專利名稱：一種內嵌樣品凈化模塊的表面等離子共振譜儀及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于食品安全和環境分析檢測領域，特別涉及一種內嵌樣品凈化模塊的表面等離子共振譜儀，可實現目標分析物與干擾物的在線快速分離，具有樣品需求量小、干擾小、準確度高的檢測方法。
背景技術：
近年來，越來越多的有毒有害物質出現在食品和環境中，造成嚴重的食品安全事故和大面積環境污染，危害人民身體健康。污染物的種類多種多樣，例如食品安全中獸殘、農殘、生物毒素，消費品安全中塑化劑、重金屬、高關注度化學物質等等。因此，開發相應快速檢測裝置迫在眉睫。表面等離子共振譜儀(SPR)，也稱分子相互作用譜儀，是一種基于物理光學原理的新型生化分析系統。與傳統的相互作用分析技術相比較，它具有實時監控、無需標記、耗樣量極少、操作簡單等特點。作為一種超靈敏快速檢測技術，在食品安全、分析化學、生物分子相互作用分析、臨床診斷、環境檢測等領域呈現出巨大的應用前景。已有大量文獻報道SPR生物傳感器可快速測定食品中抗生素、細菌、農藥殘留、重金屬離子等危害因子，具有高靈敏度、快速響應性、在線分析能力等特點，已成為食品安全檢測的理想工具之一。眾所周知，食品安全和環境檢測的樣品預處理過程是一個重要環節，約占整個分析時間的三分之二。目前，傳統的樣品預處理方法主要是色譜、固相萃取等方法。這些方法存在耗時長、樣品用量大、操作步驟繁瑣等缺點，迫切需要開發在SPR檢測前實現簡單快速分離目標物和干擾物的器件，減少操作時間。
發明內容
本發明提供一種內嵌樣品凈化模塊的表面等離子共振譜儀及其檢測方法，技術方案如下
一種表面等離子共振譜儀，包括樣品瓶、適配體或抗體溶液、流動相、微流泵、微型膜透析組件、廢液瓶、混合池、連接組件、微射流卡盤、傳感器芯片和光學檢測系統，該儀器在樣品引入的通道上嵌入了凈化模塊，即微型膜透析組件，所述的微型膜透析組件內部由表面功能化的中空纖維膜組成，位于樣品進樣接頭與微量混合池之間。所述的微型膜透析組件，具體包括常規壓力透析去除大分子模式、常規壓力透析去除小分子模式和接枝纖維吸附-解析模式三種模式的膜組件，檢測過程根據目標分析物的性質進行選擇或組合，以實現樣品凈化，從而提高分析準確性。
(I)當目標分析物為分子量小于IOkDa的小分子時，選擇壓力透析去除大分子模式組件，該組件內部是由孔徑在5-50納米的中空纖維膜組成，其內部流道為樣品中的小分子目標檢測物，在通過進樣閥進入膜透析組件后，在泵所提供的氣壓或液壓下，透過中空纖維膜壁上的孔進入表面等離子共振儀的檢測池，大分子干擾物留在纖維空腔內，經清洗進入廢液池；
(2)當目標分析物為分子量大于IOkDa的大分子時，選擇壓力透析去除小分子模式組件；該組件內部是由孔徑在5-50納米的中空纖維膜組成，其內部流道為樣品中小分子干擾物被透析出來后，進入廢液池；而大分子目標物則通過中空纖維膜的內部被導入檢測區域；
(3)當目標分析物或干擾物為可被選擇性吸附時，選擇接枝纖維吸附-解析模式組件；該組件內部是由官能化接枝的無孔中空纖維膜組成；該組件的分離凈化過程有兩種不同方式其一是干擾物被選擇性吸附在纖維材料上，而目標物不被吸附，直接在壓力下被導入系統的檢測部分，而后干擾物再被清洗出去，進入廢液；其二是目標物首先被選擇性吸附在纖維上，干擾物被清洗進入廢液，而后選用另一種流動相將目標物再洗脫下來，被導入系統的檢測部分。所述的微型膜透析組件，針對不同樣品，采用多種官能化接枝纖維與中空纖維膜材料。所述的官能團為氨基和/或羧基。以上所述的表面等離子共振譜儀的應用方法，包括下述步驟
(1)根據樣品的復雜程度以及目標分析物的特性，從壓力透析去除大分子、壓力透析去除小分子、吸附-解析等三種模式的微型膜透析組件進行選擇或組合，并將其置于樣品進樣接頭與微量混合池之間；
(2)根據目標分析物的分子量大小選擇傳感器芯片，對于分子量大于IOkDa的目標分析物，直接選用鏈霉親和素修飾的芯片；對于分子量小于IOkDa的分析物，則選用該分析物修飾的芯片；
