肽選擇方法

專利名稱：肽選擇方法
技術領域：
本發明涉及一種用于選擇耐受原性(tolerogenic)肽的方法、由該方法鑒定的肽，及其在疾病治療和/或預防中的應用。本發明還涉及含有多種此類耐受原性肽的藥物組合物。
背景技術：
在適應性免疫應答中，T淋巴細胞能夠識別蛋白抗原的內部表位。抗原呈遞細胞(APC)攝取蛋白抗原，并將其降解成短肽段。肽與細胞內的I類或II類主要組織相容性復合體結合，并被運送到細胞表面。當該肽與MHC分子一同被呈遞到細胞表面時能夠被T細胞識別(通過T細胞受體(TCR))，此時，該肽可作為一種T細胞表位。在對所有自身抗原或外源抗原的適應性免疫應答中，T細胞表位都具有主要作用。通過使用實驗模型已證明了 T細胞表位在過敏性疾病(包括變態反應、自身免疫疾病和移植排異)中的重要作用。用合成的肽(根據T細胞表位的結構)結合佐劑進行注射有可能弓I發炎性或變應性疾病。反之，研究表明，將可溶形式的肽表位給藥有可能導致針對特定肽表位的免疫耐受性。目前已證明，可溶性肽抗原給藥可作為一種抑制疾病的有效方法，用于實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE——多發性硬化癥(MS)的一種模型)(Metzler and Wraith (1993) Int.Tmmunol · 5 :1159-1165 ；Liu and Wraith (1995) Int. Tmmunol · 7 1255-1263 ；Anderton andWraith (1998)Eur. J. Immunol. 28 :1251-1261);以及關節炎、糖尿病和色素層視網膜炎的實驗模型(見上文Anderton and Wraith (1998)的綜述)。此外還可作為進展性EAE疾病的治療手段(上文 Anderton and Wraith (1998))。耐受原性肽在治療或預防疾病中的用途已引起了相當大的關注。原因之一是已發現某些耐受原性表位能夠下調T細胞對相同組織內不同抗原的應答。這種被稱為“旁觀者(bystander)抑制”的現象說明，利用特定的耐受原性肽有可能會誘導針對特定抗原內一種以上表位(優選的是所有表位)以及特定疾病中一種以上抗原的耐受性(上文Andertonand Wraith(1998)) 0這樣就無需對特定疾病中的所有致病性抗原進行鑒定。此外，肽是用于治療的良好選擇，因為其成本相對低廉，并且能夠產生免疫學性質不同的肽類似物。這樣就可以對肽進行修飾，以改變其與MHC或TCR的相互作用。該方法可能存在的問題之一是，研究表明，并不是所有可充當T細胞表位的肽都能夠誘導耐受性。免疫后的髓磷脂堿性蛋白(MBP)肽89-101是一種免疫優勢抗原，并且從引發T細胞活性和誘導EAE方面來看都是一種非常有效的免疫原。但研究表明，當以溶液形式給藥時，這種肽不能誘導耐受性(上文Anderton and Wraith (1998))。在T細胞表位能夠誘導耐受性方面，已針對觀測到的分級結構提出了多種解釋(見上文Anderton and Wraith (1998)的綜述)。具體地說，有人認為肽對MHC的親和力與其耐受原性之間存在相關性(上文Liu and Wraith (1995))，但該觀點與一些觀測結果不吻合。例如，MBP[89-101]能夠以相對較高的親和力與I-As結合，但不具有耐受原性。因而并不能直接預測哪些肽能夠誘導耐受性。如果有一種合理的解釋來說明只有部分肽表位能夠誘導耐受性，則有助于選擇那些能夠有效地用于治療和預防過敏性病癥的耐受原性肽。發明概述本發明人證明，如果一種肽表位具有不經抗原加工即可被未成熟APC呈遞的適當大小，則這種肽表位能夠誘導免疫耐受性。因此，一些T細胞表位具有 耐受原性而其他T細胞表位不能誘導耐受性的觀測結果可由以下事實來加以解釋，即某些表位需經過進一步加工，然后才能夠被MHC分子呈遞。這些需要進一步加工的表位盡管與佐劑協同注射時能夠誘導疾病，但是以可溶形式給藥時不能誘導耐受性。不需要進一步加工的表位則能夠誘導耐受性，本發明人將其命名為“apitopes” (抗原加工非依賴性表位)。該發現為選擇耐受原性T細胞表位提供了一種基于規則的方法，該方法無需對肽的耐受原性能力進行體內檢測。這一點在用于治療或預防無可用動物模型的疾病的策略開發方面具有特別的優勢。甚至對具有動物模型的疾病而言，該選擇方法也會使耐受原性成分的開發更加簡單和安全，因為它提供了一種機制，用于在體內使用之前用人類T細胞(可識別與人類MHC分子結合的抗原)對肽的耐受性誘導能力進行體外測試。第一方面，本發明提供一種用于選擇耐受原性肽的方法，該方法包括選擇一種無需進一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結合的肽的步驟。在一項優選實施方案中，該肽無需進一步加工即能夠與II類MHC分子結合。本領域有多種已知方法可用于篩選能夠充當給定抗原的T細胞表位的肽。因此，本發明的方法通常用于從多種含有T細胞表位的肽中選擇一種耐受原性肽。為了檢測一種肽是否無需進一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結合，可以用抗原加工非依賴性呈遞系統(APIPS)對該肽與I類或II類MHC分子結合的能力進行研究。因此，在一項優選實施方案中，該方法包括以下步驟(i)用一種肽對APIPS進行處理；并且(ii)分析APIPS中該肽與I類或I I類MHC分子的結合。第二方面，本發明提供由本發明第一方面的方法所選擇的肽。該肽可用于疾病的治療和/或預防。具體地說，該肽可用于治療和/或預防由自反應性T細胞介導的疾病。本發明的肽特別適用于治療/預防過敏性反應，如變態反應、自身免疫和移植排異。本發明人已確定了髓磷脂堿性蛋白的多個表位，該蛋白是多發性硬化癥中的一種自身抗原。因此，在一項特別優選的實施方案中，本發明的肽可用于治療和/或預防多發性
硬化癥。已知一些肽能夠誘導針對相同抗原上其他表位的耐受性，甚至可誘導針對不同抗原上其他表位的耐受性(通過被稱為旁觀者抑制的現象)。但本發明人預測，為了充分抑制所有自反應性T細胞，將多種不同的apitopes聯合給藥于患者應該有利于特定疾病的治療/預防。第三方面，本發明本發明提供一種藥物組合物，該組合物含有多種本發明第二方面所描述的肽，每種肽基于一種T細胞表位。第四方面，本發明提供一種方法，用于治療和/或預防主體所患的一種疾病，該方法包括將本發明第二方面所描述的肽給藥于該主體的步驟。治療和/或預防主體所患疾病的一般策略可包括以下步驟(i)確定該疾病的一種抗原；(ii)確定該抗原的一種apitope ;以及(iii)將該apitope給藥于該主體。 附圖簡述圖I顯示多發性硬化癥(MS)患者和健康個體對結核分支桿菌純化蛋白衍生物(PPD)和MBP的動力學曲線的典型實例。對分離自MS患者(A)和正常個體⑶的外周血單核細胞(PBMC)在PB)和全MBP存在情況下的增殖能力進行測試；將反應于MBP的增殖動力學曲線與反應于第二抗原PPD的增殖動力學曲線進行比較。