專利名稱：一種豬流感滅活疫苗的效價測定方法
技術領域：
本發明一種疫苗效力的檢驗方法，特別涉及一種豬流感滅活疫苗的效價測定方法，屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
豬流感(Swine Influenza, SI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種急性、高度接觸傳染性的豬呼吸道傳染病。在臨床上該病以突發性咳嗽、發熱、呼吸困難、衰竭、迅速康復或死亡為特征。該病可發生于各年齡和各品種的豬，發病率可高達100%。SI不僅使患豬生產性能下降，肉料比降低，直接影響豬群健康狀態，引起豬只死亡，而且豬流感病毒對豬呼吸道上皮細胞有高度的親嗜性，感染后使豬體的呼吸道天然屏障被破壞，導致豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬呼吸道冠狀病毒、豬胸膜肺炎放線菌等多種細菌或病毒的并發或繼發感染，使疫情更為復雜和加重。另外，SI還是豬主要的免疫抑制性疾病之一，可造成人工、飼料和藥物的巨大浪費，導致巨大的經濟損失。使用滅活疫苗接種是控制豬流感的有效辦法，然而目前國內尚無商品化的豬流感滅活疫苗，確定疫苗的效力檢驗方法是研制疫苗的關鍵技術。目前國內研究單位用于檢驗疫苗效力的方法有攻毒保護試驗，該方法所需時間較長，可控性差，評價結果時常因使用的動物級別不同，檢驗結果也常有誤差。無法快速、準確地確定豬流感疫苗的效價，已經成為研制豬流感疫苗的難點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種豬流感滅活疫苗的效價測定方法。本發明所采取的技術方案是
一種豬流感滅活疫苗的效價測定方法，包括如下步驟
1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清；
2)去除血清中的非特異性成分,得到待檢血清；
3)將豬流感滅活抗原稀釋，配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液；
4)將待檢血清稀釋，將血清稀釋液與4HA單位豬流感抗原稀釋液、紅細胞混合，進行血凝抑制實驗，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價。優選的，所述方法包括如下步驟
1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清；
2)將血清與受體破壞酶(RDE)混合，37°C水浴去除血清中非特異性成分；
3)將血清移至56°C水浴30min滅活殘留的RDE，加入雞紅細胞，20 25°C下吸附血清中殘余的非特異性成分；
4)將去除了非特異性成分的血清離心，取上清，上清即為待檢血清；
5)將豬流感滅活抗原進行稀釋，之后加入雞紅細胞懸液，在血凝板震蕩均勻后于20 25°C下靜置20 30 min,以紅細胞完全凝集的最高稀釋倍數為血凝價；、6)根據測得的血凝價配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液；
7)將待檢血清稀釋，加入4HA單位豬流感抗原稀釋液和雞紅細胞，同時設置陰性對照，進行血凝抑制實驗，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價。優選的，步驟3)中，加入雞紅細胞使血清中紅細胞的體積濃度為5% 20%。優選的，步驟5)和7)中，雞紅細胞的體積濃度為1%。本發明的有益效果是
首先，本發明采用了測定經RDE處理的血清中紅細胞凝集抑制效價的方法來評價疫苗的免疫效力。該方法大大縮短了測定時間，操作誤差小，可控性強，批間差異小，同時也減少了用動物攻毒保護試驗來檢驗效力時常常因為實驗動物級別不同，檢測結果常有的誤差。 其次，本發明的紅細胞凝集抑制效價的測定方法簡便、快速、具有特異性強等特點，可用于疫苗免疫效力檢驗。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步說明本發明。豬血清的獲得和預處理