(3)根據目標物分子量的大小選擇樣品和適配體進樣方式，對于分子量大于IOkDa的分析物，先將生物素修飾的適配體或抗體通入微射流卡盤，流經傳感器芯片進行連接，再將樣品注入微型膜透析組件，去除干擾物后，流經微量混合池、微射流卡盤，在傳感器芯片上進行檢測；對于分子量小于IOkDa的分析物，則先將樣品經微型膜透析組件凈化，進入微量混合池，與適配體或抗體進行混合，再通入微射流卡盤，流經傳感芯片檢測，再通過微射流卡盤流到廢液瓶中；
(4)當液體通過傳感芯片時，光學檢測器將檢測信號，并進行數據采集和處理，對目標分析物濃度進行分析。與現有技術相比較，本發明具有以下突出優點
(I)本發明在表面等離子體共振譜儀中內嵌了微型膜透析組件，縮短了分析時間，且操作簡單易行，重現性好。(2)本發明通過內嵌樣品凈化模塊，適用于待檢測樣品量少的場合，避免了一般離線樣品預處理操作繁瑣、耗時多、樣品消耗量大等缺點。(3)本發明通過內嵌不同的微型膜透析組件，不僅適用于大分子物質的檢測，同時也適用于小分子量物質的檢測。(4)本發明中樣品的凈化處理和檢測同步進行，可以實現在線分析或在線檢測目 標物的濃度。本發明在傳統表面等離子檢測模式中內嵌入樣品凈化模塊，具有快速、高效分離目標分析物與干擾物，可用于 農產品食品中生物毒素、農獸藥殘留、非法化學添加劑的分析檢測，也可用于生物和醫學的分子相互作用研究，具有樣品需求量小、干擾小、靈敏度高、重現性好等優點，可廣泛應用于食品安全檢測和生物分子相互作用研究。
圖I為本發明方法所使用的內嵌凈化模塊在線分析裝置連接方式示意圖。該在線分析裝置包括表面等離子共振生物傳感器的樣品瓶I、適配體(或抗體)溶液2、流動相3，微流泵4、5、6，微型膜透析組件7，廢液瓶8，混合池9，微流泵10，連接組件11，微射流卡盤12，傳感器芯片13，廢液瓶14。其中連接組件中的載流入口和廢液出口分別與微射流卡盤12相連，芯片13—面固定于微射流卡盤的流通池，另一面固定于檢測器。溶液通過微射流卡盤流過芯片表面時，檢測器收集信號，隨后溶液從微射流卡盤12和連接組件14的廢液出口流出。圖2為壓力透析除去大分子的微型膜透析組件。該組件內部是由孔徑在5-50納米的中空纖維膜組成，可使小分子目標物與大分子干擾物實現快速的分離，同時通過在纖維膜表面的官能化修飾，還可以選擇性的吸附小分子干擾物，使其保留在膜上，從而達到樣品的快速凈化目的。樣品中的小分子目標檢測物，在通過進樣閥進入膜透析組件后，在泵所提供的氣壓或液壓下，透過中空纖維膜壁上的孔進入SPR系統的檢測池；大分子干擾物留在纖維空腔內，通過管路b，在泵壓下被清洗出來，進入廢液池8;小分子干擾物可以通過膜表面的官能團被選擇性吸附，隨后被清洗進入廢液池。整個器件通過毛細管接口分別與樣品進樣接頭、微量混合池連接。這一模式主要用于去除大分子干擾物和部分特異性較強的小分子干擾物，其主要特點是方法簡便、快速、適用性強。圖3為壓力透析除去小分子的微型膜透析組件。這一模式器件的設計和原理與圖2的組件非常接近，也是通過中空纖維膜達到大分子與小分子的分離。主要不同之處是在圖2組件中中空纖維的兩個開口端是并列封在上部，而在這個組件中，一端是直接連到外面與管路a相接。當小分子干擾物被透析出來后，大分子目標物從中空纖維的一端通過管路a被導出進入檢測區域。這一模式主要用在檢測大分子時，去除小分子或共聚物的干擾；也可用于大分子樣品脫鹽。該器件與整個系統的集成與圖2模式相同。圖4為吸附-解吸模式的微型膜透析組件。這一模式與前兩個模式有較大的區別，其分離凈化作用是通過官能化接枝纖維選擇性的吸附/解析過程來實現的。官能化接枝纖維既具有吸附/解析平衡快的特點，又有較高的樣品吸附容量，同時基于其無孔的特性，便于微量樣品的處理。該器件的分離凈化有兩種不同模式其一是干擾物被選擇性吸附在纖維材料上，而目標物不被吸附，直接在壓力下被導入系統的檢測部分，而后干擾物再被清洗出去，進入廢液；其二是目標物首先被選擇性吸附在纖維上，干擾物被清洗進入廢液，而后選用另一種流動相將目標物再洗脫下來，被導入系統的檢測部分。這一組件與第一種使用官能化中空纖維膜的壓力透析組件相比，有大于幾十倍的吸附容量，非常適于將小分子目標物與小分子干擾物分離，或將大分子目標物與大分子干擾物分離，從而達到樣品凈化的目的。其缺點主要在于使用目標物的吸附模式時，需要吸附和解析兩步才能完成。該組件與整個系統的集成方式與前兩種類似。圖5為實施例I中雙酚A濃度與共振信號的標準曲線。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明方法的具體操作過程作進一步的詳細說明。實施例I :在線分析樣品中的雙酚A