圖2為MS患者中的PBMC對MBP及其肽產生應答的總結表。對某些個體是在三個獨立的時間點進行分析，每個時間點的間隔期約為4-7個月。圖3為健康個體中的PBMC對MBP及MBP肽產生應答的總表。每個時間點的間隔期約為4-7個月。圖4顯示一名MS患者(MS49)的實例，該患者在2個不同的時間點對多種肽產生應答，但在4個月之后測量的第二時間點期間的識別曲線明顯不同。在MBP和一組覆蓋全長MBP的肽存在的條件下培養PBMC，并通過3H-胸苷攝取量來測量增殖。在第一時間點觀測到的廣泛T細胞增殖應答與7個月后(第二時間點)測量的應答明顯不同。圖5顯示一名患者的實例，該患者的廣泛表位應答(第一時間點)可以消退(第二時間點)，而在I 2個月的時間后(第三時間點)重新出現。圖6顯示由動力學應答測定法確定的肽區域精確特異性圖譜，該結果是利用MS患者和健康個體產生的TCC獲得。用于篩選測定的大多數肽的長度為15個氨基酸殘基，但有少數為10個氨基酸殘基，有一種肽為17個氨基酸殘基。每種TCC的特異性至少測試了 2次。圖7a的表顯示髓磷脂堿性蛋白中能夠被MS患者的T淋巴細胞識別的T細胞表位的特性。圖7b的表顯不所有T細胞表位都不是必需被固定APC呈遞，因而不是apitopes。圖8和圖9顯示活體和固定APC將不同MBP肽呈遞至T細胞的情況。圖8A-30-44，圖 8B-110-124,圖 9A-130-144,圖 9B-156-170。

圖10的表顯示在3個獨立時間點獲得的MS患者體內對MBP和MBP-肽的刺激指數
(SI)峰值。第二時間點的樣本是在第一時間點的4-8個月后收集，第三時間點的樣本是在第二時間點的3-5個月后收集。每天測量本底cpm，其變化范圍為80-700cpm ;確定陽性應答(粗體字)的依據是SI > 3并且δ cpm > 1000。(不可能在所有3個時間點收集MS19和MS67的樣本)。圖11的表顯示健康個體對MBP和MBP-肽的刺激指數(SI)峰值。每天測量本底cpm，其變化范圍為80-700cpm;確定陽性應答(粗體字)的依據是SI > 3并且dcpm > 1000。
圖12顯示由DR2 :MBP82_100轉基因小鼠分離的T細胞對APC呈遞77-100區嵌套MBP肽的應答。圖13顯示T細胞克隆MS17 A3對APC呈遞125-148區嵌套MBP肽的應答。圖14顯示MBP 89-101序列中的T細胞表位識別。該序列中有3個不同但又重疊的T細胞表位89-92、92-98和95-101。圖中顯示第94和95位殘基之間可能被天冬酰胺酰肽內切酶(AEP)的作用剪切的位點。
圖15顯示MBP肽87-96⑷和89-101⑶能夠充當apitope，用于T細胞對89-94表位產生應答。發明詳述第一方面，本發明涉及一種用于選擇耐受原性肽的方法。耐受性文中使用的術語“耐受原性”是指能夠誘導耐受性。耐受性是指不對某種抗原產生應答。對自身抗原的耐受性是免疫系統的一個基本特征，當喪失這種耐受性時可導致自身免疫疾病。適應性免疫系統必須保持對大量不同的感染性因子產生應答的能力，同時避免其自有組織中所含自身抗原的自身免疫攻擊。這在很大程度上是由未成熟T淋巴細胞對胸腺中凋亡性細胞死亡的敏感性來控制(中樞耐受性)。但是在胸腺中并不能檢測到所有自身抗原，因而只有自反應性胸腺細胞死亡還不夠。因此，還有一些機制可以使外周組織的自反應性成熟T淋巴細胞獲得耐受性(外周耐受性)。Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169 :123-137)對中樞耐受性和外周耐受性的機制進行了綜述。耐受性的產生或鑒定方法是至少誘導部分CD4+T細胞的無反應性。為了激活T細胞，肽必須與能夠將兩種信號遞送至T細胞的“專職”APC相結合。第一種信號(信號I)由APC細胞表面的MHC-肽復合物遞送，并通過TCR被T細胞接收。第二種信號(信號2)由APC表面的⑶80和⑶86等輔助刺激分子遞送，并被T細胞表面的⑶28接收。當T細胞在缺乏信號2的條件下接收信號I時不會被激活，實際上是成為無反應性T細胞。無反應性T細胞對隨后的抗原誘發具有不應性，并且能抑制其他的免疫應答。無反應性T細胞被認為與介導T細胞耐受性有關。盡管不希望受理論的約束，但本發明人預測，在與MHC分子一同被遞送之前需要加工的肽不能誘導耐受性，因為這些肽必須經過成熟抗原呈遞細胞的處理。成熟抗原呈遞細胞(如巨噬細胞、B細胞和樹突細胞)能夠對抗原進行加工，而且能將信號I和信號2遞送至T細胞，從而導致T細胞激活。反之，apitopes能夠與未成熟APC上的II類MHC結合。因而無需共同刺激即能夠被呈遞至T細胞，從而導致T細胞無反應性和耐受性。當然，apitopes也能夠與成熟APC細胞表面的MHC分子結合。但免疫系統中包含未成熟APC的充裕程度要高于成熟APC (研究表明，被激活的樹突細胞還不到10 %，Summerset al. (2001) Am. J. Pathol. 159 :285-295)。因此，apitope 的默認狀況是無反應性 / 耐受性，而不是激活。研究表明，當通過肽吸入來誘導耐受性時，抗原特異性CD4+T細胞的增殖能力下降。此外，這些細胞的IL-2、IFN-Y和IL-4產量被下調，但IL-10的產量提高。研究表明，在處于肽誘導耐受性狀態的小鼠中，IL-10的中和使小鼠完全恢復了對疾病的易感性。人們認為，有一種始終處于耐受狀態的調節細胞群能夠產生IL-10，并介導免疫調控(Burkhartet al(1999)Int. Tmmunol. 11 1625-1634)。因此，可通過多種技術對耐受性的誘導進行監測，其中包括(a)對該肽在體內充當靶表位的疾病而言，降低接觸該疾病的易感性；(b) CD4+T細胞無反應性的誘導(可通過隨后的抗原侵襲來進行體外檢測)；(c)⑶4+T細胞群的改變，包括(i)增殖能力降低；
(ii) IL-2、IFN- Y 和 IL-4 產量的下調；以及(iii) IL-IO 產量提高。抗原加工非依賴性表位(APITOPES)本發明所述方法的步驟包括，選擇一種無需進一步加工即能夠與I類或II類MHC蛋白結合的肽。這些肽在文中被稱為“apitopes”(抗原加工非依賴性表位)。對來源于給定抗原的肽的細胞表面呈遞并不是隨機的，并且傾向于由少量經常出現的表位占優勢。特定肽的優勢取決于多種因素，例如與MHC分子結合的相對親和力、在APC內產生的時空點以及抗降解能力。抗原的表位分級結構可以隨免疫應答的進行而發生改變，這為自身耐受性和自身免疫疾病提供了重要的線索。免疫優勢決定區可能是良好的耐受原。因此，在一項優選實施方案中，本發明的apitope是基于一種優勢表位。但是在對免疫優勢肽產生初次免疫應答后，可能出現表位“擴展”至亞優勢決定簇的現象(Lehmann et al (1992) Nature 358:155-157)。亞優勢表位的呈遞可能對觸發自身免疫具有重要作用。因此，本發明的apitope可基于一種亞優勢決定簇。對所有給定抗原而言，也可能存在隱蔽表位。