專利名稱：肺結核中醫證候分型特征蛋白的質譜模型及其制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于質譜檢測技術領域。一種通過能與蛋白質結合的磁珠基質去捕獲生物標志，并用有定量控制的質譜分析來檢測肺結核中醫證候生物標志。在此提及的此項發明涉及蛋白質檢測領域，為ー種新的非侵入性的體外質譜檢測方法。本發明可以應用到已經脫離人體的血清中的肺結核中醫證候生物標志組合的檢測方法或試劑盒。
背景技術：
肺結核病是由結核分枝桿菌感染肺部引起的慢性傳染病，中醫稱為“肺癆”、“癆瘵。中西醫結合治療耐藥肺結核和疑難重癥肺結核具有獨特的優勢(劉艷科等，中醫藥治療肺結核的現狀及展望，中醫藥導報，2010)。中西醫結合治療肺結核通過應用西藥直接殺滅結核菌和中醫調理相結合，達到抗癆，促進病灶吸收，空洞閉合，提高機體免疫カ的療效。通過“辯證”中醫將肺結核分為“肺陰虛、“陰虛火旺”、“氣陰兩虛”等不同證候，然后依據“補虛培元，抗癆殺蟲”的治療原則，針對各種證候分別有“滋陰潤肺”、“滋陰降火”、“滋陰補陽”、“益氣養明”等相應的對證治療措施，井隨著證候的變化與病程的轉歸，調整方劑，提高療效。但由于中醫治療肺結核技術存在的辨證標準化問題，嚴重限制了中醫治療肺結核的臨床應用。中醫診斷治療的精髓是“辨證施治”，正確辨證是正確治療的必要前提。目前臨床上對肺結核辯證標準不一，肺結核證候的表述、分型方法仍比較混亂，主觀隨機性較大。即使采用同一種證候分型方法，證候的拿捏把握依賴臨證者個人的學識、經驗和悟性，不可避免的影響辨證的準確性、可靠性和可重復性，嚴重影響臨床治療效果。若不能將證候標準統一，辨證依據科學量化，將嚴重限制中醫治療肺結核的臨床應用。解決辯證標準量化問題的途徑，除了運用統計學、信息學和循證醫學等交叉學科的標準化嘗試，更深層次的應從證候的生物學本質依據著手，在此基礎上發展能體現證候生物學本質的新型現代診斷技術來輔助中醫診療，最終形成規范化、標準化和量化的中醫辨證施治技術，這是當前中醫證候研究的發展趨勢。證候是生命活動異常的表現特征，證候及其變化的宏觀表現對應著生命體內復雜的微觀分子的變化。其中尤為重要的是生命活動的主要功能載體-蛋白質。如采用雙向電泳(2D)技木，部分“腎虛證”和“脾虛證”等中醫證候對應的標志性蛋白已相繼被鑒定出來。相對于敏感性較差，蛋白質信息涵蓋度較低的2D技術，表面加強激光解析電離飛行時1、司質i普技術(SELDI_T0F—MS, Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time ofFlight-Mass Spectrometry)技術已成為重要的蛋白質組學質譜研究技術。納米磁珠結合SELDI-TOF-MS技術進ー步提高了質譜檢測的靈敏性和穩定性。SELDI-T0F-MS技術不同于只能針對單一指標進行分析的傳統檢驗技術，通過對蛋白質動態、全景的分析，探索疾病不同階段最微小的指標和征兆，可以將患者的血清蛋白質成分的變化記錄下來，顯示血清中各種蛋白的分子量、含量等豐富信息，既著重宏觀整體，又注意局部微觀變化，其指導思想和研究方法與中醫“宏觀層次上的微觀辨證”相符，也符合中醫辨證“整體性”、“時點性”、“動態性”和“趨向性”的特點。將其用于中醫證候研究，對傳統中醫證候分型技術的標準量化可起到良好的輔助作用。通過比較不同證候血清蛋白質的差異，可以發現各證候之間對應的特定血清蛋白質表達差異，并以此作為證候分型診斷的生物學依據(何磊等，基于血清蛋白組學的慢性腎衰中醫不同證型的研究，遼寧中醫雜志，2010)。但國內迄今尚無采用磁珠與質譜技術獲得肺結核中醫證候血清特征蛋白的報道。
發明內容
本發明的目的是為克服目前肺結核中醫證候辯證技術未科學量化的不足，提供一種檢測肺結核中醫證候分型血清特征蛋白的質譜模型從血清中篩選出5個蛋白作為特征蛋白，根據選取的5個蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者鑒別的血清特征蛋白質譜模型；所述的特異蛋白質質荷比m/z值和臨界峰值均值M分別為m/z=3961. 7，M=3. 37 ；m/z=4679. 7，M=L 34 ；m/ζ=5646· 4，Μ=2· 01 ；m/z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，Μ=8· 35 ;分子量(m/z)誤差
