專利名稱：診斷試劑盒及bfar在制備胃癌早期診斷試劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物科學領域，特別涉及一種診斷試劑盒及BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應用。
背景技術：
胃癌是危害人類健康的常見惡性腫瘤，根據世界衛生組織(WHO) 2008年的統計(世界衛生組織年度統計，2008)，在全世界范圍，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的統計中顯示有接近950，000個新發病例，同時有約700，000人死于這一種疾病。在我國，每年胃癌新發患者數超過30萬，死于胃癌的人數約16萬，病死率居惡性腫瘤之首，嚴重威脅人民生命健康(陳竺，全國第三次死因回顧抽樣調查報告，2008)。為降低死亡率，提高胃癌的療效，關鍵是胃癌的“三早”工作，即早期發現、早期診斷及早期治療。然而，由 于絕大多數胃癌患者缺乏特異性的臨床癥狀，故早期胃癌診斷率很低，手術率不足10% (吳云林外科理論與實踐，2005，10:401);術后病人的生存期也較短。目前，我國胃癌總體5年生存率為43. 4%，術后病理分期(pathological M，pTNM) I、II、III、IV期患者的術后5年生存率分別為75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (劉炳亞中華胃腸外科雜志，2010，13:163)。因此，提高胃癌的早期診斷率非常重要。而一般體檢和影像學檢查作用有限，待能夠發現和明確診斷時，往往已到了中、晚期，缺少預警價值。因此，從長遠角度看，應致力于發現敏感性和特異性均較好的腫瘤標志物。此外，胃癌異質性大，預后及對治療的反應性差別較大，對于臨床評估預后以及對治療反應性的預測與評價，均需良好的腫瘤標志物。理想的腫瘤標志物應符合以下條件(1)敏感性高；(2)特異性高；(3)腫瘤標志物濃度和腫瘤大小、轉移、惡性程度有關，能協助腫瘤分期和判斷預后；(4)半衰期短，有效治療后濃度很快下降，能較快反映體內腫瘤的實際情況；(5)存在于體液，特別是血液中，易于檢測(劉炳亞中華胃腸外科雜志，2010，13:163)。腫瘤血清標志物的研究一直是本領域的研究重點。現已有多種胃癌腫瘤標識物如癌胚抗原(CEA)，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但對早期胃癌的診斷意義較小，主要用于胃癌治療前后的動態觀察(Lipkin M:Cancer Research, 1988, 48:235 ；Lipkin: JBC Supplymental, 1992，16:1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性僅20 40 % (Kodera Y:The Americanjournal of gastroenterology, 1996，91:49 ；Chou M:Disease Markers, 2000，16:105 ；Lai IR etal:Hepato—gastroenterology，2002，49:115 Edip U et al!Advances inTheray, 2008, 25:1075);還有研究發現腫瘤相關糖蛋白抗原_72 (TAG-72)對胃癌的敏感性為69%，特異性為84% (劉軍等實用醫學雜志，1999，15:4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40% -60%的陽性檢出率，在胃癌組織中有80% -94%的陽性檢出率(Ren J:Cancer，2000,88 :280);核小體組蛋白類抗原(IP0 — 38)作為胃癌診斷的敏感性為57. 4%，特異性超過90% (Hao Y etal: J Proteome Res, 2008，7:3668)以上這些指標均有利于早期胃癌的診斷。某些腫瘤基因，如DDC、C-myC、C-erb-2、p53以及nm23等對胃癌的發生、轉移也有一定意義，但廣泛應用于臨床仍受限制(劉倩等，人民衛生出版社，2004)。由于現有的胃癌生物標識物在靈敏度和特異性上的缺陷，雖然在療效監測、提示復發、判斷預后和高危人群的普查中具有一定的價值，但目前仍不能用于胃癌的確診。為了實現對胃癌的早期高靈敏性，高特異性的診斷，急需在分子水平上尋找到更敏感、更特異的胃癌生物標志物。我們在前期研究中利用人蛋白質組芯片高通量、快速分析的優勢，分析了胃癌病人相關血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份)，在較短時間內比較了患者和健康人樣品中的不同，給出了候選血清生物標志物，以期早期診斷和有效治療胃癌。 蛋白BFAR (bifunctional apoptosis regulator)雙功能凋亡調節子最早是由Zhang等人發現的一種多結構域的膜整合蛋白(Zhang H et al :PNAS, 2000, 97:2597),它含有450個氨基酸。BFAR主要分布在內質網，少量分布在線粒體膜(Roth W et al =CellDeath Differ, 2003, 10:1178)，包括4個可識別結構域N末端鋅指結合RING環結構域，可結合泛素連接酶E2s ；SAM結構域，能促進Bcl-2和Bcl-X的相互作用，抑制Bax誘導的細胞凋亡；DED結構域,與procaspases-10的死亡效應結構域DED序列同源，有報道稱其直接或間接與caspase8和caspaselO前體相關,阻礙Fas介導的凋亡信號通路；以及C末端跨膜結構域TM，BFAR通過TM定位在內質網膜上(李紅梅等中國科學，2011，41:1140 )。有研究發現，BFAR的組織表達譜有高度特異性，僅在腦組織中高表達(Roth W et al =Cell DeathDiffer,2003, 10:1178)。目前，未見有將BFAR蛋白質作為胃癌生物標志物的報導。
