專利名稱：一種檢測mgmt活性的化學發光檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性的化學發光檢測試劑盒及其檢測方法。
(ニ)
背景技術：
O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶(O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase,MGMT)是ー種高效的DNA修復酶，能夠修復化療中烷化劑藥物對腫瘤細胞DNA所造成的損傷，如果腫瘤細胞中的MGMT活性達到一定水平則可能會導致耐藥性，因此，MGMT活性的高低為耐藥與否提供直接信息，MGMT活性檢測對評估化療效果以及減少藥物毒副作用有著重要的意義。不幸的是，目前還沒有ー種簡易可靠、可應用于常規臨床檢驗的方法來測定具有重要腫瘤學價值的MGMT活性。已有大量文獻描述MGMT基因啟動子甲基化以及MGMT蛋白表達的免疫測定并試圖建立這些分子生物學和血清學指標與腫瘤耐藥性、生存率以及個體化治療方案的相關性，但這些煩瑣而且不穩定的檢測方法不適合在臨床上常規使用，也因為 它們不直接測定MGMT的酶學活性而可能引入各種與腫瘤耐藥機制無關的干擾因素。基于同位素標記底物的MGMT活性測定法只適用于實驗室研究而難以被用于常規臨床檢驗中；此外，這種方法所用的蛋白沉淀步驟容易引入諸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特異結合，引起假陽性。雖然有人用非同位素標記的底物和酶聯免疫分析方法來測定MGMT活性，但這個方法需要多步而費時的固相分離和反應。從臨床應用和檢測效率(靈敏度)的角度來看，這是個明顯的缺點。很明顯，無論在腫瘤生物學的基礎研究中還是在腫瘤治療的臨床實踐中，都急需發展ー種簡單可靠的方法來特異、靈敏地測定各種腫瘤組織和細胞中的MGMT活性。
發明內容
本目的是提供ー種簡便、特異、靈敏的MGMT活性的化學發光檢測試劑盒及其檢測方法。本發明采用的技術方案是一種檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性的化學發光檢測試劑盒，主要包括試劑I :鏈霉親和素磁珠濃度為r5mg/mL的分散液，溶劑為含有O. 5% (w/w)牛血清白蛋白、1% (w/w)酪蛋白的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述鏈霉親和素磁珠為表面修飾鏈霉親和素的磁性微球，粒徑為Γ3μπι，內核為四氧化三鐵(Fe304)、表面帶有鏈霉親和素生物分子，可通過戊ニ醛兩步法在表面帶有羧基或氨基等活性基團的磁性微球以化學共價結合方式引入鏈霉親和素，并以含有O. 5%牛血清白蛋白(bovine serumalbumin, BSA)、1%酪蛋白的pH為7. 2,0. 02mol/L的磷酸緩沖液進行封閉完成試劑2 :生物素標記的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物，即生物素標記的O6-芐基鳥嘌呤溶液，使用時以含有疊氮鈉O. 2g/L、BSAl. Og/L的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為5 μ g/mL ；試劑3 :辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗人MGMT特異性單克隆抗體，使用時以含有O. 05% (w/w)甘油和O. 2g/L的硫柳汞的防腐劑溶液稀釋至濃度為2 μ g/mL ;酶標記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液，當標記酶為過氧辣根化物酶，標記方法優選為過氧碘酸鈉法；當標記酶為堿性磷酸酶，標記方法優選為戊ニ醛法；試劑4 06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標準品溶液，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；使用時配制為6個梯度濃度，分別為 600、150、50、25、10、0fmol/mL ；試劑5 :發光底物液，為過氧化氫-魯米諾發光液或者AMPH)溶液；所述酶標記物的標記酶為過氧辣根化物酶時，發光底物液由A液和B液構成，發光底物液A液為過氧化氫溶液，發光底物液B液為魯米諾溶液，使用時等體積混合；所述酶標記物的標記酶為堿性磷酸酶時，發光底物液為3- (2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3’ -羥基)苯-1，2-ニ氧雜環丁燒憐酸鈉(4_methoxy-4-(3-phosphatephenyl )-spiro-( I, 2-dioxetane_3，2，_admantane)，AMPPD)溶液，溶劑為0. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液。試劑6 :濃縮洗滌液，為含有O. 19Γ0. 5% (w/w)吐溫_20、0. 1% (w/w)疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，pH 7. 4。本發明提出了使用鏈親和素(Streptavidin, SA)修飾磁性微球捕獲MGMT,結合酶促化學發光反應來檢測MGMT的活性的方法。