專利名稱：一種胃癌血清多肽分子及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于腫瘤標志物技術領域，涉及ー種胃癌血清多肽分子及其檢測方法和應用。
背景技術：
目前全球毎年新增胃癌患者93. 4萬，其中有近40萬在中國內地。患病率和死亡率均超過世界平均水平的兩倍。胃癌的發病率隨年齡的増加而顯著升高，發病的高峰年齡在50歲 80歲。近5年研究發現，中青年人的胃癌發病率迅速増加，19歲至35歲青年人胃癌發病率比30年前翻了一番。胃癌的主要治療方法有早期切除、二期切除、局部消融、介 入治療及化療、生物治療、中藥等綜合治療。絕大多數患者在確診時已屬晚期。術后易復發轉移，放化療效果也不理想，預后多不佳。因此，急需探索新的早期診斷和早期治療的手段。血清診斷被認為是早期診斷癌癥最新、最有效的方法。它是通過尋找血液中的腫瘤標志物特別是其中的蛋白標志來評判腫瘤的發生和發展情況，從而實現對腫瘤早期診斷。人類血清中存在大量蛋白和多肽，其中部分蛋白和多肽的存在和缺失以及表達的高低與人類健康程度密切相關，成為疾病診斷的生物標志物。而目前比較公認的腫瘤標記物有CEA、CA 19-9, CA125、AFP、PSA等，但其對胃癌的篩查缺乏敏感性和特異性，因此并不能用于胃癌的診斷。
發明內容
本發明解決的問題在于提供ー種胃癌血清多肽分子及其檢測方法和應用，該分子多肽為絲氨酸蛋白酶抑制劑Al (SERPINA1)的ー個片段，是新的胃癌血清標志物。本發明是通過以下技術方案來實現ー種胃癌血清多肽分子，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。如權利要求I所述的所述的胃癌血清多肽分子，其血清當中的檢測參數為8. 47 10.55u g/mL0權利要求I所述的胃癌血清多肽分子作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。與權利要求I所述的胃癌血清多肽分子相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的制備的應用。SERPINA1蛋白作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。與SERPINA1蛋白相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的制備的應用。所述胃癌血清診斷藥物為ELISA檢測胃癌血清多肽分子的藥物。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明公開了一種胃癌血清多肽分子，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. I所不，該分子稱為SERPINA1-A。SERPINA1-A為絲氨酸蛋白酶抑制劑Al(SERPINAl)的ー個片段，其精確分子量為1545. 8道爾頓。SERPINA1-A在胃癌患者血清檢測中呈現特異性的高表達正常對照人群中血清中表達范圍為4. 87 6. 57 u g/mL ;在胃潰瘍病人血清中表達范圍為6. 58 8. 47 u g/mL ;在胃癌患者血清中表達范圍為8. 47 10. 55 y g/mL，且不同組間的表達具有極顯著差異(P < 0. 001)。鑒于SERPINA1-A在胃癌血清中特異性高表達，那么SERPINA1-A就可以作為胃癌血清診斷標志物；且其母本蛋白SERPINA1在胃癌患者血清中呈現特異性的高表達，因此，SERPINA1可應用于胃癌患者血清診斷用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-T0F-MS)檢測SERPINA1-A或ELISA方法測檢測SERPINA1的表達水平，可作為胃癌患者檢測的方法。而針對ELISA檢測胃癌血清診斷，SERPINA1就可以作為ELISA檢測藥物的新的靶點。
圖I為同一胃癌患者血清樣本的三次重復的蛋白多肽圖譜(IKDa IOKDa)；圖2為蛋白多肽峰m/z :1546在胃癌患者和正常對照組中的蛋白多肽表達差異；
圖3為胃癌患者血清蛋白多肽混合物的凝膠色譜分離圖；圖4為SERPINA1-A的MS/MS質譜鑒定圖譜；圖5為不同組別中SERPINA1蛋白的表達水平。
具體實施例方式本發明提供的胃癌血清多肽分子，是ー種新篩選的胃癌血清診斷標志物，其表達具有特異性，可應用于胃癌診斷。下面結合具體的實施例對本發明做進ー步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。具體的該胃癌血清診斷標志物的篩選為首先應用液體蛋白芯片技術分離提取胃癌患者和正常對照人群血清蛋白多肽，應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術捕獲胃癌患者和正常對照人群蛋白多肽圖譜，并且采用ClinPr0T00ls2. I軟件對比分析胃癌患者和正常人群血清蛋白多肽譜圖差異，找出組間顯著差異表達的蛋白多肽分值，在胃癌患者血清中顯著高表達的蛋白多肽峰值中篩出胃癌血清腫瘤標志物。對于所篩選的胃癌血清診斷標志物的驗證為應用HPLC將胃癌患者血清分離的蛋白多肽混合物分為20 30個組分，在對其進行ニ級質譜的鑒定，并且對鑒定出的蛋白多肽采用酶聯免疫法進行血清回歸分析，結果血清回歸驗證證明其在胃癌患者血清中顯著高表達，具有特異性，可以作為胃癌患者血清篩查的生物標志物。I、樣本的采集與處理采集自西安交通大學第一附屬醫院腫瘤外科(2008年12月至2009年6月)的64例(男性32例；女性32例；平均年齡59歲)病理確診的胃癌患者和32例正常對照人群(男性16例；女性16例；平均年齡56歲)。樣本考慮年齡、性別、采集時間、儲存條件是否一致、有無基礎疾病等因素。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(黃帽、有隔離膠)采集全血5mL，室溫靜置30min ;室溫離心5min (3000g)，將上層血清分裝成100 y L/管，立即保存于_80°C，避免反復凍融。I. 2試劑與儀器