本實施例中對樣品中雙酚A的在線分析按下述步驟進行
(I)在線分析裝置的建立
根據本實施例的目標分析物雙酚A (分子量為228Da，小于IOkDa)的性質，樣品凈化模塊選擇壓力透析除去大分子模式，芯片選擇經雙酚A修飾的SA芯片；進樣方式選擇樣品和適配體在混合池進行混合后進樣。(2)樣品中雙酚A的在線分析
將流動相溶液3中的載流液經連接組件11中的載流入口通入在線分析裝置，以保證始終有溶液流過芯片13表面。首先，利用微流泵4將含10 μ L雙酚A的樣品由進樣瓶I經微型膜透析組件7，去除干擾物，獲得干擾小的目標分析物，置于混合池9中；其次，利用微流泵5將30 μ L濃度為50 μ g/L的雙酚A適配體從樣品瓶2中加入混合池9中；此時樣品與適配體在混合池9中進行結合；未結合的適配體隨溶液經連接組件11通過微射流卡盤12，流過芯片13表面被檢測，此時收集信號即可實現樣品中雙酚A的在線分析；最后，流動相和樣品再經微射流卡盤12和連接組件11流入廢液瓶14。(3)殘留雙酚A的去除與芯片的再生
用5 μ L含lOmmol/L氫氧化鈉與質量濃度為O. 001%十二烷基磺酸鈉的混合溶液通入在線分析裝置，即實現管道中殘留雙酚A的去除與芯片表面的再生。首先制定內嵌樣品凈化模塊的表面等離子共振在線分析水樣中含不同濃度雙酚A的標準溶液的SPR信號曲線。將10 μ L濃度為O. 5、I、2、4、8和Wyg/L的雙酚A標準溶液分別進行在線分析，收集信號即可得到對應的共振信號曲線。樣品中雙酚A的濃度越高，通入雙酚A，雙酚A適配體混合溶液所對應的共振信號越弱。通過對濃度與SPR共振信號大小作圖，得到雙酚A濃度與SPR共振信號的標準曲線，如圖5所示。共振信號大小與雙酚A濃度成反比。通過對未知樣品的在線分析，獲得SPR共振信號，由該標準曲線可計算出該樣品的雙酚A含量。實施例2 :在線分析血液中的凝血酶含量
本實施例中對血液中的凝血酶含量分析按下述步驟進行
(I)在線分析裝置的建立
將微型膜透析模塊連接在樣品進樣器和連接組件之間，根據本實施例的目標分析物凝血酶(分子量為37kDa，大于IOkDa)的性質，選擇壓力透析除去小分子模式的微型膜透析組件，芯片直接選擇鏈霉親和素修飾的SA芯片。(2)血液中凝血酶的在線分析
首先將5 μ L經生物素修飾的凝血酶適配體通過微泵5流經混合池9、連接組件11、微射流卡盤12，最后在SA芯片上與鏈霉親和素進行連接；再將5 μ L濃度為O. 125,0. 25、0. 5、
I.0,2. O和4. O μ g/L的凝血酶樣品，加入微型膜透析組件7，去除小分子干擾物，流經混合池9、連接組件11、微射流卡盤12，在芯片上進行信號檢測，并根據信號與濃度大小繪制標準曲線。
再將未知度的血樣通入在線分析裝置，收集信號，根據標準曲線即可計算出血樣中凝血酶的濃度。(3)凝血酶的去除與芯片的再生
用5 μ L含lOmmol/L氫氧化鈉與質量濃度為O. 001%十二烷基磺酸鈉的混合溶液通入在線分析裝置，即實現管道中殘留雙酚A的去除與芯片表面的再生。本發明為了敘述的準確和方便，在實施例中分別以雙酚A (小分子)和凝血酶(大分子)為例進行詳細描述，但本發明同樣適用于其他物質的測定。此外，根據實施例I和實施例2的方法進行檢測樣品，與現有表面等離子體檢測技術相比，提高了復雜樣品的檢測準確度，總體檢測時間比傳統方法(分開預處理+檢測)縮短2倍以上，減少了大量干擾物的干擾，芯片壽命延長2倍以上，可獲得準確的檢測結果。
權利要求