檢測原理圖如圖I所示(a)待測的MGMT與Biotin標記MGMT底物生物素化O6-芐基鳥嘌呤(Biotin-BG)反應，在芐基轉移到酶蛋白后形成生物素標記的MGMT即Biotin-MGMT ； (b)加入過量鏈霉親和素修飾的磁性微球P (St-GMA-SA) /Fe3O4俘獲Biotin-MGMT，并在外加磁場作用下進行分離；(c)最后加入O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性抗體的酶標記物(ALP-anti-MGMT或HRP-anti-MGMT)；(d)使用酶促化學發光底物來檢測MGMT的活性相關指標。由于MGMT能催化Biotin-BG上的苯甲基轉移到自身的巰基上，使MGMT標記上了 Biotin，從而形成Biotin-MGMT，可被帶有SA配基的P(St-GMA-SA)/Fe3O4捕獲。MGMT的活性越高，催化能力就越強，被Biotin標記的量就越高，從而被P (St-GMA-SA) /Fe3O4捕獲的量就越多，因此MGMT的活性與被P (St-GMA-SA) /Fe3O4捕獲數量直接相關，通過酶促化學發光反應即可獲得MGMT的活性信息，最終被檢測樣品的發光強度度值越高，即被捕獲的MGMT數量越多，MGMT的活性就越高。即本發明采用高特異性的anti-MGMT和Biotin-BG兩種探針，與MGMT形成免疫夾心復合物，結合磁性微球固相分離和酶促化學發光檢測技木，從而達到快速、靈敏檢測MGMT活性的目的。本發明還涉及ー種利用所述的試劑盒對O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性進行檢測的方法，所述方法包括(I)按本領域常規方法提取待測樣品的總蛋白質；(2)向試管中加入25 μ L上述處理后的樣品蛋白質，再加入50 μ L試劑2 (稀釋后的)，37°C恒溫振蕩反應30min，加入50 μ L試劑1，37°C恒溫振蕩反應5min后，將試管架置 于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜；往試管中加入500 μ L試劑6 (稀釋后的)，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清液，再加入50 μ L試劑3(稀釋后的)，37°C恒溫振蕩反應5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜，加入500 μ L試劑6 (稀釋后的)，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，加入300 μ L試劑5,充分混勻后,暗處放置2min后置于磁分離器,待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學發光儀測定，獲得其發光值；(3)取梯度濃度的試劑4，按照步驟(2)的方法分別測定其發光值，以所獲得的每個濃度標準溶液的平均值(RLU)減去濃度為O的標準品溶液的發光值(RLUtl),再取對數值作為縱坐標，以標準品溶液濃度的自然対數值為橫坐標，繪制標準曲線；(4)根據樣品溶液的發光值，按照步驟(3)計算方法取對數值，對照標準曲線，即獲得樣品中的MGMT含量。所述待測樣品可為臨床組織樣品或臨床細胞株樣品。待測樣品為腫瘤細胞株樣品時，總蛋白提取步驟如下I.裂解液制備每500uL冷的緩沖溶液(20mM DTT, 2mM EDTA, 20% (v/v)丙三醇，溶劑為IOOmM Tris-HCl, pH 7. 6，)A中加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/mL抑肽酶， 10 μ M抑氨肽酶素b, 10 μ M亮抑酶肽，I μ M胰肽素,O. ImM苯甲基磺酰氟),混勻后置冰上備用；2.取5 10 X IO6個細胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5 10分鐘，小心吸取培養基，
盡可能吸干，收集細胞；3.用冷PBS洗滌細胞兩次，毎次洗滌后盡可能吸干上清；4.每5X IO6個細胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘；5.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘；6.快速將上清吸入另ー預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。待測樣品為臨床組織樣品吋，總蛋白提取步驟如下I.裂解液制備姆500uL冷的緩沖溶液A中加入2uL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用；2.取IOOmg組織樣本剪碎，加入上述裂解液中，并用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體；3.將組織勻漿吸入另ー預冷的干凈離心管中，在4°C，IOOOOrpm條件下離心5分鐘；4.將上清吸入另ー預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。本發明的有益效果主要體現在(I)本發明使用磁性微球代替一般的孔板作為ELISA的固相反應載體，由于其高的比表面積和低的傳質阻力，親和反應可迅速發生，并且在外加磁場的作用下，可以快速、高效地捕獲MGMT，達到快速檢測的目的；(2)本發明與常規只是用抗體一種結合探針的ELISA檢驗不同是的是，使用Biotin-BG和anti-MGMT兩種特異探針，通過酶學催化和抗原-抗體雙重特異反應來保證最終檢測信號的高特異性。(3)本發明試劑盒成分簡單，攜帯方便，檢測步驟與常規的ELISA類似，適用于大批量樣品的定量和定性分析檢測。
圖I為本發明原理圖；圖2為本發明制備獲得的鏈霉親和素磁珠的透射電鏡照片。圖3為本發明實施例I獲得的標準曲線。圖4為本發明實施例2獲得的標準曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于
