專利名稱：一種水環境中雌激素結合體的共檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種水環境中有機污染物的檢測技術領域，特別是涉及自然水體樣品中痕量天然雌激素結合體的提取、凈化和儀器檢測方法。
背景技術：
由人或哺乳動物卵巢分泌的天然雌激素雌酮(Estrone，El)、17 β -雌二 醇(17 β-Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol，E3)和人工合成雌激素乙炔基雌二醇(17 a -Ethinyl Estradiol, EE2)是最具潛在雌性化風險的內分泌干擾物(EndocrineDisrupting Compounds,EDCs),在水環境中ng/L濃度水平就會導致魚類的雌性化。雌激素排出時其雌激素分子結構中C3-或者C7-位置的羥基多被硫酸鹽或者葡萄糖醛酸所取代，轉變成為無雌激素活性的結合體結構，但在水體或污水處理廠生物酶的作用下，會轉化為其單體結構，恢復雌激素活性。近十年來雌激素作為典型的內分泌干擾物受到廣泛關注。歐美等國對多家污水處理廠雌激素濃度及去除效率的調查結果顯示，在污水處理廠出水及受納水體中殘留著Hg/L濃度水平的雌激素。目前，國內外關注自然水體、土壤中雌激素單體的研究比較多，對于環境介質中雌激素結合體的調查研究相對較少，這也包括水環境中雌激素結合體的相關研究。這很大原因歸結為水環境中雌激素結合體痕量存在，易受水體基質影響。因次，建立回收率高、重現性好的水環境中天然雌激素結合體分析方法，是進一步研究環境介質中雌激素遷移轉化的前提條件。近年來，痕量有機物的儀器檢測技術有了很大的提高，如氣相色譜-質譜聯用(GC/MS)、氣相色譜-串聯質譜聯用(GC/MS/MS)、液相色譜-質譜聯用(LC/MS)、液相色譜-串聯質譜聯用(LC/MS/MS)等，具有較高的靈敏度和精確度。然而，對于實際環境樣品，比如自然水體樣品，由于基質干擾作用，使分析方法的準確性和精密性大大降低。因此，如何將水環境中痕量存在的雌激素結合體富集并進行適當凈化，成了水環境中雌激素結合體分析的一個瓶頸。
發明內容
本發明的目的是針對水環境中雌激素結合體痕量存在、基質干擾大、前處理技術難度大等問題，擬開發一種回收率高、靈敏度高、準確、快速的分析技術，實現對水環境樣品中四種雌激素結合體雌酮硫酸鹽結合體(Estrone-3-sulfate,E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸鹽結合體(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結合體(Estrone-3-glucuronide, E1-3G)、17 β -雌二醇葡萄糖苷酸結合體(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)的定量測定。本發明的技術方案如下一種檢測水環境樣品中痕量存在的雌酮硫酸鹽結合體(E1-3S)、17 0-雌二醇硫酸鹽結合體(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結合體(El-3G)、17i3-雌二醇葡萄糖苷酸結合體(E2-3G)的定量測定方法。附圖
I為分析方法具體步驟，其特征在于該方法包括如下部分(I)HLB 柱富集水樣采用GF/F玻璃纖維濾膜進行過濾，并用鹽酸調節pH為3 ;利用固相萃取裝置活化Waters公司的HLB固相萃取柱(200mg,6cc),活化的順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為lmL/min ;采用已活化的固相萃取柱對水樣進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min ;萃取結束后真空抽干5min,待凈化。⑵NH2柱凈化
將用5mL甲醇活化過的Waters公司的NH2柱(500mg,6cc)用固相萃取柱轉接頭接于干燥的HLB柱下方，接著用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串聯裝置，去除基質干擾，再用6mL 2%氨水甲醇溶液洗脫NH2柱上的雌激素結合體，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中，控制流速為lmL/min,洗脫液在氮氣流下緩慢吹干,加入ImL乙腈/水(1/1, v/v)混合液，漩渦混合，冷藏等待濃度測定。(3)利用液相色譜-串聯質譜分析雌激素結合體液相色譜-串聯質譜聯用儀器為=Agilent 1100高效液相色譜系統，包括四元輸液泵，美國Agilent公司的自動進樣器，3200QTRAP型液相色譜/串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst I. 4. I數據處理軟件；色譜柱Nova_PakC18 (3· 9_X 150_X 4 μ m), Waters 公司；離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓-4500V ;溫度4500C ;源內氣體I (GSl，N2)壓力45psi ;源內氣體2(GS2，N2)壓力45psi ;氣簾氣體(N2)壓力20psi ;掃描方式為多重反應監測(MRM);碰撞氣(N2)壓力Medium。雌酮硫酸鹽結合體(E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸鹽結合體(E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結合體(El-3G)、17i3-雌二醇葡萄糖苷酸結合體(E2-3G)進行分離的HPLC流動相梯度洗脫條件詳見表I和表2。表I測定雌酮硫酸鹽結合體(E1-3S)和17 β -雌二醇硫酸鹽結合體(E2-3S)流