發明內容
本發明的第一目的在于提供一種診斷試劑盒，以解決現有技術中的胃癌診斷試劑盒不能實現對胃癌的早期高靈敏性、高特異性的診斷的技術性問題。本發明的第二目的在于提供一種BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應用，以解決現有技術中的胃癌診斷試劑不能實現對胃癌的早期高靈敏性、高特異性的診斷的技術性問題。本發明目的通過以下技術方案實現一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，所述診斷試劑盒包括酶標板、人蛋白質BFAR、標準血清、酶標試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，其中，所述人蛋白質BFAR包被于所述酶標板上。優選地，所述人蛋白質BFAR是從釀酒酵母中過量表達，親和純化而得到，濃度為10u g/mL0優選地,所述標準血清包括0U/mL標準血清I和100U/mL標準血清2,所述0U/mL標準血清I為健康人血清稀釋于樣品稀釋液中；所述100U/mL標準血清2為BFAR抗體為陽性的血清稀釋于樣品稀釋液中。優選地，所述酶標試劑含HRP- 二抗0. 1-1 u g/mL。優選地，所述酶底物溶液為TMB溶液，所述TMB溶液包括顯色劑A和顯色劑B，顯色劑A :500mL溶液中含有醋酸鈉13. 6g、檸檬酸I. 6g和30%雙氧水0. 3mL ;顯色劑B :500mL溶液中含有TMB 350mg、DMS0 20mL和檸檬酸 H205. lg。優選地，所述封閉液為0. 5%BSA的0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即 I 升溶液中含 5g BSA (牛血清白蛋白)、8g NaCUO. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 12H20和 0. 2g KCl。優選地，所述樣品稀釋液為0. 01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS);所述洗滌液為 0. 01mol/L pH 7. 4 磷酸鹽-NaCl 緩沖液(PBST), PBST 內含 0. 05%Tween_20,即 I 升溶液中含 8g NaCl.O. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 12H20、0. 2g KCl 和 0. 5mL Tween-20 ;所述終止液為2mol/L H2SO4溶液。優選地，所述試劑盒中的試劑均可加入防腐劑。一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，所述診斷試劑盒采用的是現在臨床廣泛 使用的ELISA技術，應用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質BFAR的IgA抗體；具體是用人蛋白質BFAR抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待測血清，再與HRP標記的二抗結合，形成BFAR-抗體-酶標二抗復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的抗蛋白質BFAR的IgA抗體的水平呈正相關。人蛋白質BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應用。與現有技術相比，本發明有以下優點I、提供一種靈敏、安全、可靠、易操作的商品化試劑盒，定性測定人血清中抗蛋白質BFAR的IgA抗體的水平，有助于輔助早期診斷胃癌；2、提供的血清生物標志物人蛋白質BFAR的特異性為84%，敏感性為85%，具有高特異性和高敏感性的特點。
圖I為銀染鑒定BFAR的表達濃度、純化狀況的示意圖，圖中I表示標準BSA溶液濃度為5 u g/mL ；2表示標準BSA溶液濃度為10 U g/mL ；3表示標準BSA溶液濃度為25 U g/mL ；4表示標準BSA溶液濃度為50 U g/mL ；5表示標準BSA溶液濃度為100 U g/mL ；6表示經瓊脂糖親和介質(谷胱甘肽)(國家生化工程技術研究中心)分離純化后的BFAR蛋白質樣品(含GST標簽)；7表示蛋白質分子量marker，從大到小分子量分別是170KD，130KD，95KD，72KD，55KD ；圖2為Western-Blotting鑒定BFAR的表達、純化狀況的示意圖，圖中I表示經瓊脂糖親和介質(谷胱甘肽)(國家生化工程技術研究中心)分離純化后的BFAR蛋白質樣品(含GST標簽)；2表示蛋白質分子量marker，從大到小分子量分別是130KD，95KD，72KD，55KD ；
圖3為健康人、高危、胃癌患者血清中抗蛋白質BFAR的IgA抗體的濃度變化曲線圖,注圖中的數值是健康人、高危、胃癌患者各300份血清樣本中的抗蛋白質BFAR的IgA抗體濃度的相對水平。