此 實施例I :人腦膠質瘤細胞MGR-I樣品中MGMT活性檢測檢測人腦膠質瘤細胞MGR-I樣品中MGMT活性的化學發光酶聯免疫試劑盒包括(I)鏈霉親和素磁珠粒徑為f 3 μ m、使用濃度為10mg/mL，IOmL/瓶，I瓶；(2)生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物濃度為5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋1000倍后使用，稀釋液為含有1%BSA和O. 2g/L的疊氮鈉防腐劑溶液。(3)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性抗體的酶標記物標記酶為堿性磷酸酶，濃度為5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋2000倍后使用，稀釋液為含有O. 05%甘油和O. 2g/L的硫柳汞防腐劑溶液。(4) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標準品溶液濃度分別為600、150、50、25、10、0fmol/mL,0. 5mL/瓶，6瓶，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；(5)發光底物液AMPH)溶液，溶劑為O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，AMPPD濃度O. 5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；(6)濃縮洗滌液pH 7. 4，含有O. 2%吐溫-20，O. 1%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖溶液。25mL/瓶，I瓶。使用時用蒸餾水稀釋20倍；其中鏈霉親和素磁珠、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物以及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性單克隆抗體的堿性磷酸酶標記物的制備方法如下I、鏈霉親和素磁珠的制備a)表面含有氨基基團的磁性微球的制備在50mL Fe3O4磁流體中加入90mL無水こ醇，O. 4g聚こ烯吡咯烷酮，超聲IOmin混合均勻后轉移到250mL三頸瓶中，依次加入4mL苯こ烯、ImL甲基丙烯酸縮水甘油酷、O. 09g偶氮ニ異丁腈,機械攪拌,通入氮氣45min后升溫到75°C，反應24h。將反應后的混合液進行磁分離，分別用こ醇和二次水各洗滌三次，真空干燥，得到棕色的粉末。將上述5g粉末中加入50mL水和50mL己ニ胺，超聲IOmin混合均勻后轉移到250mL三頸瓶中，機械攪拌，在80°C時反應12h。將反應后的混合液進行磁分離后，用純水洗滌多次除去多余己ニ胺，得到表面含有氨基基團的磁性微球。b)將50mg表面含有氨基基團的磁性微球放入滅菌水中浸泡，用磷酸鹽緩沖液(pH
7.4)清洗3次后，再加入2. 5mL磷酸鹽緩沖液，超聲分散IOmin后待用；取上述2. 5mL磁性微球分散液，加入2mL的戊ニ醛室溫震蕩反應6h，進行磁分離，多次用大量純水清洗多余的戊ニ醛后，將磁性微球重新懸浮在2. 5mL磷酸鹽緩沖液中，然后再加入到裝有200μ L的濃度I. Omg/mL的鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養6h ;用磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)多次清洗所得磁性微球，最后將其分散在含有O. 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、1%酪蛋白的pH為7. 2,0. 02mol/L的磷酸緩沖液中(濃度為10mg/mL)，4°C保存待用。制得的鏈霉親和素磁珠的透射電鏡照片見圖2。2、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物的制備將O6-芐基鳥嘌呤用O. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. O)或O. 5mol/L硼酸緩沖液(pH 8. 6)稀釋到Img/mL，用ImL DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB) Img ;向ImL O6-芐基鳥嘌呤溶液加入120 μ L NHSB溶液(即含NHSB 120 μ g);在室溫下持續攪拌，保溫2 4小吋；加入9. 6 μ Llmol/L NH4Cl (每 25 μ g NHSB 加 I μ L)和 200 μ L 濃度為 lmg/mL EDC (I-(3- ニ 甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽)溶液，在室溫下攪拌10分鐘；在4°C，對PBS充分透祈，以除去游離的生物素；將樣品上ImL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集ImL/管，蛋白質在I 3mL之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉(終濃度0. 2g/L)及I. 0g/L BSA，濃度為5μ g/mL。將結合產物置4°C，避光保存。