1)用35日齡陰性(HI亞型流感HI抗體效價< 1:20)易感仔豬5頭，各頸部肌肉分左右兩點注射豬流感滅活疫苗(HlNl)3 ml，接種后21日，連同對照豬5頭采血，分離血清；
2)為去除血清中非特異性成分,將血清與受體破壞酶(RDE)按I : 4的體積比例混勻，置于37°C水浴中作用16 18h后，移至56°C水浴30min滅活殘留的RDE，取出后冷卻；
3)加入濃的雞紅細胞，使其終濃度為5% 20%，在室溫下吸附30min以去除其他非特異性成分；
4)然后低速離心(2000r/min)5 IOmin,吸取上清，即I: 5稀釋的待測血清,備用。豬流感滅活疫苗(HlNl)紅細胞凝集試驗
1)取96孔V型微量血凝板，每孔加25W PBS,在第I孔加25W豬流感滅活抗原，反復抽打8 10次混勻，從第I孔吸取25W加入第2孔，混勻后吸取25W加入第3孔，如此進行2倍稀釋至第11孔，第11孔吸取25W棄去；
2)每孔加入25^1%雞紅細胞懸液，將反應板在振蕩器上震蕩I 2min或輕扣反應板混合反應物，在室溫(20 25°C)下靜置20 30分鐘；
3)在對照孔紅細胞顯著呈鈕扣狀時判定結果，將反應板傾斜60度，觀察紅細胞有無淚珠狀流淌，完全無淚珠樣流淌(100%凝集)的最高稀釋倍數為血凝價。4HA單位抗原的配制
1)根據測定的抗原血凝價，用PBS配制4HA單位抗原
2)將配置好的4HA單位抗原用PBS稀釋，使其稀釋度為I :2、I :3、I :4、I :5、I :6、I :7，在每一稀釋度的25W抗原中加25 W PBS，再加入1%雞紅細胞懸液25 W，混勻，室溫靜置40min判結果。3) 如果I :4稀釋為100%紅細胞凝集終點，表明配制的是4HA單位抗原；如果100%紅細胞凝集終點是I :5或I :6，表明配制的4HA單位抗原實際上是高于4個單位；如果100%紅細胞凝集終點是I :2或I :3，表明配制的4HA單位抗原實際上是低于4個單位。應根據檢驗結果適當調整，使抗原工作液為4HA單位。
血凝抑制試驗(HI):
1)取96孔V型微量反應板，第I 11孔加入25W PBS，第12孔加入50 W PBS ；
2)在第I孔加入25W待檢血清，充分混勻后吸取25W于第2孔，依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25W棄去，并在每塊板上設標準陽性血清和陰性血清對照；
3)第I 11孔均加入25W 4HA單位的抗原，在室溫靜置30 min ；
4)每孔中加入25W 1% (V/V)雞紅細胞懸液，震蕩混勻，在室溫靜置20 30 min,對照紅細胞將呈鈕扣狀沉于孔底；
5)結果判定將反應板傾斜，凡血清反應孔與紅細胞對照孔中紅細胞以同樣速度從 孔底流淌者判為血凝抑制，以完全抑制4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價。疫苗評價
以完全抑制4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價。若免疫后21日HI抗體免疫組至少有4/5豬只的HI效價不低于I : 160，對照組HI效價應不高于I :20，則判定疫苗合格。本發明方法可靠性的驗證
取30頭35日齡非免疫仔豬隨機分成A、B、C共3組，10頭/組，分別經頸部肌肉注射S0802批豬流感滅活疫苗(H1N1)，其中A組0. 3 ml/頭，B組0. 5 ml/頭，C組I ml/頭，另取5頭同日齡仔豬不免疫作空白對照；
免疫后21天，各組采集血液分離血清，按I :4的比例使用受體破壞酶(RDE)處理血清，用HI亞型豬流感滅活抗原測定HI效價，并根據HI抗體的高低將試驗豬分成I、II JILIV共四組，其中I組的HI抗體效價< 1:40 ； II組的HI抗體效價=1 80 ;111組的HI抗體=1 160 ;IV組的HI抗體效價彡I :320。攻毒保護試驗