血清蛋白的提取采用德國布魯克公司的磁珠試劑盒“弱陽離子型”(MB-WCX)，以及光譜純(HPLC級)こ腈、三氟こ酸(德國Merck公司)、a -氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(美國Sigma公司)。磁珠分離器、600/384 AnchorChip祀板和AutoFlex III基質輔助激光解析電離も f時間瘋I普(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flignt Mass
Spectrometry, MALDI-TOF-MS)(德國 Bruker Daltonics 公司)。2、血清蛋白樣本的制備運用弱陽離子(MB-WCX)磁珠捕獲血清蛋白多肽，具體操作步驟如下①用混勻器完全混勻磁珠懸浮液Imin ；②加10 ii L MB-WCX結合液以及10 ii L MB-WCX磁珠至PCR管，混勻后加5 U L血清， 混勻至少5次,靜置5min ；③將PCR管放入磁柱分離器，使磁珠貼壁lmin，液體清澈后棄上清液；④加100 u L MB-WCX沖洗液，在磁柱分離器上前后移動10次PCR管，磁珠貼壁后棄上清液，重復步驟③、④兩次；⑤加5 ii L MB-WCX洗脫液洗滌貼壁的磁珠，并反復吹打10次，磁珠貼壁2min，將上清液移入干凈的尚心管；⑥加5iiL MB-WCX穩定液至離心管并混勻，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS檢測或者凍存于_20°C冰箱24h之內質譜分析。2. 2質譜分析將分離收集得到的蛋白樣本I ii L與10 ii L的基質a -氰基_4_羥基肉桂酸混勻，取I U L點在Anchorchip祀板上(德國Bruker公司)，姆個樣本分別點三個祀點以作三次重復。待室溫干燥后將靶板放入質譜儀進行飛行時間質譜分析，采用FlexContool 2.0軟件進行標準品校正后開始樣本檢測，每個樣本要經過總共300次激光打靶(5次點靶，每次打靶2X30次)之后生成質譜圖，獲得由不同質核比(m/z)組成的蛋白多肽譜圖。采用ClinProTools2. I軟件結合遺傳算法等生物統計學和生物信息學方法分析兩組血清樣本的蛋白多肽圖譜。進行歸ー化平滑處理總離子流圖，消除化學及電物理噪聲；分析組間差異蛋白并計算差異大小，按差異大小由大到小排列，找出組間表達具有顯著差異的蛋白多肽峰值(P < 0. 001)。將胃癌患者組和正常對照組血清樣本采用磁珠分離系統處理后，經過MALDI-T0F-MS分析后，對胃癌患者組和正常對照組的每個樣本進行蛋白多肽圖譜繪制，在分子量范圍IOOODa IOOOODa共檢測到81個蛋白多肽峰圖，且每個樣本的三次重復穩定性較高，三個樣本的檢測結果如圖I所示。采用ClinProTools 2. I軟件對質譜捕獲的胃癌患者和正常對照組的血清蛋白多肽圖譜進行分析，將胃癌患者血清多肽譜圖與正常人群進行比較分析，共檢測到13個具有極顯著差異的蛋白多肽峰圖(P< 0.001)，其中13個蛋白多肽峰圖在兩組間具有極顯著差異(P < 0. 001)，其中7個蛋白多肽在胃癌患者中表達顯著下調，其余6個蛋白多肽在胃癌患者中表達顯著上調，具體如表I所示。
權利要求
1.ー種胃癌血清多肽分子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.如權利要求I所述的所述的胃癌血清多肽分子，其特征在于，其血清當中的檢測參數為 8. 47 10. 55u g/mLo
3.權利要求I所述的胃癌血清多肽分子作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。
4.與權利要求I所述的胃癌血清多肽分子相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的制備的應用。
5.SERPINA1蛋白作為胃癌血清診斷藥物的靶點的應用。
6.與SERPINA1蛋白相結合的分子在胃癌血清診斷藥物的制備的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述胃癌血清診斷藥物為ELISA檢測胃癌血清多肽分子的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種胃癌血清多肽分子及應用，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。該分子稱為SERPINA1-A，SERPINA1-A為絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(SERPINA1)的一個片段，其精確分子量為1545.8道爾頓。SERPINA1-A在胃癌患者血清檢測中呈現特異性的高表達，用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)檢測SERPINA1-A或ELISA方法測檢測SERPINA1的表達水平，可作為胃癌血清的檢測方法。
文檔編號G01N27/64GK102643334SQ201210087910
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月29日 優先權日2012年3月29日
發明者宋土生, 楊娟, 黃辰 申請人:西安交通大學