動相梯度洗脫條件
權利要求
1.一種水環境中雌激素結合體的共檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (1)水環境樣品前處理 取4L水樣采用GF/F玻璃纖維濾膜進行過濾，并用4mol/L的鹽酸調節pH為3 ;利用固相萃取裝置活化Waters公司的HLB固相萃取柱，活化的順序為5mL色譜純乙酸乙酯、5mL色譜純甲醇及IOmL超純水，流速為lmL/min ;采用已活化的固相萃取柱對水樣進行固相萃取富集，控制流速為3mL/min ;萃取結束后真空抽干5min,待凈化；將用5mL甲醇活化過的Waters公司的NH2柱用固相萃取柱轉接頭接于干燥的HLB柱下方,接著用6mL甲醇淋洗HLB柱和NH2柱串聯裝置，再用6mL 2%氨水甲醇溶液(v/v)洗脫NH2柱上的雌激素結合體，洗脫液收集于IOmL玻璃離心管中，控制流速為lmL/min，洗脫液在氮氣流下緩慢吹干，加入ImL乙腈/水(1/1，v/v)混合液，漩渦混合，冷藏等待濃度測定； (2)利用液相色譜-串聯質譜分析雌激素結合體 液相色譜-串聯質譜聯用儀器為=Agilent 1100高效液相色譜系統，包括四元輸液泵，美國Agilent公司的自動進樣器，3200QTRAP型液相色譜/串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源(ESI)以及Analyst I. 4. I數據處理軟件； 色譜柱Nova_Pak C18 (3. 9_X 150_X 4 U m), Waters公司；離子源電噴霧離子化源(ESI)，負離子方式檢測；離子噴射電壓-4500V;溫度4500C ;源內氣體1(GS1，N2)壓力45psi ;源內氣體2(GS2，N2)壓力45psi ;氣簾氣體(N2)壓力20psi ;掃描方式為多重反應監測(MRM);碰撞氣(N2)壓力Medium ;雌酮硫酸鹽結合體(Estrone-3-sulfate,E1-3S)、17 0 -雌二醇硫酸鹽結合體(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結合體(Estrone-3-glucuronide, E1-3G)、170 -雌二醇葡萄糖苷酸結合體(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)進行分離的HPLC流動相梯度洗脫條件如表I和表2所示 表I測定雌酮硫酸鹽結合體(E1-3S)和17 3 -雌二醇硫酸鹽結合體(E2-3S)流動相梯度洗脫條件 #口時間流速乙腈氨水，196。，甲醇可minnL/min%%%00.006507.585.07.510.206507.585.07.521.2065010-080.01O-O32.0065015.070.015-043.0065049-02.049.056.1065050.00.050.066.206507-585.07-5710.006507.585.07.5 表2 測定雌酮葡萄糖苷酸結合體(E1-3G)和17 3-雌二醇葡萄糖苷酸結合體(E2-3G)流動相梯度洗脫條件
2.根據權利要求I所述的水環境中雌激素結合體的共檢測方法，其中所述雌激素結合體為雌酮硫酸鹽結合體(Estrone-3-sulfate, E1-3S)、17 β -雌二醇硫酸鹽結合體(Estradiol-3-sulfate, E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結合體(Estrone-3-glucuronide,E1-3G)、17 β -雌二醇葡萄糖苷酸結合體(Estradiol-3-glucuronide, E2-3G)。
全文摘要
本發明涉及一種水環境中內分泌干擾物的檢測技術，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯質譜聯用技術對水體樣品中雌激素結合體雌酮硫酸鹽結合體(Estrone-3-sulfate，E1-3S)、17β-雌二醇硫酸鹽結合體(Estradiol-3-sulfate，E2-3S)及雌酮葡萄糖苷酸結合體(Estrone-3-glucuronide，E1-3G)、17β-雌二醇葡萄糖苷酸結合體(Estradiol-3-glucuronide，E2-3G)的共檢測方法。本方法將采集好的水體樣品，采用HLB固相萃取小柱富集其中的E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G，再將活化好的NH2柱接于HLB柱下方，用甲醇淋洗，最后用2％氨水甲醇溶液洗脫，利用液相色譜-串聯質譜聯用分析。該方法環境友好、易于操作、且回收率較高，能夠快速分析水體樣品中痕量存在的雌激素結合體E1-3S、E2-3S及E1-3G、E2-3G。
文檔編號G01N30/88GK102636610SQ20121012753
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月27日 優先權日2012年4月27日
發明者劉曉薇, 史江紅, 吳唯, 張暉, 薄婷, 賈彥舶, 陳慶彩 申請人:北京師范大學