隱蔽表位是指那些以肽的形式給藥時能夠刺激T細胞應答，但是以完整抗原的形式給藥時不能產生這種應答的表位。在APC將抗原加工成肽的過程中，隱蔽表位可能被破壞。本發明人已證明，MBP的肽92-98是一種隱蔽表位(實施例2C)。有趣的是，在該肽區域內推測含有一個天冬酰胺酰肽內切酶剪切位點，這可能意味著APC在天然加工過程中沒有產生含有該區域的肽。隱蔽表位可作為一種體外apitope,因為它無需進一步加工即能夠與MHC分子結合，并在識別該隱蔽表位的T細胞中誘導無反應性。但這種表位不可能應用于治療，因為它不能夠耐受可識別該抗原的天然加工表位的T細胞。抗原表位的鑒定方法可以是，測量T細胞對APC呈遞的覆蓋整個抗原的重疊肽(見下文)的應答。這些研究通常是獲得肽“嵌套組”，通過測量對截短肽的應答即可確定特定T細胞系/克隆的最小表位。并不能認為抗原的最小表位會具有apitope的作用。很可能最小表位的側翼氨基酸是與MHC最佳結合所必需的。設計apitope時應考慮到不同T細胞克隆的最小表位之間存在細微差別的可能性。應該強調的是，可能無法確定所有表位的apitope。一個明顯的證據是，有些表位是以依賴于內體中的MHC負載方式與MHC結合，因而需要加工(Viner et al. (1995)Proc.Natl. Acad. Sci. 92 =2214-2218)。這也是不能認為每種最小表位都必然具有apitope作用的另一原因。鑒定含有T細胞表位的肽
本領域有多種已知方法可用于鑒定給定抗原中的T細胞表位。鑒定天然加工表位的方法可以是，對來源于帶有抗原的APC的肽進行質譜分析。這些APC已經過處理而促進其攝取抗原，或是已通過轉化適當基因而迫使其在細胞內產生該蛋白。通常是將APC與溶液中的或是適當定向于APC細胞表面的蛋白共保溫。37°C保溫之后，在去污劑中將細胞裂解，并通過諸如親和層析法將II類蛋白純化。用適當的化學介質(如酸性條件)對純化MHC進行處理，從而將肽由MHC洗脫。分離出這種肽合并物，并將其曲線與來自相同方式處理的對照APC的肽進行比較。對蛋白表達/飼養細胞獨特的峰進行分析(例如用質譜法)，并對這些肽段進行鑒定。利用該方法一般可獲得關于肽段抗原經抗原呈遞而產生的肽的范圍信息(通常出現在“嵌套組”中)。鑒定表位的另一種方法是通過體外測定對重疊并且覆蓋該抗 原全長的合成肽庫進行篩選。例如，可以使用長度為15個氨基酸并且有5或10個氨基酸重疊的一些肽。用含有抗原呈遞細胞和T細胞的抗原呈遞系統對這些肽進行測試。例如，該抗原呈遞系統可以是鼠脾細胞制品、人類扁桃體細胞制品或PBMC。作為選擇，該抗原呈遞系統還可含有特定的T細胞系/克隆和/或特定類型的抗原呈遞細胞。T細胞激活可通過T細胞增殖(例如用3H-胸苷摻入法)或細胞因子產量來加以測定。舉例來說，THl型⑶4+T細胞的激活可通過IFN Y產量來檢測，其檢測可采用標準的技術，如ELISP0T測定法。對重疊肽的研究一般會指明抗原中的表位定位區域。然后可測量對截短肽的應答，以評定特定T細胞的最小表位。舉例來說，如果對重疊庫中含有第1-15位殘基的肽產生了應答，則可以用兩端截短的肽組(即1-14、1-13、1-12等和2-15、3-15、4-15等)來確定最小表位。本發明人認為，通過體外測定(特別是利用T細胞系)對抗原免疫優勢區進行檢測的方法會產生不對稱的肽活性模式。實施例中描述的用于確定MBP表位的研究是采用動力學應答測定法，該方法是測量由MS患者和健康個體獲得的PBMC在重疊肽庫作用下的增殖。該方法的依據是，盡管由健康個體和MS患者獲得的T細胞對純化蛋白抗原的應答方式類似，但它們對基于MBP序列的肽的應答方式不同。與正常的健康供體相比，由MS患者獲得的T細胞對肽抗原的應答具有更高的數量級和更快的動力學速度。因而能夠篩選和鑒定使特定患者在特定時間產生應答的表位。在本文描述的研究中，該方法已揭示了利用常規技術未能確定的大量含有表位的區域。此外，該研究還說明，T細胞識別可表現為一種循環模式，在某一時間點出現，消退，繼而在后一時期重新出現。本發明人描述的動力學測定法可作為一種重要的工具，因為該方法可揭示患者在特定時間正在應答的表位。該信息可用于為特定患者量身定制一種將apitope給藥的治療方法，即確定相關表位的apitope (如果存在)，并將其給藥。該信息還可用于擬定疾病的一般發展模式，從而可以對治療性組合物進行設計，使其含有與可能在疾病的特定時期呈遞的表位相對應的apitope。抗原加工非依賴性呈遞系統(APIPS)一旦確定了表位，下一步是要檢測其是否也具有apitope的作用。apitope必須在無需抗原加工的條件下被呈遞至T細胞。在確定了含有T細胞表位的肽之后，可以用一種無加工系統來確定apitope。可以用抗原加工非依賴性呈遞系統(APIPS)對截短肽和肽類似物的激活作用進行測試。APIPS的實例包括a)固定的APC (含有或不含抗⑶28抗體)；b)含有I類或II類MHC分子的脂質膜(含有或不含抗CD28抗體)；以及c)結合于平板的純化的天然或重組MHC (含有或不含抗⑶28 抗體)。已知可以用固定的APC來研究T細胞應答，例如在檢測多肽的最小表位的研究中，可以測量對截短肽的應答(Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8 :1035-1043)。APC 的固定可采用，例如，甲醛(通常是多聚甲醛)或戊二醛。脂質膜(可以是平面膜或脂質體)的制備可采用人工脂，也可以是APC的質膜/微粒體組分。在使用時，可以將APIPS添加到組織培養板的孔中。然后添加肽抗原，并添加選定的T細胞系或克隆，以檢測該肽與APIPS的MHC部分的結合。T細胞系或克隆的激活可通過本領域已知的任何方法來測定，如3H-胸苷摻入法或細胞因子分泌法。肽本發明的第二方面涉及一種肽。從正常意義上來說，術語“肽”是指一連串殘基，通常是L-氨基酸，這些殘基一般是通過相鄰氨基酸的α-氨基和羧基之間的肽鍵相繼連接。該術語還包括修飾的肽和合成的肽類似物。本發明的肽可以是無需進一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結合的任何長度。與I類MHC分子結合的肽的長度一般為7-13個氨基酸，更常見的是8_10個氨基酸。該肽的兩個末端可通過肽主鏈原子與所有I類MHC分子的肽結合溝不變位點之間的接觸而使其結合保持穩定。在肽結合溝的兩端均有與肽氨基端和羧基端結合的不變位點。通過肽骨架的扭曲可以適應不同的肽長度，這種扭曲通常出現在能夠滿足所需柔性的脯氨酸殘基或甘氨酸殘基。與II類MHC分子結合的肽的長度一般為8-20個氨基酸，更常見的是10_17個氨基酸，并且還可以長得多。這些肽沿著兩端開口的(與I類MHC肽結合溝不同)I I類MHC肽結合溝以伸展的構象存在。該肽主要是通過主鏈原子與沿著肽結合溝排列的保守殘基的接觸而保持在適當的位置。本發明的肽可通過化學方法來制備(《肽化學實踐手冊》Mikos Bodansky,Springer-Verlag, Berlin)。