專利名稱：一種結核診斷組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種結核診斷組合物及其應用，屬于結核病檢測技術領域。
背景技術：
結核病是由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，據世界衛生組織資料估計，全球三分之一的人口受結核分枝桿菌感染，每年新發活動性感染病例九百多萬，死亡一百萬例以上。近年來，我國結核病發病率居高不下，每年新發病例超過一百萬，死亡近二十萬例，對我國公民健康、社會安定和經濟發展帶來嚴重危害。結核病是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病，被列為我國重大傳染病之一。雖然通過3個“全國結核病防治十年規劃”，我國結核病疫情上升勢頭得到有效遏制，但我國仍是全球22個結核病高負擔國家之一，目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病人數的14%，位居全球第二位，有活動性肺結核患者約450萬，每年新增病例100萬以上。目前，臨床診斷結核感染的方法有限。結核菌素試驗(TST)是臨床常用篩查結核的免疫學方法，雖然操作簡單，觀察結果方便，但由于其較高的假陽性，對臨床結核病的診斷意義有限；細菌學是診斷結核的金標準，但培養所需時間較長，而且陽性率取決于采集標本中細菌的數量而導致陽性率低，不利于早期診斷與治療；影像學作為輔助診斷方法，對活動性肺結核診斷有一定價值，但對肺外結核診斷存在困難，且用于結核診斷特異性較差；血清學檢測如ELISA、金標等檢測抗原或抗體，極難檢測活性結核病，鑒于其高的假陰性和假陽性，2011年7月WHO已明確提出停止使用活性結核病血液檢測方法。結核菌感染引起的T細胞Y干擾素釋放試驗(IGRA)是近年發展起來的一種新方法，可用于診斷結核(TB)和潛伏結核感染(LTBI)，美國認為IGRA可代替結核菌素皮試 (TST)，英國相關指南推薦聯用IGRA和TST兩種測試。已研制開發成功的QuantiFERON-TB Gold test(Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia)和 the T-SPOT. TB test (Oxford Immunotec Limited, Abingdon, United Kingdom)，以 RDl 區編碼的結核特異性抗原6KD早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和10KD培養濾過蛋白(CFP-10)為刺激源，檢測外周血中結核特異性釋放Y干擾素的T淋巴細胞，特異性、靈敏度高，而且對于結核感染，尤其是自然感染和卡介苗接種等潛伏感染的診斷也具有較強的特異性。現有診斷試劑靈敏度有待于進一步提聞，基于ELISP0T技術的診斷試劑抗原妝庫組成復雜，操作繁瑣，且由于專利權的保護，使得我國引進相關產品進行臨床診斷時成本極高，不適合我國特殊的流行病學背景下廣泛推廣。
發明內容
本發明在現有T細胞Y干擾素釋放試驗診斷技術的基礎上，應用RDl區ESAT-6 和CFP-10抗原，綜合結核分枝桿菌特異性表達的Rv3615c抗原，形成一個組合抗原多肽庫， 并結合ELISP0T技術對結核病例和健康志愿者體內結核特異性T細胞進行檢測，從而評價該組合抗原多肽庫用于結核診斷的靈敏度和特異性。
Rv3615c抗原具有較高的T細胞免疫原性，其反應強度與ESAT-6和CFP-10相比較水平相當。本發明在現有診斷試劑中常用抗原ESAT-6和CFP-10基礎上，發現Rv3615c抗原可用于結核特異性診斷，提供了一種包括三個抗原衍生多肽庫的組合物，并與這三個抗原分別組成的單抗原肽庫或兩抗原組合肽庫在結核病例及健康志愿者中的反應情況進行比較。本發明的第一方面提供了一種用于結核診斷的組合物，由抗原ESAT-6衍生多肽、 抗原CFP-10衍生多肽和抗原Rv3615c衍生多肽中的任意2種或3種組成；多肽的序列見表I.所述抗原ESAT-6氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述抗原CFP-10氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述抗原Rv3615c氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。所述ESAT-6衍生多肽氨基酸序列選自SEQ ID NO. 4-20中的一種或多種。所述CFP-10衍生多肽氨基酸序列選自SEQ ID NO. 21-38中的一種或多種。所述Rv3615c衍生多肽氨基酸序列選自SEQ ID NO. 39-57的一種或多種。組合物中的多肽可以是上述多肽的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有相同抗原性的衍生多肽或其類似物。在一個優選的實施方案中，所述組合物由序列為SEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 57的
