專利名稱：一種微流控芯片及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測、環境監測、臨床檢測技術領域，尤其涉及一種微流控芯片及其制備方法。
背景技術：
現有技術中用于生物檢測的方法很多，例如免疫印跡法和酶聯免疫法(ELISA法)等免疫分析方法。但這些免疫分析方法需要比較長的分析時間，液體處理過程也比較麻煩，通量比較小(每次只能檢測一個項目)，而且需要比較多的生物活性試劑，而微流控分析芯片則可以有效地克服這些缺點。微流控免疫分析方法是近些年新發展起來的一項技術，該方法以分析化學為主，結合生物化學、物理化學、免疫學等相關學科的成果，在微小結構中操控流體，被稱為微型實驗室。應用到免疫分析中，對臨床疾病診斷具有重要實用價值。例如，在分析樣本量非常少的樣品時，微流控技術表現出極強的優勢，通常需要樣品量為幾毫升的實驗在采用微流控技術后，僅需要幾微升的樣品量，大大節省了樣本和試劑的消耗量，具有廣泛的應用前景和重要的應用價值。
發明內容
為了解決現有技術中生物檢測過程中樣本用量大，操作步驟復雜的缺陷，本發明提供一種能夠同時對多種不同的樣品進行檢測的微流控芯片及其制備方法，本發明提供的微流控芯片能夠同時檢測多個樣本中的多種不同的物質，本發明提供的檢測方法操作簡單，試劑用量少，節省時間，高效準確。為了解決上述技術問題，本發明采用下述技術方案本發明提供一種微流控芯片，所述微流控芯片自下而上依次包括基底層、功能層和微流控管道層；所述功能層固定于所述基底層的上表面，所述功能層由至少兩條平行的功能條帶組成，所述功能條帶為能與特定物質起反應的材料形成的條狀帶；所述微流控管道層覆蓋在所述功能條帶上，所述微流控管道層的下表面設置有至少兩條管道，所述管道與所述的至少一條功能條帶相連通，每個管道的兩端設置有與大氣相通的通孔。所述通孔也稱為進樣孔，與大氣相通的一端的開口位于微流控管道層的上表面；為了便于將待測樣品加入到管道內，所述進樣孔分散設置，相鄰的進樣孔之間有一定的間隔。上述的特定物質指待測樣品。上述微流控管道層的每個管道與全部功能條帶相垂直并在交叉點相連通。上述微流控芯片的基底層的材料應利于吸附固定所述能與特定物質起反應的材料。例如抗體或抗原，并且不會影響所吸附的抗體和抗原的特異性反應。所述微流控管道層和基底層的材料可選用聚二甲基硅氧烷，玻璃薄片、陶瓷、高分子材料等常用的固相載體。所述高分子材料選自聚苯乙烯、聚碳酸酯等。上述微流控芯片的基底層為聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜。
上述微流控芯片的基底層和微流控管道層的材料均為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。上述微流控芯片的基底層的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微流控管道層的材料為陶瓷。 上述微流控芯片的基底層和微流控管道層的材料可以相同，也可以不同。還可以對基底層材料進行活化處理，使其以共價鍵交聯生物分子，從而提高包被效率和包被物的穩定性。微流控管道層的管道用封閉劑進行表面處理，降低管道的內表面對生物分子的吸附性，進而使得樣本中的待檢物質可以更少量的被管道吸附，從而提高檢測靈敏度。上述基底層厚度為0. 5_2mm，微流控管道層的底部分布長方體管道，長方體管道寬0. 01_2mm,高0. 01-2mm,長10-50mm,管道之間間隔管道兩端為進樣孔,進樣孔直徑
l-2mm,垂直距離(或稱高度)I-4mm ;上述管道的橫截面也可以是半圓形，直徑為0. 01-2mm,優選的，半圓形的直徑為0. 5-0. 7mm。微流控管道層的長、寬、高與長方體管道的盡寸和進樣孔的高度相適應，通常，微流控管道層的長15-60_、寬0. 1-20_、高1-4_。上述微流控管道層通過機械加工，精密機加工，模塑工藝，刻蝕，納米壓印和/或復模法制備。上述能與特定物質起反應的材料選自生物材料、人工合成的高分子材料、受體或藥物分子的結合靶物質。所述生物材料包括抗體、抗原、DNA、RNA、肽鏈、蛋白質或其組合。進一步的，上述功能條帶選自包被抗體條帶、包被抗原條帶、或其組合。上述基底層和微流控管道層緊密貼合在一起。上述基底層和微流控管道層利用離子氧化其相鄰的表面，進而通過化學鍵緊密貼合在一起。還可以通過粘結劑，如環氧樹脂將微流控管道層和基底層粘結在一起。上述功能條帶選自促甲狀腺激素(TSH)包被抗體條帶、催乳素(PRL)包被抗體條帶、促黃體生成激素(LH)包被抗體條帶、生長激素(GH)包被抗體條帶、卵泡刺激素(FSH)包被抗體條帶、皮質醇(Cor)包被抗體條帶或其組合；TSH包被抗體濃度為10-100 ii g/ml ；PRL包被抗體濃度為IO-IOOii g/ml ;LH包被抗體濃度為10-100 y g/ml ;GH包被抗體濃度為10-100 u g/ml ；FSH包被抗體濃度為10-100 u g/ml ；Cor包被抗體濃度為10-100 u g/ml。