3、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性單克隆抗體的堿性磷酸酶標記物的制備將堿性磷酸酶20mg溶于I. 5% (v/v)的戊ニ醛溶液中，室溫靜置過夜，將上述酶液經Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫,流速控制I. 2mL/min,并收集棕色流出物；取O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性單克隆抗體anti-MGMT 2. 5mg,以0. lmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋至5mL，攪拌下逐滴加入酶溶液中；然后加入0. 2mol/L賴氨酸0. 2mL，混勻，置室溫2 3h ;反應液裝入透析袋，以0. lmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析24h后，以含有0.05%甘油、0. 2g/L的硫柳汞防腐溶液I : 2000稀釋，分裝，4°C保存待用。利用該試劑盒檢測人腦膠質瘤細胞MGR-I樣品中MGMT活性的方法如下(I)樣品前處理a.裂解液制備每 500uL 冷的緩沖溶液 A 中(IOOmM Tris-HCl, ρΗ7· 6，20mM DTT,2mM EDTA, 20%丙三醇)加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/mL抑肽酶，10 μ M抑氨肽酶素比1(^1亮抑酶肽，1レ11胰肽素，0. ImM苯甲基磺酰氟)，混勻后置冰上備用；b.取5 10X IO6個MGR-I細胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5_10分鐘，小心吸取
培養基，盡可能吸干，收集細胞；c.用冷PBS洗滌細胞兩次，毎次洗滌后盡可能吸干上清；d.每5X IO6個細胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘；e.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘；f.快速將上清吸入另ー預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。(2)檢測方法向試管中加入25 μ L上述處理后的MGR-I樣品或同體積的系列標準品溶液，再加入生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物50μ L，37°C恒溫振蕩反應30min。加入50 μ L鏈霉親和素修飾的磁性微球，37°C恒溫振蕩反應5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜；加入洗滌液500 μ L，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min,除去上清,再加入50 μ L堿性磷酸酶標記的an_MGMT, 37°C恒溫振蕩反應5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜，加入洗滌液500yL，充分洗滌2^3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，加入AMPTO發光底物液300 μ L，充分混勻后，暗處放置2min后置于磁分離器，待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學發光儀測定。(3)結果分析發光計數-劑量反應曲線以雙對數曲線表示，即所獲得的每個濃度標準溶液或樣本發光值的平均值(RLU)減去第一個零標準點的發光值(RLUtl),再取對數，即縱軸(Y軸)=Iog (RLU-RLU0) =IogARLU以MGMT濃度的自然對數值為橫軸(X軸)，繪制標準曲線，如圖3所示。相應每個樣品中MGMT濃度可從標準曲線上讀出，計算出樣品溶液中MGMT的濃度。按照上述方法采 用本發明試劑盒對待測樣品進行檢測，其濃度檢測線性范圍可達到(TlOOOfmol/mg蛋白質之間，可以避免高MGMT濃度樣品的稀釋，使用本試劑盒的整個檢測過程約f I. 5h，最低檢測限為2. Ofmol/mg蛋白質。實施例2 人乳腺癌組織樣品中MGMT活性檢測檢測人乳腺癌組織樣品中MGMT活性的化學發光酶聯免疫試劑盒包括(I)鏈霉親和素磁珠粒徑為f 3 μ m、使用濃度為10mg/mL，IOmL/瓶，I瓶；(2)生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物濃度為5 μ g/mL，5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋1000倍后使用，稀釋液為含有1%BSA和0. 2g/L的疊氮鈉防腐劑溶液。(3) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性抗體的酶標記物標記酶為辣根過氧化物酶，濃度為5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋2000倍后使用，稀釋液為含有
