專利名稱：一種龍血竭的生物活性檢測方法
技術領域：
本發明涉及到醫藥，特別是一種龍血竭的生物活性檢測方法。
背景技術：
現行中藥的質量控制所采取的手段為對部分指標性成分定性或者定量檢測，但由于中藥中成分復雜，藥效物質不明確，使得這種檢測方法難以保證中藥質量的穩定性，且難與藥物的安全性和有效性相關聯。2010年版《中國藥典》大綱中指出中藥的質量標準體系應由單一指標性成分定性定量向活性及生物測定的綜合檢測過渡。龍血竭為百合科植物劍葉龍血樹Dranaena co chinchinensis (Lour. ) S. C. Chen的含脂木材經提取得到的樹脂，具有活血散瘀，定痛止血，斂瘡生肌等功效，用于跌打損傷，瘀血作痛，婦女氣血凝滯，外傷出血，膿瘡久不收口等癥。目前龍血竭的質量標準主要是對龍血素B含量進行測定，而龍血竭本身化學本底比較復雜，且其中的劍葉龍血素A、龍血素B和3，4' - 二羥基-5-甲氧基二苯乙烯，經現代藥理學研究證實均有一定的藥效活性。因此，龍血竭的質量控制標準與藥效的相關性有待于進一步研究。生物活性測定法適用于成分多樣，結構復雜，理化測定不能反映生物活性和療效的中藥。因此，建立龍血竭的生物測定方法，作為化學測定方法的補充，可以從整體體現藥效，完善現行的質量控制方法和標準。
發明內容
針對上述情況，本發明旨在建立一種基于生物活性檢測的龍血竭質量控制方法。本發明是由以下方案實現的
1.供試品的制備將龍血竭粉碎，粉末于容器中加乙醇超聲提取，離心取上清液水浴揮干乙醇，再將粉末使用二甲基亞砜制成梯度濃度溶液，作為供試品備用，龍血竭對照藥材相同方法處理作為工作對照品；
2.血漿復鈣時間(PRT)測定取家兔靜脈血，使用枸櫞酸鈉抗凝，離心獲得貧血小板血漿(PPP)，在試管中與同體積龍血竭二甲基亞砜溶液相混合，加入氯化鈣溶液，水浴并定時傾斜試管觀察，發現纖維蛋白，記錄時間為血漿復鈣時間(PRT)；
3.按照下列公式計算凝血時間縮短百分比
RP=(空白對照PRT-供試品PRT) +空白對照PRTX 100% ；
以RP值為縱坐標，藥物濃度對數作為橫坐標，尋找線性較好的劑量范圍，依據《中國藥典》2010版二部附錄XIV生物檢定統計法進行效價計算；
4.血小板聚集抑制率(AIR)測定取家兔靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，離心獲得富血小板血漿(PRP)，混入龍血竭藥液后，加入二磷酸腺苷(ADP)溶液放入血小板聚集儀中，測定2分鐘后血小板聚集率(AR)，并計算血小板聚集抑制率；血小板聚集抑制率(AIR)=(空白對照血小板聚集率-供試品血小板聚集率)+空白對照血小板聚集率X 100%;
5.以AIR為為縱坐標，藥物濃度對數作為橫坐標，尋找線性較好的劑量范圍，依據《中國藥典》2010版二部附錄XIV生物檢定統計法進行效價計算。
圖I為供試品與工作對照品血漿復鈣時間縮短率比較圖 圖2為供試品和工作對照品血小板聚集抑制率比較圖
具體實施例方式下面通過實施例詳細說明本發明。
現代藥理研究表明龍血竭在治療中醫血癥方面具有雙向調節作用既能改善機體微循環，活血化瘀，又增加體內凝血因子，對出血患者有顯著止血作用。本發明使用下列儀器與試劑離心機，湘智離心機廠，TGL16M型；分析天平，梅特勒托利多上海有限公司，PL203型；超聲提取儀，寧波海曙五方超聲設備有限公司，WF-500E型；血小板聚集儀，美國，AC9000型。二磷酸腺苷鈉鹽，氯化鈣，乙醇，二甲基亞砜均為市售分析純。
本發明實施具體步驟
一.供試品和工作對照品的制備
1.市售芒果牌龍血竭低溫粉碎，過40目篩；
2.供試品粉末5g于錐形瓶中加入40mL乙醇，常溫超聲提取25分鐘，所得提取液使用濾紙過濾，濾液60°C水浴揮干乙醇，稱量干燥物重量，計算回收率；
3.干燥物溶入二甲基亞砜中，制備成相當于生藥128mg/mL濃度的溶液，連續稀釋獲得64，32，16，8，4mg/mL濃度的溶液；
4.將龍血竭對照藥材(編號121252)，按供試品處理方法處理，作為工作對照品。二.血漿復鈣時間縮短率測定
1.血漿的制備家兔耳緣靜脈血,取I.8mL與O. 2mL 109mmol/L枸櫞酸鈉在直徑IOmm塑料試管內充分混合，2500r/min離心15min，取上清液即為所需血漿；
2.25mmol/L氯化|丐溶液稱取O. 138g氯化|丐，加蒸懼水至50mL溶解,得到25mmol/L氯化鈣溶液；