進一步的，上述TSH包被抗體濃度為50 ii g/ml ;PRL包被抗體濃度為40 y g/ml ；LH包被抗體濃度為25 V- g/ml ；GH包被抗體濃度為50 V- g/ml ；FSH包被抗體濃度為27 U g/ml ；Cor包被抗體濃度為72 ii g/ml。在本發明的另一個實施方式中，上述功能條帶為腫瘤標志物AFP包被抗體條帶；AFP包被抗體濃度為10-100 u g/ml。本發明還提供一種標記物混合液，包括標記物、稀釋劑，所述標記物為標記的生物材料，該標記物能夠與待測樣品起反應并與待測樣品結合在一起；所述待測樣品能夠與本發明提供的微流控芯片的功能條帶中的材料起反應并結合在一起。所述生物材料選自抗體、抗原、肽、DNA、RNA、蛋白質或其組合。上述標記物為標記抗體,標記抗原，或其組合。進一步的，上述標記物混合液包括(I) TSH、PRL、LH、GH、FSH的標記抗體，所述標記抗體的濃度均為1_10 U g/ml ；(2) Cor的標記抗原，濃度為1-10 U g/ml ；(3)穩定劑。優選的，采用的稀釋劑和穩定劑均為未稀釋的新生牛血清。
本發明還提供上述的微流控芯片的制備方法，所述制備方法包括下述步驟(I)將能與特定物質起反應的材料包被或吸附在基底層上，形成功能條帶；(2)將微流控管道層貼合在步驟(I)所得基底層的上表面；所述微流控管道層的管道與所述功能條帶相垂直并在交叉點相連通；(3)用封閉劑封閉步驟⑵中的管道，之后洗滌管道；(4)干燥，即得所述微流控芯片。進一步的，上述的微流控芯片的制備方法包括下述步驟(I)、將微流控管道層覆蓋于基底層上，向微流控管道層的管道內分別通入包被抗體或抗原，使之固定在基底層相應區域，形成功能條帶；(2)、移除步驟⑴中微流控管道層；(3)、取清潔的微流控管道層，對步驟(I)所得的基底層的帶有功能條帶的表面和微流控管道層的下表面進行離子氧化處理，使微流控管道層和基底層貼合在一起；所述微流控管道層的管道與所述包被抗體條帶相垂直并在交叉點相連通；(4)、向步驟(3)中微流控管道層的管道內通入未稀釋的新生牛血清，封閉60-200分鐘后，在管道內通入PBS沖洗3-4次；(5)干燥，即得所述微流控芯片。本發明還提供上述的微流控芯片的使用方法，所述使用方法包括下述步驟(I)將待測樣品與上述的相應標記物混合液相混合；(2)將步驟(I)所得的混合液通入微流控管道層的管道內，培育30分鐘至2小時；(3)向各管道內通入PBS沖洗3-4次后，移除管道層，在反應區域內加入相應試劑；(4)根據試劑性質，檢測反應區域的顯色、發光或反射性；(5)根據步驟⑷的結果確定樣品中的目標抗體。用于標記的物質可以是酶、同位素、有機熒光染料或熒光量子點。用于標記抗體的酶較多，常用的有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和3 -半乳糖苷酶等。常用的封閉劑有0.05% -10%的BSA、10% -100%的新生牛血清、I %明膠、5%脫脂奶粉。本發明采用的封閉劑和穩定劑優選100%新生牛血清(指未稀釋的新生牛血清)，由新出生10天內的小牛采血制成,蛋白含量為3. 5%-5% (w/v, g/100ml)。本發明可以采用現有制備包被抗體和標記抗原/抗體的方法。上述微流控芯片主要用于高效篩選，環境監測，生物分析，臨床檢測，食品安全檢測，動物檢測等用途。在某些藥物分子的研發和篩選中，可以將一系列受體或藥物分子的結合靶物質固定在上述微流控芯片上，然后同時將篩選的多種物質同時通過該微流控芯片，從而確定哪些分子能與哪種受體或靶物質相結合，從而實現高效篩選；同樣原理也可以用于監測環境中存在哪些污染物質或確定引起污染的物質的特征；微流控芯片也可以用于生物分子的相互作用分析，從而揭示生物分子之間的相互關系；在臨床檢測及監測方面也有重要的應用，可用于腫瘤標志物、激素、病毒、抗生素、毒品等的聯合檢測。在食品安全檢測方面，可以用于檢測食品內是否含有禁用的物質，如三聚氰氨、瘦肉精；可以 測定食品中的農藥殘留、抗生素殘留、毒素(如黃曲霉素)等。
與現有技術相比，本發明提供的微流控芯片能夠同時對多種不同的樣品進行檢測，具有體積小、比表面積大、反應時間短、分析速度快、試劑和樣品用量少、多樣品多指標同時檢測等優點，本發明提供的檢測技術操作簡單，高效準確。利用本發明提供的微流控芯片進行生物檢測，準確率高，抗干擾性強，檢測靈敏度和特異性靈敏度均較高，而且制備工藝簡單，檢測操作方便且易掌握，生產成本低，檢測費用少，不僅適合專業檢測機構使用，也適合例行體檢、采/供血、疫情檢測、醫療臨床檢測等方面的使用。