多肽組成。本發明還提供了編碼所述組合物的DNA分子，以及含有該DNA分子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系和重組菌。本發明還提供了所述組合物在體外檢測結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應中的應用，其特征在于人淋巴細胞經過所述組合物刺激后，檢測結核分枝桿菌特異性T細胞分泌的細胞因子。在特定的實施方案中，所述結核分枝桿菌特異性T細胞分泌的細胞因子選自伽馬干擾素、白細胞介素2和腫瘤壞死因子α ;所述結核分枝桿菌特異性T細胞分泌的細胞因子的檢測方法選自酶聯免疫斑點實驗(ELISP0T)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、免疫膠體金實驗、細胞內因子染色和T細胞增殖實驗；所述人淋巴細胞來源于外周血、腦脊液或胸水。本發明還提供了所述組合物在制備結核診斷試劑中的應用。本發明的另一方面還提供了一種結核診斷試劑盒，其特征在于，組成如下I)權利要求1-3任一項所述的組合物；2)植物凝集素溶液或T細胞非特異性陽性刺激物；3) ELISP0T 用 96 孔 PVDF 膜板；4)人Y-干擾素單克隆抗體，生物素標記的人Y-干擾素單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素及辣根過氧化物酶反應底物；5) ELISP0T檢測試劑及耗材。本發明的第三方面提供了一種結核疫苗，其特征在于含有所述的組合物、DNA分子、重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌的組合或其任一種。本發明相對于現有技術具有以下優點與單個抗原分別作為抗原進行刺激相比較，一方面由于組合了多個抗原的反應，能夠減少由低頻率的單一抗原特異性T細胞造成的假陰性，從而提高檢測的靈敏度；另一方面由于組合了三個抗原，孔內斑點數將顯著增多，與單抗原孔相比較檢測結果判斷更加顯著清楚。另外，組合肽庫形式由于減少了刺激孔，因而降低了診斷成本，簡化了檢測設計及操作過程。
圖I :組合肽庫及三個抗原單抗原獨立肽庫在結核病例和健康志愿者中的反應水平(ESAT-6、CFP-10, Rv3615c :三個抗原的單抗原獨立肽庫；E+Rv3615c, C+Rv3615c ESAT-6、CFP-10分別與Rv3615c抗原組合成兩抗原組合肽庫；EC+Rv3615c :三抗原組合肽庫)；* 0. 01 < P < O. 05，** p < O. 01.圖2 :結核病例與健康志愿者對Rv3615c多肽庫的ELI SPOT反應直觀圖(F28、F31 結核菌感染病例反應；H1 :健康志愿者反應；M :空白對照；ESAT-6、CFP-10、Rv3615c :三個抗原的單抗原獨立肽庫；EC+Rv3615c :組合肽庫)圖3 :組合肽庫免疫BALB/c小鼠后T細胞免疫反應水平評價。免疫組3只，PBS安慰劑對照組3只，分別于第1，10,21,28天免疫，最后一次免疫后第10天檢測，圖中ESAT-6、CFP-10、Rv3615c :三個抗原的獨立抗原肽庫；EC+Rv3615c :三抗原組合肽庫。
具體實施例方式實施例I組合物構成用于結核診斷的組合物，由抗原ESAT-6衍生多肽、抗原CFP-10衍生多肽和抗原 Rv3615c衍生多肽構成；所述抗原ESAT-6氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述抗原CFP-10氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述抗原Rv3615c氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。所述ESAT-6衍生多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 20所示。所述CFP-10衍生多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 21到SEQ ID NO. 38所示。所述Rv3615c衍生多肽氨基酸序列如SEQ ID NO. 39到SEQ ID NO. 57所示。實施例2抗原應用于檢測試劑盒的開發本發明所保護的抗原可用于結核分枝桿菌感染的檢測，形成臨床或實驗室診斷用試劑盒。檢測試劑盒包含I.實施例I中所述的混合物；2.植物凝集素(PHA)溶液或其他T細胞非特異性陽性刺激物；3. ELISP0T 96 孔 PVDF 膜型板；4.人Y -干擾素單克隆抗體(一抗)，生物素標記的人Y -干擾素單克隆檢測抗體(二抗)，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素及辣根過氧化物酶反應底物；5.其他ELISP0T檢測所需試劑及耗材。實施例3抗原應用于結核分枝桿菌感染臨床檢測。A.外周血淋巴細胞分離