<O. 01%,臨界峰值均值M的CV〈5-10%。本發明的另ー個目的是提供檢測肺結核中醫證候血清蛋白質譜模型的制備方法，通過以下步驟實現(1)4°C條件下2小時內收集血清標本，進行_80°C低溫冷凍備用；所述標本為參照國家中醫藥管理局制定的《中醫病證診斷療效標準》分型的肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者的血清標本。(2)采用WCX弱陽離子交換磁珠對所述肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者的血清標本的帶正電荷的蛋白進行吸附，吸附時血清標本與活化后的WCX弱陽離子交換磁珠混合置于磁性處理器上孵育，帶正電荷的蛋白吸附于磁珠表面，而未吸附的蛋白被棄去；(3)用激光解吸/電離飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)對結合在負離子表面的WCX磁珠上的標本血清蛋白進行讀取，設定最高檢測分子量為50kDa，優化分子量范圍1000-15000Da，最佳聚集中心8000Da，數據采集參數范圍20-80，激光強度150-180，檢測敏感度為7-8，收集總數為130次，由此獲得蛋白質譜圖譜；(4)定量性質譜調控在毎次實驗數據收集前，用All-in-one標準蛋白及質譜的標準化質控O型血清校正儀器，用2746 土 IDa、5909 土 lDa、6634土 IDa標準峰為質譜內標定性(分子量)質控標準，使蛋白質分子量誤差〈O. 01%和臨界峰值均值M的CV〈5 10%，從而獲得精確的蛋白質譜圖譜數據；(5)對所得數據進行單因素方差分析檢驗三組間的差異，采用最小顯著差異法檢驗組與組間的差別，根據肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清之間蛋白峰值的差異，初歩分析篩選得到74個差異多肽蛋白(認定P值小于O. 001時具有統計學意義)。(6)選取5個特征蛋白，以各蛋白質峰的質荷比m/z值及該蛋白的臨界峰值均值M構成于檢測肺結核中醫證候分型蛋白質譜模型；其中所屬的特異蛋白質質荷比m/z和臨界峰值均值 M 分別為 m/z=3961. 7，Μ=3· 37 ；m/z=4679. 7，Μ=1· 34 ；m/z=5646. 4，Μ=2· 01 ；m/ z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，M=8. 35。
利用該質譜模型，將受檢者血清中相應蛋白質的質荷比及該蛋白的臨界峰值均值M與本發明質譜模型逐一進行對比分析，就可用于肺結核中醫證候的分型檢驗。利用該質譜模型，經臨床試用及雙盲測試，其鑒別肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者的準確性分別為 76. 2%, 70. 8%, 80. 0%。本發明所述的蛋白質譜模型可在評估肺結核中醫分型、病程監控中應用。本發明與其他肺結核中醫證候分型的檢測方法比較，具有以下優點(I)本發明采用肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核具有差異的多個特征蛋白組合起來進行對肺結核血清的檢測，提供的質譜模型是肺結核中醫證候分型的新方法和新途徑，并為進一步發現的肺結核中醫證候生物標志提供了基礎；(2)與以往傳統的中醫舌診和脈診證候分型相比，本發明是ー種在蛋白組學水平上的檢測，對肺結核中醫證候分型提供了新標準； (3)本發明質譜模型的構建方法設計精確及合理可行、為規范和建立標準化的肺結核證候分型方法、指導肺結核中醫臨床用藥、監測肺結核病程變化、提高肺結核的臨床治愈提供了ー種新的評估方法；(4)利用本發明用雙盲法分析，其鑒別肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者的準確性分別為76. 