1.一種表面等離子共振譜儀，包括樣品瓶、適配體或抗體溶液、流動相、微流泵、微型膜透析組件、廢液瓶、混合池、微流泵、連接組件、微射流卡盤、傳感器芯片和光學檢測系統，該儀器在樣品引入的通道上嵌入了凈化模塊，即微型膜透析組件，所述的微型膜透析組件內部由表面功能化的中空纖維膜組成，位于樣品進樣接頭與微量混合池之間。
2.如權利要求I所述的表面等離子共振儀，所述的微型膜透析組件，具體包括常規壓力透析去除大分子模式、常規壓力透析去除小分子模式和接枝纖維吸附-解析模式三種模式的膜組件，檢測過程根據目標分析物的性質進行選擇或組合，以實現樣品凈化，從而提高分析準確性； (O當目標分析物為分子量小于IOkDa的小分子時，選擇壓力透析去除大分子模式組件，該組件內部是由孔徑在5-50納米的中空纖維膜組成，其內部流道為樣品中的小分子目標檢測物，在通過進樣閥進入膜透析組件后，在泵所提供的氣壓或液壓下，透過中空纖維膜壁上的孔進入表面等離子共振儀的檢測池，大分子干擾物留在纖維空腔內，經清洗進入廢液池； (2)當目標分析物為分子量大于IOkDa的大分子時，選擇壓力透析去除小分子模式組件；該組件內部是由孔徑在5-50納米的中空纖維膜組成，其內部流道為樣品中小分子干擾物被透析出來后，進入廢液池；而大分子目標物則通過中空纖維膜的內部被導入檢測區域； (3)當目標分析物或干擾物為可被選擇性吸附時，選擇接枝纖維吸附-解析模式組件；該組件內部是由官能化接枝的無孔中空纖維膜組成；該組件的分離凈化過程有兩種不同方式其一是干擾物被選擇性吸附在纖維材料上，而目標物不被吸附，直接在壓力下被導入系統的檢測部分，而后干擾物再被清洗出去，進入廢液；其二是目標物首先被選擇性吸附在纖維上，干擾物被清洗進入廢液，而后選用另一種流動相將目標物再洗脫下來，被導入系統的檢測部分。
3.如權利要求I所述的表面等離子共振儀，其特征在于，所述的微型膜透析組件，針對不同樣品，采用多種官能化接枝纖維與中空纖維膜材料。
4.如權利要求3所述的表面等離子共振儀，其特征在于，所述的官能團為氨基和/或羧基。
5.權利要求I所述的表面等離子共振譜儀的應用方法，包括下述步驟 (1)根據樣品的復雜程度以及目標分析物的特性，從壓力透析去除大分子、壓力透析去除小分子、吸附-解析等三種模式的微型膜透析組件進行選擇或組合，并將其置于樣品進樣接頭與微量混合池之間； (2)根據目標分析物的分子量大小選擇傳感器芯片，對于分子量大于IOkDa的目標分析物，直接選用鏈霉親和素修飾的芯片；對于分子量小于IOkDa的分析物，則選用該分析物修飾的芯片； (3)根據目標物分子量的大小選擇樣品和適配體進樣方式，對于分子量大于IOkDa的分析物，先將生物素修飾的適配體或抗體通入微射流卡盤，流經傳感器芯片進行連接，再將樣品注入微型膜透析組件，去除干擾物后，流經微量混合池、微射流卡盤，在傳感器芯片上進行檢測；對于分子量小于IOkDa的分析物，則先將樣品經微型膜透析組件凈化，進入微量混合池，與適配體或抗體進行混合，再通入微射流卡盤，流經傳感芯片檢測，再通過微射流卡盤流到廢液瓶中； (4)當液體通過傳感芯片時，光學檢測器將檢測信號，并進行數據采集和處理，對目標 分析物濃度進行分析。
全文摘要
本發明在表面等離子共振譜儀內嵌微型膜透析組件，該組件內部由表面功能化的中空纖維膜組成，建立一種無需樣品前處理的表面等離子共振檢測方法，特征是選擇或組合選擇壓力透析去除大分子、壓力透析去除小分子、吸附-解析三種模式的微型膜透析組件，并將其置于樣品進樣接頭與微量混合池之間。檢測時，先將一定量的樣品經進樣接頭通入微型膜透析組件，將目標分析物與干擾物進行快速分離，再進入微量混合池，與通過另一流道進樣的目標分析物抗體或適配體進行混合，隨后經微射流卡盤進樣，進行痕量目標分析物的在線分析。本方法具有樣品用量小、干擾小、靈敏度高、重現性好等優點，可廣泛應用于食品安全檢測和生物分子相互作用研究。
文檔編號G01N21/55GK102636461SQ20121011072
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者于艷軍, 王利兵, 蘇榮欣 申請人:王利兵