本發明所涉及志愿者病例篩選標準為I)、臨床主治醫生根據志愿者臨床表現確診為肺結核；2)、影像學顯示肺部有陰影；3)、結核菌培養陽性或者陰性。健康志愿者篩選標準為I)、無結核臨床癥狀；2)、無其他疾病或感染。入選的結核病例及健康志愿者年齡在18-60歲之間，性別按照I ;1隨機挑選。本發明所用的T淋巴細胞來自個體的靜脈外周血。經過篩選的個體經主治醫生體檢合格后，由試驗者告知具體項目流程及所需血液的數量，經志愿者同意并簽署知情同意書，由臨床醫生對志愿者進行采血。最終本項目篩選了 51例結核病志愿者及26例健康志愿者，采血時適用含有肝素鋰抗凝的一次性真空采血管(格雷納，奧地利)，每名志愿者采血約8ml。之后I)、先將新鮮采集的外周血用121°C高壓滅菌冷卻后的磷酸鹽緩沖液(PBS， pH7. 4)稀釋一倍，即8ml外周血加入到8ml的PBS中混勻，將稀釋的血樣小心加入到事先準備好的15ml淋巴細胞分離液中，緩慢加入，避免界面混亂。2)、25 °C條件下用水平離心機700g或2000rpm/min離心20min。離心后的樣品分四層，將上層血漿用巴斯德移液管吸出，之后小心吸出淋巴細胞層(PBMCs)至新的離心管中。3)、用等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 4)稀釋吸出的淋巴細胞層，之后離心 (2000rpm,10min,25°C )。棄掉上清，重懸后加入無血清RPIM1640約7ml清洗，離心1500rpm/min, 5min, 25。。。棄上清，重懸，加7_8ml含10%血清的RPIM1640培養基清洗,離心1500rpm/min, 5min,25°C。4)、棄掉上清后用Iml含10%血清的RPM1640培養基重懸，取適量于全血生化分析儀上進行細胞計數，并最終調整至2. 5 X IO6細胞/ml密度；B.抗原制備將每條多肽以DMSO溶解，之后將實施例I中SEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 57共計 54條多肽等量混合，形成三抗原組合肽庫(EC+Rv3615c) ^fSEQ ID NO. 4到SEQ ID NO. 20 共計17條多肽混合，形成ESAT-6肽庫；將SEQ ID NO. 21到SEQ ID NO. 38共計18條多肽混合，形成CFP-10肽庫^fSEQ ID NO. 39到SEQ ID NO. 57共計19條多肽混合，形成Rv3615c 肽庫；所有肽庫用含10%胎牛血清(Gibco)的RPIM1640培養基稀釋至終濃度。C、ELISP0T檢測組合抗原肽庫特異性T細胞ELISP0T板提前12小時以上用磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)稀釋的抗人Y干擾素單抗包被，4°C平放，在加入刺激抗原和細胞前用含10%血清(Gibco)的RPM1640培養基室溫條件下封閉I小時。將抗原多肽庫用10%血清(Gibco)的RPM1640培養基稀釋至終濃度，向ELISP0T 板孔內每孔加入100μ 1，每個肽庫刺激設復孔，另設無多肽空白對照孔和PHA(植物凝集素)刺激陽性對照孔.將稀釋后的PBMCs細胞每孔加入100 μ 1，加完后將含有100 μ I多肽稀釋液和100 μ IPBMCs稀釋液的ELISP0T板置37°C ,5% C02 ( 二氧化碳)條件下孵育18 小時。D、ELISP0T洗板及結果獲取a、孵育結束后，棄掉孔內細胞液，迅速在每孔加入200 μ I常溫的去離子水清洗2 次，之后PBST清洗3次。b、去除洗液，在吸水紙上用力扣干，每孔加入100 μ I稀釋的檢測抗體，室溫孵育
2h. οC、去除檢測抗體溶液，PBST清洗3次，之后每孔加入稀釋好的親和素-HRP結合物 100 μ I,室溫孵育Ih0d、顯色去除親和素-HRP結合物溶液，PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。在吸水紙上用力扣干，之后每孔加入100 μ I AEC底物溶液，室溫孵育15 30分鐘后，當看到清晰的斑點時，用蒸餾水沖洗膜的雙面以中止反應。e、37°C或室溫下晾干，之后將ELISP0T板置自動讀板儀(C. T. L)對ELISP0T孔內反應的點數進行計數，之后調整參數并進行質量控制，給出最終反應結果。E、結果分析本研究共涉及經過嚴格標準篩選結核病患者共計51名，健康志愿者26例。結果顯示，本發明組合抗原肽庫在結核病例中反應水平分別高于ESAT-6、CFP-10 及Rv3615c組成的單抗原獨立肽庫，且差異顯著(如圖I所示)。將ESAT-6、CFP-10及 Rv3615c三個單抗原獨立肽庫的檢測結果進行綜合評價，即只要其中一個抗原檢測結果陽性即判斷該個體反應呈陽性，結果表明，其檢測陽性率與組合抗原肽庫完全一致，陽性率均為90%。這表明，組合肽庫能夠在不降低檢測特異性的前提下，保持與三個抗原獨立肽庫綜合評價所得靈敏度一致的效果。兩個抗原組成的組合肽庫與單抗原獨立肽庫相比較，結果顯示，加入了 Rv3615c 的兩抗原肽庫比單抗原獨立肽庫T細胞反應水平明顯高(O. 01 < P < O. 05)，但與三抗原組合肽庫相比較，三抗原組合肽庫要比兩抗原組合肽庫更高(O. 01 <p <0. 05)，因此，三抗原組合肽庫形式具有最高的T細胞免疫反應水平。