上述I、II、III、IV共四組免疫豬連同5頭同日齡抗體陰性豬(對照組)均用I :10倍稀釋的HlNl亞型豬流感病毒SGDOl株進行攻毒，滴鼻和肌肉注射各I ml /頭(約含5X 106_5EID5tl),攻毒后5日各組采集鼻拭子進行病毒分離，分別使用將每頭豬采集的鼻拭子各放入裝有Iml滅菌生理鹽水(含有雙抗)的塑料離心管中，4°C條件下靜置3-4小時后，3000rpm離心后經尿囊腔接種9_11日齡SPF雞胚5枚，每枚0. 2ml，35°C孵育觀察72小時，測定雞胚液血凝價，以5枚雞胚中至少有I枚雞胚的血凝價>1:8 (微量法)判為感染。以血凝價為陰性的雞胚尿囊液盲傳一次，判定方法同上。結果見表2。免疫后21日HI抗體情況
HlNl亞型豬流感疫苗S0802批以不同劑量免疫35日齡非免疫仔豬后21日的HI抗體情況見表I，結果表明HI抗體效價主要分布在I :80到I :160之間，約占60%。衣I,豬流感校衍CHIN! !Ml. SCiDOi株.)免疫Iim體分術情況
權利要求
1.一種豬流感滅活疫苗的效價測定方法，包括如下步驟 1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清； 2)去除血清中的非特異性成分,得到待檢血清； 3)將豬流感滅活抗原稀釋，配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液； 4)將待檢血清稀釋，將血清稀釋液與4HA單位豬流感抗原稀釋液、紅細胞混合，進行血凝抑制實驗，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價。
2.根據權利要求I所述的豬流感滅活疫苗的效價測定方法，其特征在于所述方法包括如下步驟 1)使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21 28日后采血分離血清； 2)將血清與受體破壞酶(RDE)混合，37°C水浴去除血清中非特異性成分； 3)將血清移至56°C水浴30min滅活殘留的RDE，加入雞紅細胞，20 25°C下吸附血清中殘余的非特異性成分； 4)將去除了非特異性成分的血清離心，取上清，上清即為待檢血清； 5)將豬流感滅活抗原進行稀釋，之后加入雞紅細胞懸液，在血凝板震蕩均勻后于20 25°C下靜置20 30 min,以紅細胞完全凝集的最高稀釋倍數為血凝價； 6)根據測得的血凝價配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液； 7)將待檢血清稀釋，加入4HA單位豬流感抗原稀釋液和雞紅細胞，同時設置陰性對照，進行血凝抑制實驗，以完全抑制4 HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價。
3.根據權利要求2所述的豬流感滅活疫苗的效價測定方法，其特征在于步驟3)中，加入雞紅細胞使血清中紅細胞的體積濃度為5% 20%。
4.根據權利要求2所述的豬流感滅活疫苗的效價測定方法，其特征在于步驟5)和7)中，雞紅細胞的體積濃度為1%。
全文摘要
本發明公開了一種豬流感滅活疫苗的效價測定方法，包括如下步驟使用豬流感滅活疫苗免疫豬，免疫后21～28日后采血分離血清；去除血清中的非特異性成分，得到待檢血清；將豬流感滅活抗原稀釋，配制濃度為4HA單位豬流感抗原稀釋液；將待檢血清作倍比稀釋，依次加入4HA單位豬流感抗原稀釋液、1%紅細胞，進行血凝抑制實驗，以完全抑制4HA單位豬流感抗原的血清最高稀釋度為HI效價。該方法大大縮短了測定時間，操作誤差小，可控性強，批間差異小，同時也減少了用動物攻毒保護試驗來檢驗效力時常常因為實驗動物級別不同，檢測結果常有的誤差。
文檔編號G01N33/86GK102735853SQ201210186169
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月7日 優先權日2012年6月7日
發明者仇微紅, 葉賀佳, 孫招金, 廖明, 李敏, 梁昭平, 王斌, 羅開健 申請人:華南農業大學, 廣州市華南農大生物藥品有限公司