舉例來說，肽的合成方法可以是固相技術(Roberge JY etal (1995) Science 269 :202-204)，從樹脂上裂解，并通過制備性高效液相色譜進行純化(如 Creighton(1983)蛋白質結構和分子原理，WH Freeman and Co, New York NY)。還可以用，例如，ABI 431A肽合成儀(Perkin Elmer)根據廠商提供的說明來實現自動合成。作為選擇，還可采用重組方法或從較長多肽上剪切的方法來制備肽。例如，可采用從靶抗原上剪切的方法來獲得肽。肽的成分可通過氨基酸分析或測序(如Edman降解法)來加以確認。在一項優選實施方案中，該肽來源于一種靶抗原。靶抗原是指能夠在疾病過程中被APC加工并被T細胞識別的一種分子(如蛋白或糖蛋白)。當然，靶抗原應取決于目標疾病。優選的是該肽來源于一種通過APC對該抗原的天然加工而產生的抗原片段。出于實際應用的目的，該肽還應具有其他多種特性。例如，該肽應能夠以允許體內應用的濃度溶解。優選的是該肽能夠以最高達O. 5mg/ml的濃度溶解，更優選的是該肽能夠以高達lmg/ml的濃度溶解，最優選的是該肽能夠以高達5mg/ml的濃度溶解。就鼻內給藥而言，可通過當前方法被吸收的最大體積劑量約為每個鼻孔200 μ I。如果該肽能夠以lmg/ml的濃度溶解,則每個鼻孔使用加倍劑量時,可將800μ g給藥于患者。在任何單一劑量中給藥超過5mg的情況并不常見。 該肽在體內的穩定性也很重要，這種穩定性應足以將其應用于治療。本發明人發現，在體內條件下，給藥后30分鐘的測試肽總量降至約50%，給藥后4小時的量降至約30%，但5天后仍能夠檢測到這種肽(約5% )。該肽的體內半衰期至少應為10分鐘，優選的是至少30分鐘，更優選的是至少4小時，最優選的是至少24小時。本發明人發現，經鼻內給藥后，引流淋巴結中的肽量峰值出現在給藥后約4小時，但在5天后仍能夠檢測到該肽(水平約為最大值的5% )。優選的是該肽具有足夠的穩定性，使其在引流淋巴結中以治療活性濃度存在的時間足以發揮其療效。此外，該肽應在體內表現出良好的生物利用度。該肽還應在體內保持一種使其能夠與細胞表面MHC分子無障礙結合的構象。目標疾病在一項實施方案中，本發明第二方面所描述的肽可用于疾病的治療和/或預防。II類MHC的apitope可能特別適用于由⑶4+T細胞應答介導的疾病。例如，由不適當的或過量的CD4+T細胞應答導致或維持的疾病。這種肽可能特別適用于過敏性病癥的治療。過敏性反應包括(i)由針對無毒外源物的不適當應答導致的變態反應；(ii)由針對自身組織抗原的應答導致的自身免疫疾病；以及(iii)由針對移植物的應答導致的移植排異。變態反應的實例包括，但不局限于枯草熱、外源性哮喘、昆蟲咬傷及刺傷變態反應、食物及藥物變態反應、變應性鼻炎、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、過敏性綜合征、蕁麻疹、血管性水腫、特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、結節性紅斑、多形紅斑、Stevens-Johnson綜合征、鼻結膜炎、結膜炎、皮膚壞死性微靜脈炎、炎性肺病和大皰性皮膚病。自身免疫疾病的實例包括，但不局限于類風濕性關節炎(RA)、重癥肌無力(MG)、多發性硬化癥(MS)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性色素層視網膜炎、多發性肌炎和某些類型的糖尿病、系統性血管炎、多發性肌炎-皮肌炎、系統性硬化病(硬皮病)、Sjogren病、強直性脊柱炎和相關的脊柱關節病、風濕熱、過敏性肺炎、變應性支氣管肺部曲霉病、無機灰塵致塵肺、結節病、自身免疫性溶血性貧血、免疫性血小板病癥、諸如冷沉纖維蛋白原血癥等寒冷病，以及自身免疫性多內分泌腺病。在臨床醫學中，通常可以對多種組織進行移植，其中包括腎、肝、心肺、皮膚、角膜和骨髓。目前，除角膜以外的所有移植以及某些骨髓移植通常都需要長期的免疫抑制。在本發明該方面的一項實施方案中，可以將肽用于糖尿病的治療和/或預防。該實施方案中的這種肽可來源于靶抗原IA2。
在本發明該方面的另一項實施方案中，可以將肽用于多發性硬化癥(MS)的治療和/或預防。多發性硬化癥(MS)是一種慢性炎性疾病，其特征是整個CNS白質中散布有多處脫髓鞘性病變，該疾病可以在不同部位和不同時間出現(McFarlin and McFarland, 1982New England J. Medicine 307 :1183-1188 和 1246-1251)。MS 被認為是由自反應性 T 細胞介導的。該實施方案中的肽可來源于一種自身抗原，具體地說，是髓磷脂堿性蛋白(MBP)或蛋白脂質蛋白(PLP)。MBP可能比PLP更合適，因為PLP具有強疏水性，來源于該蛋白的肽傾向于凝集在一起。MBP具有免疫原性，并且MBP特異性T淋巴細胞在動物體內具有致腦炎活性(Segal et al. , 1994 J. Neuroimmunol. 51 :7-19 ； Voskuhl et al. , 1993J. Neuroimmuno142 187-192 ；ZamviI et al. ,1985 Nature 317 :355-8)。在一項優選實施方案中，使用的肽來源于MBP的免疫優勢區之一，即1_24、30-54、75-99、90-114、105-129、120-144、135-159 和 150-170。在一項特別優選的實施方案中，使用的肽選自本發明人證明可充當apitopes的MBP 肽，其中包括以下的肽:30-44、80-94、83-99、81-95、82-96、83-97、84-98、110-124、130-144、131-145、132-146 和 133-147。I類MHC的apitopes可用于，例如，以耐受原性方式對抗病毒性⑶8+應答進行修飾。藥物組合物本發明人認為，盡管存在“旁觀者抑制”，但為了有效地誘導耐受性，還是必需以多種不同的T細胞克隆為目標。因此，為了預防或治療疾病，可以將多種肽給藥于個體。第三方面，本發明涉及含有多種apitopes的一種藥物組合物。該藥物組合物可含有,例如，2-50種apitopes,優選的是2_15種apitopes。這些apitopes可來源于相同或不同的祀抗原。優選的是這些apitopes都無需進一步加工即能夠與I類MHC結合，或都無需進一步加工即能夠與II類MHC結合。在一項優選實施方案中，該藥物組合物中的所有apitopes都無需進一步加工即能夠與I類或II類MHC結合。該藥物組合物可采用試劑盒的形式，其中單獨提供了用于同時、單獨或序貫給藥的一些或所有apitopes。作為選擇(或除此之外)，如果要以多劑量方式將該藥物組合物(或其任意部分)給藥，可以將每劑單獨包裝。該藥物組合物可含有治療有效劑量或預防有效劑量的一種或所有apitope，并且可選擇性地含有一種藥學容許的載劑、稀釋劑或賦形劑。此外，在本發明的藥物組合物中，可以將一種或每種apitope與任何適當的一種或多種粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、涂布劑或增溶劑相混合。給藥在不使用佐劑的情況下，本發明的肽應以溶液形式給藥。優選的是通過粘膜將肽給藥。研究表明，當以溶液形式進行腹膜內(i.p·)、靜脈內(i.v.)或鼻內(i.n.)給藥時，肽可以誘導T細胞耐受性(上文Anderton and Wraith (1998)；上文Liu andWraith(1995) ；Metzler and Wraith(1999)Immunology 97 :257-263)。