另外，現有基于IGRA原理進行結核分枝桿菌感染檢測主要抗原是結核分枝桿菌 RDl區的ESAT-6和CFP-10抗原。本發明結果表明，從檢測靈敏度方面與分別應用ESAT-6和 CFP-10抗原肽庫評價(88% )相比較，加入Rv3615c —定程度上提高了檢測靈敏度(90% ) (如表2所示)。因此，由于Rv3615c抗原的加入，應用本發明組合肽庫提高了在結核病例中檢測靈敏度，并且在保持高特異性前提下，能夠保持與三個抗原肽庫分別檢測綜合評價同等水平的靈敏度。陽性反應判斷標準每孔斑點數> 5且為空白對照孔斑點數兩倍以上。本實施例中所有結核病例或健康志愿者PBMCs對Rv3615c、ESAT-6和CFP-10及組合肽庫的反應均按照此標準進行量化并作出陽性或陰性反應判斷，每孔反應值超過此標準判定為陽性反應， 低于此標準判定為陰性反應。表2.各抗原肽庫診斷特異性和靈敏度統計
權利要求
1.一種結核診斷組合物，其特征在于，由抗原ESAT-6衍生多肽、抗原CFP-10衍生多肽和抗原Rv3615c衍生多肽中的任意2種或3種組成；所述ESAT-6衍生多肽選自序列為SEQ ID NO. 4-20中的一種或多種多肽，所述CFP-10衍生多肽選自序列為SEQ ID NO. 21-38中的一種或多種多肽，所述Rv3615c衍生多肽選自序列為SEQ ID NO. 39-57的一種或多種多肽。
2.根據權利要求I所述組合物，其特征在于，所述組合物由序列為SEQID NO. 4到SEQ ID NO. 57的多肽組成。
3.根據權利要求I或2所述組合物，其中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個氨基酸或幾個氨基酸且具有相同抗原性的衍生多肽或其類似物。
4.編碼權利要求1-3任一項所述組合物的DNA分子。
5.含有權利要求4所述DNA分子的重組表達載體。
6.含有權利要求4所述DNA分子的表達盒。
7.含有權利要求4所述DNA分子的轉基因細胞系。
8.含有權利要求4所述DNA分子的重組菌。
9.權利要求1-3任一項所述組合物在體外檢測結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應中的應用，其特征在于人淋巴細胞經過權利要求1-3任一項所述組合物刺激后， 檢測結核分枝桿菌特異性T細胞分泌的細胞因子。
10.根據權利要求9所述結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應的體外檢測應用，其中所述結核分枝桿菌特異性T細胞分泌的細胞因子選自伽馬干擾素、白細胞介素2 和腫瘤壞死因子α。
11.根據權利要求9所述結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應的體外檢測應用，其中所述結核分枝桿菌特異性T細胞分泌的細胞因子的檢測方法選自酶聯免疫斑點實驗(ELISP0T)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、免疫膠體金實驗、細胞內因子染色和T細胞增殖實驗。
12.根據權利要求9所述結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應的體外檢測應用，其中所述人淋巴細胞來源于外周血、腦脊液或胸水。
13.—種結核診斷試劑盒，其特征在于，組成如下1)權利要求1-3任一項所述的組合物；2)植物凝集素溶液或T細胞非特異性陽性刺激物；3)ELISP0T 用 96 孔 PVDF 膜板；4)人Y-干擾素單克隆抗體，生物素標記的人Y-干擾素單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素及辣根過氧化物酶反應底物；5)ELISP0T檢測試劑及耗材。
14.一種結核疫苗，其特征在于含有權利要求1-3任一項所述的組合物，權利要求4所述DNA分子、權利要求5所述重組表達載體、權利要求6所述表達盒、權利要求7所述轉基因細胞系或權利要求8所述重組菌的組合或其任一種。
15.權利要求1-3任一項所述組合物在制備結核診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種結核診斷組合物及其應用，具體而言，本發明提供一種結核診斷組合物由抗原ESAT-6衍生多肽、抗原CFP-10衍生多肽和抗原Rv3615c衍生多肽中的任意2種或3種組成。本發明還提供所述結合診斷組合物在體外檢測結核分枝桿菌感染引起的特異性T細胞免疫反應中的應用和制備結核診斷試劑中的應用。本發明相對現有的診斷技術降低了診斷成本，簡化了檢測設計及操作過程，顯著提高檢測的靈敏度。
文檔編號G01N33/68GK102608333SQ201210090659
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者萬康林, 張寧, 范盤生, 譚曙光, 高福 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所, 中國科學院微生物研究所, 北京曠博生物技術有限公司