圖I為本發明提供的微流控芯片的立體結構示意圖，其中，微流控管道層由透明材料制成；圖2為本發明提供的微流控芯片的檢測方法示意圖；圖3為本發明提供的微流控芯片的微流控管道層俯視圖；圖4為本發明提供的微流控芯片檢測樣品結果的發光成像圖；圖5為本發明提供的微流控芯片的微流控管道層的立體圖；圖6為本發明提供的微流控芯片的微流控管道層的結構示意圖；圖7為本發明提供的微流控芯片的基底層的結構示意圖；圖8為本發明提供的微流控芯片的微流控管道層的結構示意圖；圖9為圖8所示微流控管道層的A-A剖面結構示意圖；圖10為本發明提供的微流控芯片檢測AFP結果的發光成像圖；圖11為本發明提供的微流控芯片檢測Cor結果的校準曲線圖；圖12為本發明提供的微流控芯片檢測AFP結果的標準曲線圖。
具體實施例方式如圖I所示，本發明提供的微流控芯片包括基底層I和微流控管道層2，兩層緊密貼合，基底層I的厚度為0. 5-2mm，微流控管道層2的底部分布七個平行的長方體管道4，管道兩端為進樣孔5，進樣孔5與大氣連通。如圖2所示，本發明提供的微流控芯片(檢測裝置)的檢測示意圖，在微流控管道層依次通入TSH、PRL、LH、GH、FSH、Cor的包被抗體，使之固定在基底層I相應區域，棄去管道，在與包被抗體成直角的方向上，平行覆蓋上兩塊微流控管道層2，在管道4內通入不同 的抗原抗體，進行檢測。如圖3所示，本發明提供的檢測裝置的微流控管道層2，底部分布五個平行的長方體管道4,長方體管道4寬0. 5mm,高0. 7mm,長40mm,管道4之間間隔2mm,管道兩端為進樣孔5，進樣孔5直徑為2_，相鄰進樣孔5的垂直距離(間隔)3mm,進樣孔5與大氣連通。本發明所用的材料和設備均為現有材料和設備，例如促甲狀腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、促黃體生成激素(LH)、生長激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、皮質醇(Cor)的包被抗體,抗原，HRP標記抗體，HRP標記抗原均為北京潤德康泰生物科技有限公司生產，具體內容如表I所示，表I原料名稱，貨號和生產廠家
權利要求
1.一種微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片自下而上依次包括基底層、功能層和微流控管道層；所述功能層固定于所述基底層的上表面，所述功能層由至少兩條平行的功能條帶組成，所述功能條帶為能與特定物質起反應的材料形成的條狀帶；所述微流控管道層覆蓋在所述功能條帶上，所述微流控管道層的下表面設置有至少兩條管道，所述管道與所述的至少一條功能條帶相連通，每個管道的兩端設置有與大氣相通的通孔。
2.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控管道層的每個管道與全部功能條帶相垂直并在交叉點相連通。
3.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底層為聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜。
4.根據權利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控管道層的材料為陶瓷。
5.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述能與特定物質起反應的材料 選自生物材料、人工合成的高分子材料、受體或藥物分子的結合靶物質。
6.根據權利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述生物材料選自抗體、抗原、DNA、RNA、肽鏈、蛋白質或其組合。
7.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能條帶為包被抗體條帶、包被抗原條帶、或其組合。
8.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底層的上表面和功能層的上表面，與所述微流控管道層的下表面經離子氧化處理；所述基底層和功能層的上表面與所述微流控管道層的下表面貼合在一起。