優選的是將肽進行鼻內給藥。用小鼠進行的研究表明，誘導耐受性所需的肽給藥持續時間取決于接受者的T細胞前體頻率(上文Burkhart et al (1999))。許多實驗的研究結果表明，誘導耐受性需要將肽進行重復給藥(上文Burkhart et al (1999))。因此，肽的確切劑量和給藥次數應取決于個體，但在優選實施方案中是進行多次給藥。如果同時將多種肽給藥，這些肽可采用適合于單次或多次給藥的“混合物”形式。作為選擇，優選的是進行多次給藥，但每次給藥的肽相對濃度不同。在一項優選實施方案中，可以采用“劑量遞増”法，也就是以遞增的濃度對患者進行多次給藥。該方法已用于，例如，對蜂毒變態反應的免疫治療應用中的磷脂酶A2肽給藥(Miiller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101 :747-75 4 和 Akdis et al (1998)J.Clin. Invest. 102 :98-106)。
實施例以下實施例用于對本發明進行說明，但不應被認為是本發明的限制。本發明尤其涉及這些實施例中描述的特別實施方案。實施例I——確定MBP中的T細胞表位材料與方法抗原按Deibler et al. (Deibler et al. ,1972制備生物化學2 :139)的描述由腦白質制備人MBP，并通過SDS-PAGE確定其純度。増殖測定是以前人確定的最佳濃度用MBP和結核分支桿菌純化蛋白衍生物(PPD)來進行(UK central Veterinary Laboratory, Surrey)；姆種抗原的最佳濃度為50 V- g/mlo利用標準的F-moc化學劑在Abimed AMS422多重肽合成儀(Abimed, Langenfeld, German)上合成一組覆蓋全MBP分子的含15個殘基的重疊肽。每種肽有5個氨基酸殘基被替換，有10個氨基酸殘基重疊。我們產生了 33種肽，其合并成3組,并以50 ii g/ml的最佳濃度對合并物進行測試，以使姆種肽的體外濃度為16. 6 u g/ml。患者和對照主體該項研究的主體包括12名臨床確診或實驗室確定為MS的患者(Poser et al.，1983)，年齡為29-51歲。12名患者中的8名參與P -干擾素試驗，而其他所有MS患者在該研究開始前至少3個月內未接受任何皮質類固醇治療。對照組包括13名健康個體，年齡為25-55歲，并且在取血樣前至少3個月內均未接受任何免疫抑制治療。組織培養基使用的組織培養基為補加20mM HEPES(Sigma,Poole,UK)、青霉素(100U/ml)、硫酸鏈霉素(100mg/ml)和 4mM L-谷氨酸胺(均購于 Life Technologies, Paisley, Scotland)的RPMI-1640培養基。淋巴樣細胞和TCL的清洗采用無血清培養基。在所有培養條件和測定中，使用的培養基均添加10%熱滅活的自體血漿。培養條件和T細胞增殖測定在獲得被告知的書面同意之后，通過靜脈穿刺從每個主體中收集檸檬酸化周圍血(50-100ml)。通過Histopaque-1077 (Sigma, Poole, UK)上的密度離心從血液中分離周圍血單核細胞(PBMC)，并以I. 5ml體積和IxlO6細胞/ml的濃度培養在含有PPD、MBP或MBP肽的24孔組織培養板上(Nunc International, Costar)。在5% C02/95*%空氣的潮濕環境中將板37°C保溫。在第5和第14天之間，從每種培養物中吸取2份100 u I的試樣，轉移到96 孔圓底微量滴定板中，并用 0. 4 u Ci 的[3H]胸苷(Amersham International, Amersham,UK)進行脈沖標記。18 小時后，用 Machlll 收集器 96(Tomtec,Orange,New Jersey,USA)將細胞收集在玻璃纖維墊上(LKB-Wallac, Turku, Finland)。用Microbeta液體閃爍計數器(LKB-Wallac)進行胸苷量摻入測定。當S cpm > 1000，并且刺激指數(SI) > 3時，含有抗原的測試孔被認為是陽性結果，其中SI =含抗原培養物CPM/無抗原培養物CPM。T細胞系和T細胞克隆的產生MBP特異性T細胞系(TCL)產生于8名MS患者和2名健康對照供體。按上文所述由每個主體分離PBMC，并在MBP存在(50 u g/ml)的條件下以IxlO6細胞/ml 的濃度鋪在6孔板中；將每個主體的部分PBMC進行常規冷凍和保存，用于隨后的再刺激。7天后，用含有2% IL-2 (Lymphocult-HT ；Biotest LTD. , Birmingham, UK)的新鮮培養基培養細胞，并在培養的第12天用抗原對所有細胞進行再刺激，抗原為IL-2以及作為抗原呈遞細胞(APC)的經過照射(2500Rad)的自體PBMC，細胞比率為IT細胞5APC。每3_4天在IL-2中擴增細胞，并在第14天如上文所述用抗原IL-2和PBMC進行再刺激。在首次再刺激時，檢測細胞對MBP的特異性増殖。簡單地說，是在MBP存在的條件下將2xl04個T細胞和IxlO5個經過照射的自體PBMC培養在96孔圓底平板中，一式三份。將細胞培養2天，并用0. 4 ii Ci/孔的[3H]胸苷進行18個小時的脈沖標記。然后如上所述收集細胞，6 cpm > 1000并且SI >3的TCL被認為具有MBP特異性。進行3次再刺激/擴增循環之后，在作為APC的經過照射的自體PBMC存在的條件下，用PHA(Sigma，Poole，Dorset，UK)將TCL克隆。在有限稀釋條件下以0. I細胞/孔、0.3細胞/孔和I細胞/孔的濃度將T細胞鋪板，并培養在含有IxlO4個經過照射的PBMC、5 ii g/ml PHA和2% IL-2的Terasaki平板中。10-12天后，將陽性生長細胞擴增到含有IxlO5個經過照射的PBMC、5 ii g/ml PHA和IL-2的96孔圓底平板中。3天后，添加含有IL-2的新鮮培養基，第7天時，將克隆擴增到含有5x105個經過照射的PBMC、PHA和IL-2的48孔板中；此時利用增殖測定法檢測克隆對MBP的特異性應答。I周后，用含有PHA或Dynabeads (Dynal，UK)以及IL-2的IxlO6個經過照射的PBMC將MBP特異性克隆擴增到24孔板中。