3.直徑IOmm塑料試管中將血漿與不同濃度的龍血竭溶液各O.ImL混合均勻，37°C預熱3min。加入O. ImL預熱到37°C的上述氯化I丐溶液，啟動秒表計時，緩慢傾斜試管混合，見到纖維蛋白絲出現，記錄時間，為血漿復鈣時間PRT，空白對照管使用O. ImL 二甲基亞砜代替龍血竭溶液測定方法相同，記錄凝血時間，按照下面公式計算血漿復鈣時間縮短率
RP=(空白對照PRT-供試品PRT) +空白對照PRTX 100% ；
4.處理與效價計算
(I)效價計算
為方便計算，約定工作對照品效價為lU/mg生藥，采用量反應平行線法(2 · 2)(依據《中國藥典》2010版二部附錄XIV生物檢定統計法)對供試品與工作對照品進行比較，按如下要求工作對照品(Ps)和樣品(Pt)相鄰高低劑量組的比值(r)要相等，r為1:0.5，Iogr=I,各劑量組的反應個數(m)應相等；測定計算得出RP值如下表
權利要求
1.一種龍血竭的生物活性測定方法，包括以下步驟(1)供試品制備方法龍血竭低溫粉碎，過40目篩，粉末5g加入40mL乙醇，常溫超聲提取25分鐘，所得提取 液使用濾紙過濾，濾液60°C水浴揮干乙醇，稱量干燥物重量，計算回收率，干燥物溶入二甲 基亞砜中，制備成相當于生藥128mg/mL濃度的溶液，按照濃度比1:0. 5連續稀釋獲得不同 濃度的溶液；(2)工作對照品的制備方法龍血竭對照藥材，按供試品相同方法處理，獲得工作對照品；(3)分別進行龍血竭止血效價和活血效價的測定。
2.根據權利要求1所述的生物活性測定方法中止血效價實驗，其特征在于(1)血漿的制備家兔耳緣靜脈血，取1.8mL與0.2mL 109mmol/L枸櫞酸鈉在直徑10mm 塑料試管內充分混合，2500r/min離心15min，取上清液即為所需血漿；(2)血漿復鈣時間的測定直徑10mm試管中將血漿與不同濃度的龍血竭溶液各0.lmL 混合均勻，37°C預熱3min,加入0. lmL預熱到37°C的25mmol/L氯化f丐溶液,啟動秒表計時， 緩慢傾斜試管混合，見到纖維蛋白絲出現，記錄時間，為血漿復鈣時間PRT，空白對照管使用 0. lmL 二甲基亞砜代替龍血竭溶液；(3)按照下面公式計算血漿復鈣時間縮短率RP=(空白對照PRT-供試品PRT)+空白 對照 PRTX100%。
3.根據權利要求1所述的生物活性測定方法中活血效價實驗，其特征在于(1)血漿制備血漿制備取家兔耳緣靜脈血，按體積比1:9加入3.28%枸櫞酸鈉抗凝， 500r/min離心5min,取上清液為富血小板血衆(PRP);繼續離心,3000r/min離心lOmin,取 上清液為貧血小板血漿(PPP);(2)加樣和檢測取測定管放入攪拌珠，加PPP200i!L，預熱后對凝聚儀進行調零；受試 藥管加入PRP 180 u L、藥液20 u L，空白對照管加入PRP180 u L、DMS020 u L ;分別預熱5min 后，加入lOiiL 0. 04mol/L ADP磷酸緩沖鹽溶液(pH7. 4)，2min后，記錄并計算血小板聚集 抑制率；(3)按照下面公式計算，血小板聚集抑制率(AIR)=(空白對照血小板聚集率-供試品 血小板聚集率)+空白對照血小板聚集率X100%。
4.根據權利要求2、3中所述的效價測定方法中使用的劑量設置和統計方法，其特征在于依照《中國藥典》2010版二部附錄XIV生物檢定統計法，采用量反應的平行線測定法 (2 2)法進行供試品與對工作對照品效價的對比檢定設定工作對照品的效價為1. OU/mg 生藥，劑量組之間濃度比r為0. 5，各劑量組反應個數m相等。
全文摘要
本發明涉及一種龍血竭的生物活性測定方法，實現了對龍血竭復雜成分的整體藥效進行控制。方法是將龍血竭粉碎于乙醇中超聲提取，提取物干燥后使用二甲基亞砜溶解獲得溶液后，連續稀釋，活得等比濃度的溶液；分別測定龍血竭的血漿復鈣時間縮短率和血小板聚集抑制率，按照《中國藥典》第二部附錄ⅩⅣ量反應平行線法(2·2)進行效價計算。本發明操作簡單易行，測試準確，可以用做有效成分不明確的龍血竭藥物整體藥效質量控制。
文檔編號G01N33/15GK102662037SQ201210154479
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者宋美芳, 李光, 李學蘭, 李宜航, 趙俊凌, 陳曦, 馬小軍 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所云南分所