0.05%甘油和0. 2g/L的硫柳汞防腐劑溶液。(4) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標準品溶液濃度分別為600、150、50、25、10、0fmol/mL,0. 5mL/瓶，6瓶；溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；(5)發光底物液A液，過氧化氫溶液(20. O μ mol/mL), 5mL/瓶，I瓶；B液魯米諾溶液(1.(^11101/111し)，511117瓶，1瓶；使用時體積比為1 I混合。(6)濃縮洗滌液pH 7. 4，含有0. 3%吐溫-20，0. 1%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖溶液。25mL/瓶，I瓶。使用時用蒸餾水稀釋20倍；其中鏈霉親和素磁珠、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物以及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性單克隆抗體的辣根過氧化物酶標記物的制備方法如下I、鏈霉親和素磁珠的制備將50mg表面含有氨基基團的磁性微球放入滅菌水中浸泡，用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，再加入2. 5mL磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)，超聲分散IOmin后待用；取上述2. 5mL磁性微球分散液，加入2mL的戍ニ醒室溫震蕩反應6h,進行磁分離，多次用大量純水清洗多余的戊ニ醛后，將磁性微球重新懸浮在2. 5mL磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)中，然后再加入到裝有200 μ L的濃度I. 0mg/mL的鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養6h ;用磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)多次清洗所得磁性微球，最后將其分散在含有0. 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、1%酪蛋白的pH為7· 2,0. 02mol/L的憐酸緩沖液中(濃度為10mg/mL)，4°C保存待用。2、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物的制備將O6-芐基鳥嘌呤用O. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. O)或O. 5mol/L硼酸緩沖液(pH 8. 6)稀釋到Img/mL，用ImL DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB) Img ;向ImL O6-芐基鳥嘌呤溶液加入120 μ L NHSB溶液(即含NHSB 120 μ g);在室溫下持續攪拌，保溫2 4小吋；加入
9.6 μ Llmol/L NH4Cl (每25 μ g NHSB加I μ L)，在室溫下攪拌10分鐘；在4°C，對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上ImL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集ImL/管，蛋白質在I 3mL之間洗下；最后,樣品加入疊氮鈉(終濃度O. 2g/L)及I. Og/L BSA,濃度為5 μ g/mL。將結合產物置4°C，避光保存。3、06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性單克隆抗體的辣根過氧化物酶標記物的制備將辣根過氧化物酶IOmg溶于ImL純水中，在攪拌條件下逐滴加入O. 2mL NaIO4溶液
O.2mL，室溫攪拌30min后，用pH 4. 4的濃度為lmmol/L醋酸鈉緩沖溶液在4°C下透析過夜后，用0. 2mol/L的Na2CO3緩沖溶液將pH值調整至9. (TlO. O ;將Img的anti-MGMT溶于4mL濃度為0. 2mol/L的Na2CO3緩沖溶液中并迅速加入上述酶液，攪拌反應3飛小時，再加入新配置的NaBH4溶液100yL，4°C下反應2小時；將上述反應液裝入透析袋中，在0. lmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中透析24h后，以含有0. 05%甘油、0. 2g/L的硫柳汞防腐溶液I 2000稀釋，分裝，4°C保存待用。利用該試劑盒檢測人乳腺癌組織樣品中MGMT活性的方法如下(4)樣品前處理a.裂解液制備 每500uL冷的緩沖溶液A中加入2uL蛋白酶抑制劑混合物，混勻
后置冰上備用。b.取IOOmg組織樣本剪碎，加入上述裂解液中，并用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。c.將組織勻漿吸入另ー預冷的干凈離心管中，在4°C，IOOOOrpm條件下離心5分鐘。d.將上清吸入另ー預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。(5)檢測方法向試管中加入25 μ L上述處理后的人乳腺癌組織樣品總蛋白或同體積的系列標準品溶液，再加入生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶的底物50 μ L，37°C恒溫振蕩反應30min。加入50 μ L鏈霉親和素磁珠，37°C恒溫振蕩反應5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜；加入洗滌液500 μ L，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，再加入50 μ L辣根過氧化物酶標記的anti-MGMT，37°C恒溫振蕩反應5min后,將試管架置于磁分離器上分離5min,然后倒出上層清夜,加入洗漆液500 μ L,充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，加入發光底物液A液和B液各150 μ L,充分混勻后，暗處放置2min后置于磁分離器,待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學發光儀測定。(6)結果分析發光計數-劑量反應曲線以雙對數曲線表示，即所獲得的每個濃度標準溶液或樣本發光值的平均值(RLU)減去第一個零標準點的發光值(RLUtl),再取對數，即