基本按上文所述用7-10天的再刺激/擴增循環將克隆維持在24孔板中。按上文所述用增殖測定法檢測T細胞克隆(TCC)對ー組MBP肽的識別能力。結果在MS患者和健康個體中的MBP-肽識別本發明人利用動力學應答測定法檢測了 MS患者及健康個體的PBMC對覆蓋全長人MBP的ー組含有15個殘基的合成肽的應答能力。對來自各培養物的PBMC的增殖應答測定是在2周時間內分5個時間點進行，并且將MBP和肽的應答動力學曲線與PH)的應答進行比較，后者代表ー種次級應答/記憶抗原。在PBMC對MBP和/或肽的應答方面，P干擾素組患者與未處理組患者之間沒有發現明顯的差別(數據未顯示)。MS患者和健康對照對MBP的應答峰均遲于對PH)的應答，因而符合非記憶抗原應答的動力學特征。圖I顯示MS患者和健康個體對pro和MBP的動力學曲線的典型實例。如圖2所示，能夠被MS患者最普遍識別的兩種肽為90-114和75_99(各有6/12患者)，然后是區域 30-54、135-159 和 150-170 (5/12 患者)，以及 1-24 和 105-129 (4/12 患者)。有3名患者對aa 15-39和120-144產生應答。有2名患者識別45-69，沒有一名患者對區域60-84產生應答。根據圖10，當所有患者都呈HLA-DR2陽性吋，能夠被MS患者最普遍識別的兩種肽為 90-114 和 75-99(各有 6/11 患者)，然后是區域 120-144、135-159 和 150-170(5/12 患者)，以及1-24、15-39、30-54和105-129(4/11患者)。有3名患者對aa 45-69產生應答，并且仍沒有一名MS患者對區域60-84產生應答。相比之下，能夠被健康個體識別的肽要少得多，只有2名對照 主體對2種以上的肽產生應答(C和J ;圖3)。只有C和J這2名對照個體識別aa 60-84,該區域在該組的患者中未被識別。有趣的是，這2名個體均表達DRB1*0701等位基因。所有健康供體均不能識別區域45-69和105-129，而識別75-99和150-170的健康個體有4名；識別135-159的健康個體有3名；識別1-24、30-54、60-84和120-144的健康個體有2名；識別15-39和90-114的個體有I名。總體上，有8/13的健康個體對所有重疊肽均不產生應答，而始終不識別MBP肽的MS患者只有1/12 (MS19)。值得注意的是，該患者是唯一不對MBP肽產生應答的患者。圖11也顯示健康個體對MBP肽的應答。在該研究中，只有I名對照主體對2種以上的肽產生應答(Nil)。Nll也是識別aa 60-84的唯一個體，該區域在該組的患者中未被識別。所有健康供體均不能識別區域15-39、45-69和105-129，而識別120-144和135-159的健康個體有2名；識別1-24、30-54、60-84、75-99、90-114和150-170的個體有I名。總體上，有9/12的健康個體對所有重疊肽均不產生應答。總的來說，在對MBP和/或肽產生應答的峰值出現時間方面，健康個體與患者之間沒有明顯的差別，并且這兩組的動力學曲線均類似于初級抗原應答。此外，在對MBP和肽的應答強度方面，患者和健康個體之間沒有差別。對MBP-肽的識別隨時間而改變在確定MS患者能夠對廣泛類型的MBP肽產生應答之后，本發明人決定檢測相同個體中的PBMC識別是否集中在大約4-12個月的時間內并保持穩定。如圖2、圖10和圖3所示，MS患者和健康個體均未表現出相同的肽識別模式。圖4顯示一名MS患者(MS49)的實例，該患者在2個不同的時間點對多種肽產生應答，但在4個月之后測量的第二時間點期間的識別曲線明顯不同。也就是說，在第二次動力學測定中，PBMC仍保持對aa 15-39,30-54和150-170的應答，但是對75-99和105-129的應答消退，并且改變成對90-114和135-159的應答。圖5(MS60)顯示一名患者的實例，該患者的主要表位應答在4個月的時間內消退成ー種集中應答。第二次測試的健康個體未對任何肽產生應答(圖3)。總的來說,這些結果說明MS患者未能表現出固定的識別模式。如MS49患者所示，在每名患者中，PBMC對幾種肽的應答可以保持、消退，以及改變成對MBP新區域的應答。肽識別循環當在12個月的時間內分3個或更多個不同時間點分析PBMC對肽的應答時，可以發現某些患者中的表位識別表現為波動起伏，而不是不可逆地改變成對新肽區域的應答。舉例來說，如圖2和圖10所示，患者MS60對aa 120-144和135-159的識別表現為ー種循環模式；也就是在第一測試時間點時，在眾多被識別的區域中包括殘基120-144和135-159，在第二時間點時，對這2個區域的應答消退，而在4個月后的第三測試時間點時重新出現。與此類似，患者MS41的動力學曲線表明，對aa 135-159的識別在幾個時間點的過程中表現為波動起伏(見圖2和圖10)。在健康對照組中(圖3)，有I名個體(M)對區域75-99和135-159的應答表現為波動起伏，另I名個體(F)在3次分析時間點中有2次表現為能夠識別區域75-99，還有I名個體(D)對殘基15-39的應答表現為循環模式。MBP應答的精確制圖由8名MS患者和2名健康個體獲得TCC，并用于闡明在動力學應答測定中確定的肽區域的精確特異性。各TCC特異性的測試方法是檢測其對含有15個殘基的一組肽的增殖應答。克隆SD A7識別區域1-24，而在該區域中，該TCC對aa 5-19產生應 答。識別區域30-54的有4種克隆(MS49 :D3、MS49 :C8、MS49 :A8、MS49 B6)，而該區域中的表位為30-44。有一種來自MS患者的克隆(MS39 D7)能夠識別肽60-74，有趣的是，在我們的動力學應答測定中，有I名健康個體對該區域(60-84)產生應答。有5種克隆(MS43 :A7、MS41 B6、MS41 :A2、MS41 :C6、N5 :8)能夠識別含有區域75-99的aa 83-99。一名患者產生了對aa 110-124具有特異性的TCC(MS60 :A2、MS60 :B3)，該區域包含在105-129合并物中，該患者產生的另ー種TCC對120-144區域中包含的130-144具有特異性(MS60 E1)。有5名個體產生了能夠識別區域135-159中所含表位的克隆MS60 :F7、MS60 :D1、MS59 F1和N5 :19可識別aa 140-154 ；MS57 A1對140-149具有特異性，而TCC MS17 A3能夠對序列130-144產生應答。該組克隆清楚地說明，在MBP的135-159區域中至少存在2種T細胞表位。最后，區域150-170能夠被2種對aa 156-169具有特異性的克隆識別。所有TCC的特異性總結于圖6。實施例2-確定MBP中的apitopes材料與方法利用APIPS講行抗原旱遞測定將肽呈遞至T細胞克隆的檢測是利用増殖方法來進行。在0.5%多聚甲醛中將APC固定，并以IxlO5細胞/孔的濃度鋪在96孔組織培養板中。