具體實施例方式以下結合實施例和附圖對本發明做進一步的說明。I、表達、純化及鑒定BFAR 蛋白質BFAR是由基因工程改造過的釀酒酵母利用半乳糖誘導過量表達，之后，經瓊脂糖親和介質(谷胱甘肽)分離純化而得到，對其進行銀染定量和Western-Blotting鑒定的結果分別如圖I和圖2所示。2、血清樣品的準備 全血標本于室溫放置2小時或4°C過夜后于IOOOg離心20分鐘左右，取上清即可立即檢測；或進行分裝，并將標本放于_20°C或_80°C保存，但應避免反復凍融。解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。所檢測樣品中不能含有NaN3,因為NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。3、ELISA法中各種緩沖液及試劑的配制方法(I)包被緩沖液0. 05M pH 9. 6 的 Na2CO3-NaHCO權利要求
1.一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，其特征在于，所述診斷試劑盒包括酶標板、人蛋白質BFAR、標準血清、酶標試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，其中，所述人蛋白質BFAR包被于所述酶標板上。
2.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述人蛋白質BFAR是從釀酒酵母中過量表達，親和純化而得到，濃度為IOy g/mL。
3.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述標準血清包括OU/mL標準血清I和100U/mL標準血清2,所述OU/mL標準血清I為健康人血清稀釋于樣品稀釋液中；所述100U/mL標準血清2為BFAR抗體為陽性的血清稀釋于樣品稀釋液中。
4.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在干，所述酶標試劑含HRP-ニ抗0.1-1μ g/mL0
5.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述酶底物溶液為TMB溶液，所述TMB溶液包括顯色劑A和顯色劑B，顯色劑A 500mL溶液中含有醋酸鈉13. 6g、檸檬酸1.6g和30%雙氧水O. 3mL ;顯色劑B :500mL溶液中含有TMB 350mg、DMS0 20mL和檸檬酸·Η205.丄g0
6.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在干，所述封閉液為O.5%BSA的O.01mol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS)溶液，即I升溶液中含5g BSA (牛血清白蛋白)、8g NaCl、O. 2g KH2PO4,2. 9g Na2HPO4 · 12H20 和 0. 2g KCl。
7.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在干，所述樣品稀釋液為O.Olmol/L pH 7. 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBS);所述洗滌液為O. Olmol/L ρΗ7· 4磷酸鹽-NaCl緩沖液(PBST)，PBST 內含 O. 05%Tween-20,即 I 升溶液中含 8g NaCl、O. 2g KH2PO4,2. 9gNa2HPO4 · 12Η20、0· 2g KCl 和 O. 5mL Tween-20 ;所述終止液為 2mol/L H2SO4 溶液。
8.如權利要求I所述的ー種診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的試劑均可加入防腐剤。
9.一種診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，其特征在于，所述診斷試劑盒采用的是現在臨床廣泛使用的ELISA技術，應用間接法定性檢測人血清中抗蛋白質BFAR的IgA抗體；具體是用人蛋白質BFAR抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中加入待測血清，再與HRP標記的ニ抗結合，形成BFAR-抗體-酶標ニ抗復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，顔色的深淺和樣品中的抗蛋白質BFAR的IgA抗體的水平呈正相關。
10.人蛋白質BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物科學領域，特別涉及一種診斷試劑盒及BFAR在制備胃癌早期診斷試劑中的應用。本發明的診斷試劑盒，用于胃癌早期的診斷，所述診斷試劑盒包括酶標板、人蛋白質BFAR、標準血清、酶標試劑、酶底物溶液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，其中，所述人蛋白質BFAR包被于所述酶標板上。與現有技術相比，本發明有以下優點1、提供一種靈敏、安全、可靠、易操作的商品化試劑盒，定性測定人血清中抗蛋白質BFAR的IgA抗體的水平，有助于輔助早期診斷胃癌；2、提供的血清生物標志物人蛋白質BFAR的特異性為84%，敏感性為85%，具有高特異性和高敏感性的特點。
文檔編號G01N33/96GK102680688SQ20121014916
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者劉炳亞, 朱正綱, 李建芳, 楊麗娜, 燕敏, 王靖方, 郭書娟, 陶生策 申請人:上海交通大學