縱軸(Y軸)=Iog (RLU-RLU0) =IogARLU以MGMT濃度的自然對數值為橫軸(X軸)，繪制標準曲線，如圖4所示。相應每個樣品中MGMT濃度可從標準曲線上讀出，計算出樣品溶液中MGMT的濃度。按照上述方法采 用本發明試劑盒對待測樣品進行檢測，其濃度檢測線性范圍可達到(TlOOOfmol/mg蛋白質之間，可以避免高MGMT濃度樣品的稀釋，使用本試劑盒的整個檢測過程約fl.5h，最低檢測限為4. 5fmol/mg蛋白質。
權利要求
1.一種檢測ο6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性的化學發光檢測試劑盒，主要包括 試劑I :鏈霉親和素磁珠濃度為f5mg/mL的分散液，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0· 02mol/L的磷酸鹽緩沖液； 試劑2 :生物素標記的O6-芐基鳥嘌呤溶液，使用時以含有疊氮鈉O. 2g/L、BSAl. Og/L的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為5 μ g/mL ； 試劑3 :辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗人MGMT特異性單克隆抗體，使用時以含有O. 05%甘油和O. 2g/L的硫柳汞的防腐劑溶液稀釋至濃度為2 μ g/mL ； 試劑4 06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標準品溶液，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0· 02mol/L的磷酸鹽緩沖液； 試劑5 :發光底物液，為過氧化氫-魯米諾發光液或者AMPH)溶液； 試劑6 :濃縮洗滌液，為含有O. 19Γ0. 5%吐溫-20、0. 1%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，pH7. 4，使用時蒸餾水稀釋20倍。
2.利用如權利要求I所述的試劑盒對O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶進行檢測的方法，所述方法包括 (1)提取待測樣品的總蛋白質； (2)向試管中加入25μ L上述處理后的樣品蛋白質，再加入50 μ L試劑2，37°C恒溫振蕩反應30min,加入50 μ L試劑I, 37°C恒溫振蕩反應5min后,將試管架置于磁分離器上分尚5min,然后倒出上層清夜；往試管中加入500 μ L試劑6,充分洗漆2^3次后,置于磁分尚器上分離5min，除去上清液，再加入50 μ L試劑3，37°C恒溫振蕩反應5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜，加入500 μ L試劑6，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min,除去上清,加入300 μ L試劑5,充分混勻后，暗處放置2min后置于磁分離器，待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學發光儀測定，獲得其發光值； (3)取梯度濃度的試劑4，按照步驟(2)的方法分別測定其發光值，以所獲得的每個濃度標準溶液的平均值(RLU)減去濃度為O的標準品溶液的發光值(RLUtl),再取對數值作為縱坐標，以標準品溶液濃度的自然対數值為橫坐標，繪制標準曲線； (4)根據樣品溶液的發光值，按照步驟(3)計算方法取對數值，對照標準曲線，即獲得樣品中的MGMT含量。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述待測樣品為臨床組織樣品或臨床細胞株樣品。
全文摘要
本發明提供了一種檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)活性的化學發光檢測試劑盒，它包含有鏈霉親和素磁珠，生物素化的O6-芐基鳥嘌呤，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶特異性抗體anti-MGMT的酶標記物，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標準品溶液，發光底物液，濃縮洗滌液。本發明還公開了一種應用上述試劑盒用于MGMT的檢測方法，它包括步驟首先進行樣品總蛋白質提取，然后采用試劑盒檢測，最后分析檢測結果。本發明提供了一種檢測人組織或細胞中的MGMT活性的化學發光檢測試劑盒及檢測方法，具有操作簡便、快速，檢測結果靈敏度高、特異性強等諸多優點，在MGMT活性臨床檢測方面具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/577GK102707060SQ201210180020
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者何睿, 梁媛媛, 溫漢華, 焦艷華, 陳燦玉, 黃志堅 申請人:杭州師范大學