以2xl04細胞/孔的濃度將T細胞克隆鋪在含有含有不同濃度肽的板中。37°C培育48小時，然后利用16-20小時的[3H]胸苷摻入方法進行増殖測定。將結果與T細胞對或APC呈遞的表位產生應答的能力進行比較。將肽呈遞至由DR2 :MBP82-100轉基因小鼠分離的T細胞的測定方法基本如上文所述，只是APC的鋪板濃度為5x10s細胞/孔，T細胞的鋪板濃度為IxlO5細胞/孔，并且在添加[3H]胸苷之前培育72小吋。益里該實驗可檢測上述實施例中確定為表位的肽被APIPS呈遞的能力。結果顯示于圖7b。在目前已檢測的5種表位中，發現有4種是apitopes (30-44、80-94、110-124和130-144)，有I種可作為表位，但不能作為apitope (156-170)。實施例2A-對 MBP 肽 30-44、110-124、130-144 和 156-170 的研究為了研究多種MBP肽是否為apitopes，對這些肽被固定的APC呈遞至T細胞的能カ進行檢測。在含有肽的血清或只在血清中將活體的或預脈沖標記的Mgar (HLA-DR2+ve)細胞進行3. 5小時的預脈沖標記。然后將過量的肽去除，并添加適當的T細胞克隆。利用[3H]胸苷攝取方法檢測T細胞的增殖應答。如圖8和圖9所示，肽30-44(圖8A)、110-124(圖8B)和130-144(圖9A)無需進ー步加工即可被固定的APC呈遞。因此，這些肽被確定為apitopes。另ー方面， 肽156-170需要進ー步加工才可被呈遞至T細胞(圖9B)。固定的APC不能將該表位呈遞至T細胞，因而 156-170 不是一種 apitope。實施例2B-確定 MBP 區域 77-100 和 125-148 中的 apitopes對任何給定的表位而言，都可能存在一種或多種無需進ー步加工即可被呈遞至APC的apitopes。對兩種MBP區域內的apitopes存在情況進行檢測，方法是在含有MBP區域77-100(圖12)和區域125-148(圖13)的重疊肽的血清或只在血清中培育活體的或多聚甲醛固定的Mgar(HLA-DR2+ve)細胞。培育72小時(圖12)或48小時(圖13)后，添加T細胞，并利用[3H]胸苷攝取方法檢測T細胞的增殖應答。用于MBP77-100的T細胞分離自DR2 =MBP 82-100轉基因小鼠，用于MBP130-144的是T細胞克隆MS17 :A3。在MBP區域77-100中，以下的肽被確定為apitopes MBP 83-99ENPVVHFFKNIVTPRTPMBP 80-94TQDENPVVHFFKNIVMBP 81-95QDENPVVHFFKNIVTMBP 82-96DENPVVHFFKNIVTPMBP 83-97ENPVVHFFKNIVTPRMBP 84-98MPVVHFFKNIVTPRT能夠被來源于DR2 MBP 82-100轉基因小鼠的T細胞識別的最小MBP序列為區域85-94。在MBP區域125-148中，以下的肽被確定為apitopes MBP 130-144RASDYKSAHKGFKGVMBP I3I-I45ASDYKSAHKGFKGVDMBP 132-146SDYKSAHKGFKGVDAMBP 133-147DYKSAHKGFKGVDAQ能夠被T細胞克隆MS17 A3識別的最小MBP序列為區域133-144。實施例2C——對MBP區域89-101的研究本發明人此前發現，與其他髓磷脂T細胞表位不同的是，以可溶形式將肽89-101給藥不能防止小鼠被完整髓磷脂或肽89-101本身誘導產生實驗性自身免疫性腦脊髄炎(EAE) (Anderton and Wraith(1998)Eur. J. Immunol. 28 :1251)。MBP 89-101含有3個T細胞表位為了研究T細胞對MBP區域81-111的反應性，在體外用81-111刺激已被81-111致敏的小鼠淋巴結細胞，并用覆蓋81-111區域且依次錯位2個殘基的ー組含有10個殘基的重疊肽(即:81-90、83-92、85-94、87-96、89-98、91-100、93-102、95-104、97-106、99-108和101-111)對這些細胞進行測試。對覆蓋89-101的肽的應答模式說明，有5種相鄰的肽(N端87-96至95-104)具有刺激能力，這表明至少存在2種(可能是3種)不同的表位。為了對該區域做進ー步研究，由最初的81-111應答性T細胞系產生了 3種亞細胞系，并用覆蓋84-106區域且依次錯位I個殘基的ー組含有10個殘基的重疊肽對這些細胞系再次進行測試。結果說明89-101序列中存在3種不同但又重疊的T細胞表位89-94、92-98 和 95-101(見圖 14)。MBP妝92-98是一種隱蔽表位當測試對89-101肽和整個重組MBP的反應性時，這3種表位特異性T細胞系(TCL)表現出十分有趣的差異。所有3種TCL都能夠對肽(89-101)產生應答，但只有89-94特異性TCL和95-101特異性TCL能夠對完整的MBP產生應答。這說明完整MBP的抗原加工優先產生89-94識別性T細胞和95-101識別性T細胞的配體，而不產生 92-98識別性T細胞的配體。這表明92-98表位是隱蔽的(即不能通過天然抗原加工產生)。MBP的89-101肽似乎能參與3種不同的與MHC分子的相互作用，從而產生被3種獨立T細胞群識別的肽/MHC配體。但是對MBP的加工只產生被其中2種T細胞群識別的配體(見圖14)。誘導EAE要求T細胞能夠識別CNS中由于完整MBP降解而表達的自身抗原性表位。用只含有上述3種T細胞表位之一的肽對小鼠進行免疫的結果說明，只有包含天然加工表位(89-94或95-101)的肽才能夠誘導EAE。這進ー步支持92-98為隱蔽表位的結果。MBP At 92-98 是 MBP 區域 89-101 的優勢表位如上所述，區域89-101含有3種不同但又重疊的肽。其中，肽92-98似乎在該區域占有優勢。例如，當由98-101肽致敏的小鼠產生T細胞克隆時，產生的所有6種克隆都能夠對92-98產生應答。通過使用在每個位置含有單個丙氨酸取代的89-101肽類似物，發現將92-98的任一位置取代都會導致應答性喪失，這說明92-98核心中任何殘基的改變都會對該表位的識別產生總體上的影響。MBP肽89-101不能使識別天然加工MBP表位的EAE相關T細胞獲得耐受件總之，本發明人發現a) 89-101序列有可能產生3種T細胞表位；b)對完整MBP的抗原加工(包括體內和體外)只能產生其中的2種表位(89-94和95-101) ；c)能有效誘導EAE的肽只有包含天然加工表位的肽，而不是包含隱蔽表位的肽；d)在肽治療實驗中，89-101肽不能預防EAE。這些信息可作為依據，用于研究89-101肽不能與疾病相關T細胞直接結合因而無法誘導EAE耐受性的假設。為了證明該假設，這種肽(89-101)應該不能誘導對致腦炎性表位(89-94)的耐受性，因為它不能與適當構象的MHC限制性因子(I-As)直接結合。