2%，70. 8%，80. 0%。因此本發明可實現對肺結核證候進行科學化的分型。說明書附I肺結核中醫證候鑒別的質譜模型，圖中m/z表示特異蛋白的質荷比。圖2肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清中3961. 7m/z差異蛋白峰的原始質譜圖譜，圖中m/z表示特異蛋白的質荷比。圖3肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清中4679. 7m/z差異蛋白峰的原始質譜圖譜，圖中m/z表示特異蛋白的質荷比。圖4肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清中5646. 4m/z差異蛋白峰的原始質譜圖譜，圖中m/z表示特異蛋白的質荷比。圖5肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清中8891. 2m/z差異蛋白峰的原始質譜圖譜，圖中m/z表示特異蛋白的質荷比。圖6肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清中9416. 7m/z差異蛋白峰的原始質譜圖譜，圖中m/z表示特異蛋白的質荷比。
具體實施例方式本發明將結合附圖
和具體實施例作進ー步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例I檢測肺結核中醫證候分型血清特征蛋白的質譜模型由于多個特征蛋白組合起來才可將肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核完全分開，故選取上述74個特征蛋白中的任意兩個或兩個以上的蛋白，用生物標志物模型軟件根據各蛋白質峰的質荷比m/z值及該蛋白的臨界峰值均值M，建立了肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核鑒別的血清特征蛋白質譜模型(圖I);所說的特異蛋白質質荷比m/z 和臨界峰值均值分別為 m/z=3961. 7，Μ=3· 37 ；m/z=4679. 7，Μ=1· 34 ；m/z=5646. 4，Μ=2· 01 ；m/z=8891. 2為=3· 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，Μ=8· 35 繪制而成；分子量(m/z)誤差< O. 01%,臨界峰值均值M的CV < 5-10%。建立模型的120份肺結核標本作為節點1，以質荷比4679. 7作為標志蛋白劃分，M值< I. 34的31例標本被劃分為節點2，11值> I. 34的89例標本被劃分為節點3。31例節點2的標本以質荷比3961. 7作為標志蛋白劃分，M值< 3. 37的24例標本被劃分為終節點I (氣陰兩虛證肺結核)，其中23例氣陰兩虛證肺結核被正確檢出，I例肺陰虛證肺結核被誤判”值> 3. 37的7例標本被劃分為終節點2 (肺陰虛證肺結核)，其中6例肺陰虛證肺結核被正確檢出，I例陰虛火旺證肺結核被誤判。89例節點3的標本以質荷比5646. 4作為標志蛋白劃分，1值< 2. 01的54例標本被劃分為節點4 ”值> 2. 01的35例標本被劃分為終節點7 (肺陰虛證肺結核)，其中27例肺陰虛證肺結核被正確檢出，8例陰虛火旺證肺結核被誤判。54例節點4的標本以質荷比8891. 2作為標志蛋白劃分，M值< 3. 09的32例標本被劃分為節點5 ”值> 3. 09的22例標本被劃分為終節點6 (陰虛火旺證肺結核)，其中19例陰虛火旺證肺結核被正確檢出，3例肺陰虛證肺結核被誤判。32例節點5的標本以質荷比8891. 2作為標志蛋白劃分，1值< I. 01的11例標本被劃分為終節點3 (氣陰兩虛證肺結核)，其中6例氣陰兩虛證肺結核被正確檢出，3例肺陰虛證肺結核被誤判，2例陰虛火旺證肺結核被誤判”值> I. 01的21例標本被劃分為節點6。