9.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能條帶選自促甲狀腺激素(TSH)包被抗體條帶、催乳素(PRL)包被抗體條帶、促黃體生成激素(LH)包被抗體條帶、生長激素(GH)包被抗體條帶、卵泡刺激素(FSH)包被抗體條帶、皮質醇(Cor)包被抗體條帶或其組合；TSH包被抗體濃度為IO-IOOii g/ml ;PRL包被抗體濃度為10-100 y g/ml ；LH包被抗體濃度為IO-IOOii g/ml ;GH包被抗體濃度為IO-IOOii g/ml ;FSH包被抗體濃度為10-100 Ii g/ml ；Cor 包被抗體濃度為 10-100 y g/ml。
10.根據權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能條帶為腫瘤標志物AFP包被抗體條帶；AFP包被抗體濃度為10-100 u g/ml。
11.一種標記物混合液，包括標記物和稀釋劑，其特征在于，所述標記物為標記的生物材料，該標記物能夠與待測樣品起反應并與待測樣品結合在一起；所述待測樣品能夠與權利要求I至10之一所述的功能條帶中的材料起反應并結合在一起。
12.根據權利要求11所述的標記物混合液，其特征在于，所述生物材料選自抗體、抗原、肽、DNA、RNA、蛋白質或其組合。
13.根據權利要求12所述的標記物混合液，其特征在于，所述標記物為標記抗體，標記抗原，或其組合。
14.根據權利要求13所述的標記物混合液，其特征在于，標記物混合液包括 (1)TSH、PRL、LH、GH、FSH的標記抗體，所述標記抗體的濃度均為1_10 u g/ml ； (2)Cor的標記抗原,濃度為1-10 u g/ml ； (3)穩定劑。
15.根據權利要求I至8之一所述的微流控芯片的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下述步驟 (1)將能與特定物質起反應的材料包被或吸附在基底層上，形成功能條帶； (2)將微流控管道層貼合在步驟(I)所得基底層的上表面；所述微流控管道層的管道與所述功能條帶相垂直并在交叉點相連通； (3)用封閉劑封閉步驟(2)中的管道，之后洗滌管道； (4)干燥，即得所述微流控芯片。
16.根據權利要求9或10所述的微流控芯片的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下述步驟 (1)、將微流控管道層覆蓋于基底層上，向微流控管道層的管道內分別通入包被抗體，使之固定在基底層相應區域，形成功能條帶； (2)、移除步驟(I)中微流控管道層； (3)、取清潔的微流控管道層，對步驟(I)所得的基底層的帶有功能條帶的表面和微流控管道層的下表面進行離子氧化處理，使微流控管道層和基底層貼合在一起；所述微流控管道層的管道與所述包被抗體條帶相垂直并在交叉點相連通； (4)、向步驟(3)中微流控管道層的管道內通入未稀釋的新生牛血清，封閉60-200分鐘后，在管道內通入PBS沖洗3-4次； (5)干燥，即得所述微流控芯片。
17.根據權利要求9所述的微流控芯片的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括下述步驟 (1)將待測樣品與標記物混合液相混合； (2)將步驟(I)所得的混合液通入微流控管道層的管道內，培育30分鐘至2小時； (3)向各管道內通入PBS沖洗3-4次后，移除管道層，在反應區域內加入相應試劑； (4)根據試劑性質，檢測反應區域的顯色、發光或反射性； (5)根據步驟(4)的結果確定樣品中的目標抗原； 上述步驟(I)中所述的標記物混合液包括 (1)TSH、PRL、LH、GH、FSH的標記抗體，所述標記抗體的濃度均為1_10 u g/ml ； (2)Cor的標記抗原,濃度為1-10 u g/ml ； (3)新生牛血清。
18.根據權利要求I至10之一所述的微流控芯片的應用，其特征在于，所述微流控芯片用于高效篩選，環境監測，生物分析，臨床檢測，食品安全檢測，動物檢測。
全文摘要
本發明涉及生物檢測、環境監測、臨床檢測技術領域，尤其涉及一種微流控芯片及其制備方法。為了解決現有技術中生物檢測過程中樣本用量大，操作步驟復雜的缺陷，本發明提供一種微流控芯片及其制備方法。所述微流控芯片包括基底層、功能層和微流控管道層；所述功能層固定在所述基底層上，其包括至少兩條平行的功能條帶，所述功能條帶為能與特定物質起反應的材料形成的條狀帶；所述微流控管道層設置有至少兩條管道，所述管道與所述的至少一條功能條帶相連通，每個管道的兩端設置有與大氣相通的通孔。本發明提供的微流控芯片能夠同時檢測多個樣本中的多種不同的物質，本發明提供的檢測方法操作簡單，試劑用量少，節省時間，高效準確。
文檔編號G01N33/544GK102614948SQ201210097369
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者劉俊, 李東霞, 沈海瑩, 潘竹青, 羅次汐 申請人:北京金智捷生物科技有限公司