換句話說，89-101將不能作為對89-94產生應答的T細胞的apitope。為了檢測這種可能性，用89-101肽和87-96肽進行耐受性實驗(圖15A & B)。87-96肽含有誘導EAB最有效的表位(89-94)。方法使小鼠在第-8、-6和-4天接受含有200 U g肽的PBS或只接受PBS，然后在第0天接受與弗氏完全佐劑混合的IOOii gjft。10天后，將引流淋巴結細胞(6xl05每孔)培養在補加5xl0_5 M 2-巰基こ醇和2M L-谷胺酰胺并且含有或不含抗原的X-Vivo 15培養基中。最后用0. 5 y Ci [3H]胸苷對培養物進行16個小時的脈沖標記，然后用液體閃爍計數器進行摻入量測定。結果表示為3份培養物的毎分鐘計數的平均值。結果用87-96致敏的結果是誘導了ー種對其本身的強記憶應答和ー種對89-101的較弱應答(分別為圖15A及B的□和〇)。這說明需要經過抗原加工由89-101產生89-94。在用87-96致敏之前用87-96作為耐受原的結果是同時抑制了對87-96和89-101的記憶應答(圖15A的■和 )。這說明89-94反應性T細胞一旦在體內獲得無反應性，將不能在體外對89-96或89-101產生的89-94產生應答。但重要的是，在用87-96致敏之前將89-101作為耐受原不能抑制對87-96和89-101的記憶應答(圖15B A的■和 )。這些數據說明，將肽89-101以耐受原形式給藥不能產生對基于89-94序列的天然加工致腦炎性表位的耐受性89-101肽不能作為89-94表位的apitope。盡管不希望受理論的約束，但本發明人相信，這些觀測結果可通過肽89-101在MHC肽結合位點中的位置來加以解釋。如果該肽可優先結合，并使92-98區域位于肽結合袋中，則能夠被MBP 92-98特異性T細胞識別。這可用于解釋為何用MB P 89-101致敏小鼠時，產生的所有T細胞克隆都能夠識別MBP 92-98表位。同樣，當用89-101使T細胞獲得耐受性吋，主要是識別MBP92-98表位的T細胞獲得耐受性。如果MBP92-98是ー種隱蔽表位，則不能由完整抗原的天然加工過程產生，因而在體內可能不存在識別該表位的T細胞。即使體內確實存在MBP92-98特異性T細胞，這種T細胞也與該疾病無關。因此，89-101不能預防由完整MBP誘導的EAE。實施例3-用于MS小鼠模型的肽治療方法本發明人此前發現，通過腹膜內(Liu and Wraith (1995) Int Immuno 18 1255-1263)或鼻內(Metzler and Wraith (1993) 5 :1159-1165)途徑進行單劑量肽抗原全身給藥的方法能夠有效地保護小鼠在長達3個月的時間內不患實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE) (Metzler and Wraith(1999) Immunology 97:257-263)。在表達 EAE 特異性T 細胞受體(Liu et al (1995) Immunity 3:407-415)的 Tg4_ 轉基因小鼠(Burkhart etal (1999) 11 =1625-1634)中誘導耐受性至少需要5劑肽。最近的工作表明，對Tg4小鼠而言，鼻內(IN)途徑比腹膜內(IP)途徑更安全，但在非轉基因小鼠中，這兩種方法的安全性相同。對MBP肽83-99的測試是在Fug/D6轉基因小鼠中進行，這種小鼠能夠同時表達適當的HLA-DR2 II類MHC分子和來源于對該肽具有特異性的人T細胞克隆的TCR。根據處理Tg4轉基因小鼠所采用的標準劑量(Tg4方案)或用于治療變態反應患者的肽劑量遞增脫敏方案(脫敏方案)，用肽對小鼠進行治療。Tg4方案對多組小鼠進行處理，方法是用總體積25 u I的肽83-99 (以4mg/ml的濃度溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS))或只用PBS進行鼻內給藥。每周的第I和第5天對小鼠進行處理，持續5周，共10次給藥。在第6周開始時，用混合于弗氏完全佐劑(CFA)的肽83-99對每只小鼠進行注射，此外還在第I和第3天用百日咳毒素(200ng)進行IP注射。脫敏方案對多組小鼠進行處理，方法是用總體積25 Ul的遞增劑量的肽83-99或只用PBS進行鼻內給藥。遞增劑量從0. Iiig開始，再依次為l、3、6、12、50iig，然后是3次IOOug0每周的第I和第5天對小鼠進行處理，持續5周，共10次給藥。在第6周開始吋，用混合于弗氏完全佐劑(CFA)的肽83-99對每只小鼠進行注射，此外還在第I和第3天用百日咳毒素(200ng)進行IP注射。對EAE的進展情況至少監測30天。實施例4-將ー種apitope混合物鼻內給藥于MS患者制備ー種含有MBP 肽 30-44、83-99、110_124 和 130-144 (即已被確定為 apitopes的某些MBP表位)的疫苗。在Phase Ia/Ib試驗中，將該疫苗給藥于35名患者。該試驗為單交叉試驗，其中的患者保持3個月的非治療狀態，然后接受單劑量的肽(la)。為評定安全性，在單劑量疫苗給藥后，對患者進行3個月的監測。此外，該治療還包括兩次鼻內沉積給藥，每周一次。對每名患者用磁共振成像法分析臨床活性，毎月一次；用增殖動力學應答測定法監測免疫活性；并用基于細胞的RLISA法監測細胞因子產量。該試驗最初涉及對5名慢性進展性疾病(CP)患者的治療。這些患者是根據低MRI活性來挑選的，并且首先用最高劑量的肽進行處理。從CP患者組開始治療的原因是，他們最可能通過MRI活性的提高來表明任何可能的不良影響。在確定對CP組的單劑量和多劑量治療均具有安全性之后，即可開始對復發緩解患者的治療。在這ー較大的組中，30名復發緩解患者的挑選依據是他們在3個月的監測期內出現MRI病變加強。這些患者被分為3組，分別用高、中或低劑量肽進行治療。
權利要求
1.一種耐受原性肽髓磷脂堿性蛋白(MBP) 131-145，其無需進一步抗原加工即能夠與I類或II類MHC分子結合，所述肽用于治療和/或預防多發性硬化。
2.一種用于治療和/或預防多發性硬化的藥物組合物，該組合物含有權利要求I的肽。
3.權利要求I的肽或權利要求2的藥物組合物，其用于鼻內給藥。
4.權利要求I的肽在制備用于治療和/或預防多發性硬化的藥物組合物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種方法，用于通過選擇一種無需進一步加工即能夠與I類或II類MHC分子結合的肽的方法來選擇耐受原性肽。此外還提供由該方法選擇的肽，及其在藥物組合物和用于治療和/或預防疾病中的應用。
文檔編號G01N33/15GK102764425SQ20121015671
公開日2012年11月7日 申請日期2001年8月17日 優先權日2000年8月21日
發明者D·C·弗賴斯, G·馬扎, H·B·斯特雷特, M·龐斯福特, S·M·安德頓 申請人:阿皮托普技術(布里斯托爾)有限公司