21例節點2的標本以質荷比9416. 7作為標志蛋白劃分，M值< 8. 35的16例標本被劃分為終節點4 (陰虛火旺證肺結核)，其中10例陰虛火旺證肺結核被正確檢出，6例肺陰虛證肺結核被誤判”值> 8. 35的5例標本被劃分為終節點5 (肺陰虛證肺結核)，其中4例肺陰虛證肺結核被正確檢出，I例氣陰兩虛證肺結核被誤判。依據5個特征蛋白，逐步區分肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者。建立模型的120例肺結核患者中，肺陰虛證肺結核50例患者中37例被正確檢出，13例被誤判；陰虛火旺證肺結核40例患者中29例被正確檢出，11例被誤判；氣陰兩虛證肺結核30例患者中29例被正確檢出，I例被誤判。對肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者分型的準確性分別為74. 0%, 72. 5%, 96. 7%。實施例2檢測肺結核中醫證候血清蛋白質譜模型的制備方法180例肺結核患者，平均年齡為43. 8±12. 2 (18-65歲)。肺結核患者無合并肝、腎、代謝自身免疫性疾病、內分泌、血液、神經系統疾病、惡性腫瘤、長期服用免疫抑制劑患者。磁珠操作步驟血清樣品處理取10 μ L血清樣品，加20 μ L U9處理液(9mol/L尿素，2%CHAPS, 1%DTT, 50mmol/L Trist-CL, ph9. 0)，充分混勻，冰浴振蕩 30min 后取出，加入360uL 結合緩沖液(lOOmmol/LNaAc, pH4. O)，立即混勻。磁珠上樣及洗脫將處理好的樣品IOOyL加至已裝好WCX弱陽離子交換磁珠的PCR管中，置磁性處理器上孵育30min，除去液體。加100 μ L磁珠結合緩沖液(50mmol/LNaAc, pH4. 0-4. 3)至已裝好WCX磁珠的PCR管，置磁性處理器上孵育2分鐘，除去液體，重復上述操作2次。力[]10 μ L Elution Buffer 2min,洗脫標本至上清液。取5 μ uL上清液移至另ー個PCR管中，加入5 μ L SPA飽和溶液充分混勻，取I μ L混合溶液加樣到Au或Steel 片上，晾干后上機測量。數據收集將處理好的Au或Steel片置入SELDI-T0F-MS進行蛋白質譜分析。在讀取數據前，用加有all-in-one標準蛋白質的芯片校正質譜儀，使分子誤差< 0.1%。本研究中閱讀儀的主要參數設定為，最高檢測分子量為50kDa，優化分子量范圍1000-15000Da，最佳聚集中心8000Da，數據采集參數范圍20-80，收集總數為130次。軟件中設定讀片程序，以讀取數據。定量性控制及質譜激光能量調控毎次測試前，用質譜的標準化質控血清，標準化質控血清中用于定量的標準峰6634. ODa強度調至50%質譜信號強度的最大值。用2746土 lDa、5909土 lDa、6634土 IDa標準峰為質譜內標定性(分子量)質控標準，使分子量誤差< 0.01%，從而獲得的精確的蛋白質譜圖譜。統計學分析應用軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白質譜圖譜。所有的圖譜都進行了標準化，統一到它們自己全部的離子總數(峰面積的總和)。將標準化質控血清中用于定 量的標準峰6634. ODa強度調至40飛0%信號強度的最大值，并且用顯著的峰進行了校正，而后又進行了 “減少基線”，定義蛋白峰(s/n > 5，最小的峰強度> I. 6)。分析所有l-50kDa之間的蛋白峰，并且仔細檢查了每個相應的峰，計算出峰的平均值M，標準誤差(SD)和變異系數(CV%)。對所得數據進行單因素方差分析檢驗三組間的差異，采用最小顯著差異法檢驗組與組間的差別。肺結核中醫證候檢測多肽蛋白篩選對所得數據進行單因素方差分析檢驗三組間的差異，初歩分析篩選出P < O. 001的肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者有74個差異多肽蛋白，不同峰的分子量(m/z)、P值及F值見表一。表一肺結核證候特征蛋白的表達變化
