專利名稱：生物內源性氧化劑的檢測試劑及方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測生物內源性氧化劑的化學試劑以及檢測方法。
背景技術：
通常將活性氧(ROS)和活性氮(RNS)作為具有強氧化性的非常小的無機或有機分子。有各種形式的ROS和RNS，包括自由基，如超氧化物自由基、羥基自由基、一氧化氮、二氧化氮和有機過氧化氫自由基，以及非自由基種類，如過氧化氫、單態氧、臭氧、亞硝酸、過氧亞硝酸和次氯酸。ROS和RNS是細胞呼吸的副產物。在正常條件下，ROS和RNS以非常低的水平存在，并在細胞信號傳導中發揮重要作用。而在氧化應激期間，ROS和RNS水平急劇升高，這可能對各種生物分子如蛋白質、脂質和DNA造成嚴重損害。已知在許多人類疾病如心血管疾病、炎性疾病、代謝疾病、癌癥和中樞神經系統疾病中會過量產生ROS和RNS。因此，迫切需要能夠靈敏且選擇性地測量、檢測或篩選某些ROS和RNS的化學物質，以闡釋其在體 外和體內的生理作用。在各種形式的ROS和RNS中，過氧亞硝酸和次氯酸的氧化能力最強，同時，對它們的高選擇性檢測對于清楚地解釋它們的生理病理作用非常關鍵。在1990年，科學家首次發現生物體內的一氧化氮和超氧陰離子可以通過近擴散控制的加成反應生成內源性的過氧亞硝酸根(00N0-)I。進一步的研究揭示，一氧化氮(NO)的細胞毒性很大程度上由00N0-介導1-3。不論是以直接的方式還是間接地通過一系列的下游反應物質，過氧亞硝酸可以氧化各種底物，包括過渡金屬中心、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和組氨酸等，或通過使酪氨酸硝化而修飾蛋白。過氧亞硝酸還可以誘導脂質過氧化，攻擊DNA的核苷堿基和糖-磷酸酯骨架4-9。這些過程導致蛋白質失去功能，膜降解以及DNA損傷。當細胞損傷無法被主動修復時，即會發生細胞凋亡或壞死。過氧亞硝酸與各種病理狀態(如心血管疾病、循環休克、炎癥、癌癥、中風、再輸灌損傷、神經退行性疾病和糖尿病)之間的關聯現已明確建立起來7。因此，準確檢測細胞的過氧亞硝酸水平對于疾病診斷及相關病理生理學的探究有重要意義。過氧亞硝酸可以硝化游離的或蛋白質中的酪氨酸，因此，可以通過細胞硝基酪氨酸的免疫組織學的方法來測量00N0-的水平10-11。但是，這種方法有缺陷。首先酪氨酸可以通過其它機理被硝化12-15，這會導致實際測量值偏高。同時，該方法無法提供高分辨率的時空信息。基于發光，尤其是基于熒光的技術已逐漸成為生物、醫學領域的常規技術手段。在早期的研究中用到的熒光探針如二氫二氯熒光素(DHDCF)及其雙乙酸酯衍生物和二氫羅丹明(DHR)等選擇性很差16-21。因此，解讀這些研究數據時須得小心，以避免得出錯誤的結論22。化學發光探針也有相同的問題23-25。最近報道了幾類00N0—的小分子熒光成像劑，包括羅丹明B hydroazide26，HPF/APF27，NiSPY系列28，HKGreen系列29-31，頻哪醇硼酸酯32-33，BzSeO-Cy34-35以及CyPSe36。其中HPF和APF已經商品化。，HKGreen系列與DHDCP和DHR相比，選擇性有所提高，并在一些生物醫學研究中得到應用38-39。但是，針對高氧化性物質(包括C10_和HO’)的高選擇性仍然是個問題。此外，多通道探針允許自動校準，并避免了脫色、不均勻的探針負載以及不均勻的激發等所致的復雜性40-41。顯而易見，有必要開發多信號通道小分子探針。
發明內容
本發明提供一類新穎的熒光探針，以測量、檢測或篩選活性氮(RNS)或活性氧(ROS), ia 1OyO2^NCKH2Oy 0H、0Cr、0N0(T和烷基過氧化氫自由基(R00 )等。所述探針特別對過氧亞硝酸(0N00_)和次氯酸(C10_)具有高選擇性，能給出敏感的、比例型、多通道的熒光信號，并可應用于細胞顯微成像實驗中。具體而言，本發明的熒光探針具有通式I所示的結構
權利要求
1.具有通式I或II結構的化合物
2.如權利要求I所述的化合物，其特征在于，所述通式I或II中，!^、民和&各自獨立選自H、C1-C6烷基、鏈烯基、炔基、鹵素、C1-C6烷氧基、氨基、羥基、鹵素取代的C1-C6烷基和鹵素取代的C1-C6烷氧基；和 R4選自H、C1-C6烷基、鹵素、羥基和鏈烯基。
3.如權利要求I或2所述的化合物，其特征在于，所述通式I或II中，R5、R7和R8各自獨立選自氣，C1-C6燒基，酸基，齒素，鏈稀基，燒氧基，輕燒基，氣基，輕基，和齒素取代的燒基。
4.如權利要求I一 3中任一項所述的化合物，其特征在于，所述通式I中，R9選自H、鹵素和C1-C6烷基。
5.如權利要求I一 4中任一項所述的化合物，其特征在于，所述通式I中，RpRyRpR5'R8SH, R2SC1-C6烷基，R6為羥基、氨基和N(R)2, R7和R9各自獨立為H和鹵素，以及R為C1-C6烷基； 所述通式II中，R1^ R3> R4> R5> R8為H，R2為C1-C6烷基，R6為羥基、氨基和N(R)2, R7為H或鹵素，以及R為C1-C6烷基。
6.如權利要求I所述的化合物，其特征在于，所述化合物選自以下化合物I一 5和Ia :
7.—種檢測用組合物，其包含權利要求1-6中任一項所述的化合物。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物用于測量、檢測或篩選活性氧(ROS)和活性氮(RNS)。
9.一種測量樣品中的活性氧(ROS)和/或活性氮(RNS)的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 a)使權利要求1-6中任一項所述通式I和/或II化合物或權利要求7所述組合物接觸樣品，以形成熒光化合物；和 b)測量所述熒光化合物的熒光特性，從而根據所述熒光特性測定樣品中的活性氧和/或活性氮。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述活性氧選自JOyO/'ROO 、‘0H、C10 —和H2O2 ;所述活性氮選自一氧化氮、二氧化氮、亞硝酸和過氧亞硝酸。
全文摘要
本發明涉及用于檢測生物內源性氧化劑的化學試劑以及檢測方法。具體而言，本發明涉及如下通式I,II的化合物及使用所述化合物檢測生物內源性氧化劑如活性氧和活性氮的方法。本發明化合物特別對過氧亞硝酸(ONOO-)和次氯酸(ClO-)具有高選擇性，能生成熒光染料，發送敏感的、比例型、多通道的熒光信號，并可應用于細胞顯微成像實驗中。
文檔編號G01N21/64GK102807543SQ201210181179
公開日2012年12月5日 申請日期2012年6月4日 優先權日2012年6月4日
發明者楊有軍, 張泉娟, 錢旭紅 申請人:華東理工大學