖液)按照1:100稀釋待檢樣本，之后各加入100 μ I不同濃度(I 100AU/ml)的校準品和100 μ I稀釋后的待檢樣本到反應孔中，之后每個反應孔中各加入20 μ I靶抗原-磁微粒結合物，放入37 °C恒溫箱中孵育15min ；
2、洗板樣本反應結束后，棄去反應液，用配制好的洗液手工或在自動洗板機洗滌6XImin ；· 3、加入酶標二抗辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG抗體1:500倍稀釋，向每一反應孔中加入100 μ 1，放入37°C恒溫箱中孵育15min ；
4、洗板樣本反應結束后，棄去反應液，用配制好的洗液手工或在自動洗板機洗滌6XImin ；
5、加入底物檢測向每一反應孔中加入配制好的發光底物A和B各50μ1，震蕩混勻后，室溫5min用發光儀檢測結果，以校準品濃度為橫坐標，對應發光值為縱坐標，繪制出校準品線性回歸曲線，按曲線方程計算待測樣本的濃度值。當計算出的濃度值小于lAU/ml時，標本呈陰性，說明診斷PBC的可能性比較小。當計算出的濃度值大于或等于lAU/ml時，標本呈陽性，說明診斷PBC的可能性比較大。
權利要求
1.一種檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，包括固相載體,酶標二抗工作液，陽性對照品，陰性對照品，樣品稀釋液，底物和洗滌液，其特征在于所述固相載體為固定有抗AMA-M2型抗體靶抗原的微孔板、磁微粒或磁球；所述酶標二抗工作液中所用二抗為鼠或兔或羊抗人IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA，所用二抗標記物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶，吖啶酯、異魯米諾或稀土元素。
2.根據權利要求I所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，其特征在于所述樣品稀釋液由濃度小于10%的氯化鈉緩沖液和小于1%保護蛋白組成。
3.根據權利要求2所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，其特征在于所述保護蛋白為酪蛋白、白蛋白、蛋白胨、明膠、動物血清或人血清。
4.根據權利要求I所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，其特征在于所述IE抗原為天然抗原、重組抗原、合成肽、HepG2細胞、Hep2細胞、Hela細胞或細胞裂解抗原。
5.根據權利要求I所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，其特征在于所述底物為發光底物或顯色底物。
6.根據權利要求5所述的檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，其特征在于所述發光底物為發光底物A和發光底物B，所述發光底物A由O. 2M Tris-HCl、O. 15mM Luminol、0. 59mM羥基香豆素、O. 35mM沒食子酸組成；所述發光底物B由O. 85mM氨基酸氧化酶、O. 8%Tween 20、O. 5mM DTPA、0. 12mM 維生素 C 組成。
7.如權利要求I所述試劑盒的檢測方法，其特征在于包括下述步驟 第一步，將待檢測血清用樣品稀釋液稀釋成血清樣本，分別將陽性對照品、陰性對照品、校準品和血清樣本加入到固相載體中孵育； 第二步，樣本反應結束后，棄去反應液，用洗滌液洗板； 第三步，將酶標二抗工作液加入每一反應孔中，孵育； 第四步，反應結束后，棄去反應液，用洗滌液洗板； 第五步，加入底物檢測，儀器檢測信號值來定性或定量判斷樣本中被測抗體，或通過免疫層析或免疫滲濾法肉眼或儀器讀取樣本定性或定量結果。
全文摘要
本發明公開了一種檢測自身免疫性肝病相關抗體抗AMA-M2型抗體的試劑盒，本發明還公開了使用該試劑盒定量和定性檢測抗AMA-M2抗體的方法。通過使樣品與連有標記物的IgG或/和抗人IgM或/和抗人IgA與檢測抗體所對應的特異性抗原結合，加入發光系統或顯色系統或激發光系統底物后，讀取待檢樣品信號值，計算定量或定性結果或通過免疫層析或免疫滲濾法肉眼或儀器讀取樣本定量或定性結果，從而準確診斷出自身免疫性肝病的類型及嚴重程度，指導醫生用藥，該方法具有靈敏度高、特異性強、準確性好，適用于半自動或全自動檢測系統或肉眼判讀。
文檔編號G01N21/76GK102955028SQ20121019022
公開日2013年3月6日 申請日期2012年6月11日 優先權日2012年6月11日
發明者吳學煒, 何麗, 張學東, 于林, 楊皓宇, 魯清月, 付光宇, 馬建軍, 劉功成, 項立紅, 渠海, 李桂林 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司