權利要求
1.一種檢測肺結核中醫證候分型血清特征蛋白的質譜模型，其特征在于從血清中篩選出5個蛋白作為特征蛋白，根據選取的5個蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者鑒別的血清特征蛋白質譜模型，所述的蛋白質質荷比m/z值和臨界峰值均值M分別為m/z=3961. 7, M=3. 37 ；m/z=4679. 7，M=L 34 ；m/z=5646. 4，M=2. Ol ；m/z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，M=8. 35 ;分子量m/z誤差< 0. 01%,臨界峰值均值M的CV〈5_10%。
2.一種檢測肺結核中醫證候分型血清蛋白質譜模型的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現 (1)4°C條件下2小時內收集血清標本，進行_80°C低溫冷凍備用； (2)采用WCX弱陽離子交換磁珠對所述肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者的血清標本的帶正電荷的蛋白進行吸附，吸附時血清標本與活化后的WCX弱陽離子交換磁珠混合置于磁性處理器上孵育，帶正電荷的蛋白吸附于磁珠表面，而未吸附的蛋白被棄去; (3)用激光解吸/電離飛行時間質譜儀，用氮激光儀337nm和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標志后用液相色譜質譜聯用儀對結合在負離子表面的WCX磁珠上的標本血清蛋白進行讀取，設定最高檢測分子量為50kDa，優化分子量，范圍1000-15000Da,最佳聚集中心8000Da，數據采集參數范圍20-80，激光強度150-180，檢測敏感度為7-8，收集總數為130次，由此獲得蛋白質譜圖譜； (4)定量性質譜調控在每次實驗數據收集前，用All-in-one標準蛋白及質譜的標準化質控O型血清校正儀器，用2746 ± IDa、5909 ± IDa、6634 ± IDa標準峰為質譜內標定性質控標準，使蛋白質分子量誤差〈O. 01%和臨界峰值均值M的CV〈5 10%，從而獲得精確的蛋白質譜圖譜數據； (5)對所得數據進行單因素方差分析檢驗三組間的差異，采用最小顯著差異法檢驗組與組間的差別，根據肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者血清之間蛋白峰值的差異，初步分析篩選得到74個差異多肽蛋白，認定P值小于O. 001時具有統計學意義； (6)選取5個特征蛋白，以各蛋白質峰的質荷比m/z值及該蛋白的臨界峰值均值M構成于檢測肺結核中醫證候分型蛋白質譜模型，其中所屬的特異蛋白質質荷比m/z和臨界峰值均值 M 分別為 m/z=3961. 7，Μ=3· 37 ；m/z=4679. 7，Μ=1· 34 ；m/z=5646. 4，Μ=2· 01 ；m/z=8891. 2，M1=S. 09，M2=L 01 ；m/z=9416. 7，M=8. 35。
3.根據權利要求I所述的一種檢測肺結核中醫證候分型血清蛋白質譜模型在評估肺結核中醫分型、病程監控中應用。
全文摘要
本發明提供一種檢測肺結核中醫證候分型血清特征蛋白的質譜模型，通過能與蛋白質結合的磁珠基質去捕獲生物標志，從血清中篩選出5個蛋白作為特征蛋白，根據選取的5個蛋白質峰的質荷比m/z值及以該蛋白的臨界峰值均值M，建立了肺陰虛證、陰虛火旺證及氣陰兩虛證肺結核患者鑒別的血清特征蛋白質譜模型。本發明是一種在蛋白組學水平上的檢測，對肺結核中醫證候分型提供了新標準；為進一步發現的肺結核中醫證候生物標志提供了基礎。本發明可在評估肺結核中醫分型、病程監控中應用，可實現對肺結核證候進行科學化的分型。
文檔編號G01N30/06GK102680563SQ20121018759
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月5日 優先權日2012年6月5日
發明者劉姬艷, 李繼承 申請人:浙江大學