專利名稱：血清中肌酐的二步酶法測定方法及測定試劑的制作方法
技術領域：
本發明 涉及醫學檢驗技術領域，具體涉及一種血清中肌酐的二步酶法測定方法及測定試劑。
背景技術：
肌酐(Cr)是一種低分子含氮化合物，相對分子質量116，000。Cr主要由肌肉產生，是肌酸的終末代謝產物，正常情況下，人體內Cr的含量基本穩定，一般維持在3 14mg/L，僅僅由腎小球排泄，不被腎小管重吸收，由于Cr是小分子物質不與血漿蛋白結合，所以測定血清Cr濃度及根據血清Cr與尿酐濃度計算所得的Cr清除率是既簡單又可靠的腎小球濾過功能指標，深受臨床重視。臨床實驗室對于血和尿中Cr的測定常用酶法或堿性苦味酸法(Jaffe法)，Jaffe法雖然試劑較便宜，但線性范圍窄，易受血清中其他假性Cr物質的干擾，尤其是當血清膽紅素值彡165.5 iimol/L時開始出現負偏差，而且血清膽紅素越高偏差越大。此外。JafTe法受到酮體、乳糜血和溶血的嚴重干擾，頭孢類和維生素C及多巴胺等藥物也使其結果出現較大干擾。酶法利用Cr在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶等酶及顯色劑和水、氧的共同作用下生成醌亞胺(紅色)，通過檢測反應終點的吸光度來推算樣品中Cr的含量，酶法不管是一步酶法或兩步酶法，測定過程中Cr水解后產生的肌酸和內源性肌酸同時轉化為醌亞胺，Cr測定結果包括了 Cr和肌酸之和。正常男性血Cr參考范圍為53 106 y mol/L，女性44 88 u mo I/L ;正常男性血肌酸參考范圍為15 45 u mol/L,女性為30 80 u mol/L,當發生急性肌損傷、饑餓、糖尿病、營養不良、甲亢、發熱時肌酸顯著升高，對Cr造成的偏差更顯著。為解決內源性肌酸干擾，僅以肌酐酶為第二試劑的兩步酶測定方法，由于第一步反應體系中有4-AAP和色原，肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶催化作用產生醌亞胺，肌酸被轉化而被耗盡，當加入肌酐酶后啟動Cr水解反應生成肌酸，再經肌酸酶、肌氨酸氧化酶、過氧化物酶催化作用產生醌亞胺，反應過程如下第一步反應
^ %
肌ft+H20+02 —>鱗氨酸+麗素(I)
- 、
肌奴酸+H20+02 ^> 11' -+ 1I1 m+ H2O2 (2)
,卿,
H202+4-AAP+ 色原^ Si亞胺+2H20+HC1C 3 )第二步反應
權利要求
1.一種血清中肌酐的二步酶法測定方法，其特征在于利用肌酐測定試劑的試劑I中的過氧化氫酶消除內源性肌酸產生的過氧化氫，進而由肌酐測定試劑的試劑2中的過氧化氫酶抑制劑抑制試劑I中的過氧化氫酶，從而測定樣本中肌酐含量。
2.根據權利要求I所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法，其特征在于所述的肌酐測定試劑的試劑I中包含過氧化氫酶，肌酸酶，肌氨酸氧化酶和色原，試劑2中包含過氧化氫酶抑制劑，肌酐酶，過氧化物酶和4-氨基安替比林；其中過氧化氫酶抑制劑為疊氮化物，羥胺，氟化物，醋酸鹽，甲酸鹽，乙醇、甲醇中的一種或幾種。
3.—種權利要求I或2所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于該試劑由試劑I和試劑2組成，其中試劑1、2各組分及濃度范圍為 試劑I : 緩沖ft (pH 7, (F8. 5) 50-500 _ol/L 肌酸酶 1-100 Kl L 眺鉍酸杈化_ 1-100 K17L 抗壞血酸鉍化_ HOO KU/L JiWtMW 0 卜20 HJ/L 色I-1U() mmol/L 表_'活性劑 0. HOO g/L 1-100 mmol I 防腐劑0.1-100 ml .I; 試劑2 緩沖液 Cpll 7. 0-8. S) 50-500 mmol； LKmm Ho。ku/l -1-鉍基安替比林 0.5-50 mmo I /I, 過氣化物SI 卜100 KU/L 去干擾_ 0. 05-10 mnol/L 抑制劑1-100 mmo I/I 穩定劑1-100 mmol/I 0. 1—100 ml/L0
4.根據權利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述緩沖液為磷酸緩沖液、三羥甲基氨基緩沖液、甘氨酸-NaOH緩沖液、N-2-羥乙基哌嗪-N’ -2-乙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲氨基-2-羥基丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸緩沖液、哌嗪-N，N-雙(2-羥基乙烷磺酸)緩沖液、3-嗎啉-2-羥基丙磺酸鈉緩沖液、3-(N-嗎啡啉)乙磺酸鈉緩沖液、4- (2-羥乙基)哌嗪-1-2-羥基丙磺酸緩沖液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -4- 丁磺酸緩沖液、3-雙(2-羥乙基)氨基-2-羥基丙磺酸緩沖液、3-(環己胺)-2-羥基-I-丙磺酸緩沖液、4- (2-羥乙基)-I-哌嗪丙磺酸緩沖液、3_(環己胺)-1_丙磺酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸緩沖液的一種或幾種。
5.根據權利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述的色原為酚類化合物，和/或苯胺類似物，3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸的一種。
6.根據權利要求5所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述的酚類化合物為2-氯酚，2，4- 二氯苯酚，4-氯酚，2，6- 二氯苯酚中的一種；所述的苯胺類似物為N-乙基-N-(2-羥基-3-丙磺基)間甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)_3_甲基苯胺鈉鹽，N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基1)-3-甲氧基苯胺鈉鹽(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺鈉鹽，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺鈉鹽，N-乙基-N- (3-磺丙基)苯胺鈉鹽，N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺鈉鹽，N- (2-羥基-3-磺丙基)-3 5- 二甲氧基苯胺鈉鹽，N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)_3，5- 二甲基苯胺鈉鹽中的一種。
7.根據權利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述的去干擾劑為亞鐵氰化鉀、高鐵氰化鉀、膽紅素氧化酶中的一種或幾種。
8.根據權利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述的防腐劑為山梨酸鉀、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉、proclin系列防腐劑中的一種或幾種。
9.根據權利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述的穩定劑選自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一種或者幾種。
10.根據權利要求3所述的血清中肌酐的二步酶法測定方法的測定試劑，其特征在于所述的表面活性劑為TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列中一種。
全文摘要
本發明公開一種血清中肌酐的二步酶法測定方法及測定試劑，利用肌酐測定試劑的試劑1中的過氧化氫酶消除內源性肌酸產生的過氧化氫，進而由肌酐測定試劑的試劑2中的過氧化氫酶抑制劑抑制試劑1中的過氧化氫酶，從而測定樣本中肌酐含量。本發明具有可規避以過氧化物酶氧化過氧化氫造成的本底升高、致使檢測結果準確度、精密度不好的優點。
文檔編號G01N21/78GK102721684SQ20121016876
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月24日 優先權日2012年5月24日
發明者沃燕波, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司