專利名稱：多重實時熒光pcr同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法
技術領域：
本發明屬于植物病毒檢測技術領域，具體涉及一種多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法。
背景技術：
馬鈴薯是一種重要的世界性糧食作物，馬鈴薯病毒病是馬鈴薯上非常重要的一類病害，分布于世界各馬鈴薯種植區，其中一些馬鈴薯病毒會嚴重的影響馬鈴薯的產量和質量。在我國，主要的馬鈴薯病毒種類有馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)，馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY),馬鈴薯卷葉病毒(Potato virus, PLRV),馬鈴薯 A 病毒(Potatovirus, PVA)及馬鈴薯S病毒(Potato virus, PVS) 對生產影響最大的病毒是PVY和PLRV，其次是PVX和PVA，PVS影響較小。這些病毒嚴重影響馬鈴薯的產量及品質，一般減產10% 30%，重者達80%以上。除馬鈴薯外，茄科的其他作物如番茄、青椒等也會被馬鈴薯病毒所侵染，馬鈴薯病毒檢測及防治已引起極大重視，開發快速、靈敏、規范化的檢測體系是病毒檢測發展的必然方向。目前國內外馬鈴薯分子檢測技術的研究，多涉及以蛋白質為基礎的檢測(或血清學試驗)方法和以核酸為基礎的檢測方法，較傳統檢測方法更為快速、靈敏、準確。因為馬鈴薯往往會被幾種病毒同時侵染，所以多重檢測在馬鈴薯病毒病防控中尤其重要。Singh等利用二重PCR方法同時檢測了馬鈴薯中的PLRV和PVY。袁青等利用三重RT-PCR對感染PVX、PVS、PVA以及復合侵染的馬鈴薯葉片、葉梗、莖干和薯塊進行測試，測試結果表明，該方法可檢測出復合感染以上病毒的樣品。實時熒光定量PCR是近年發展起來的一種實時定量檢測特定核酸技術，與普通PCR相比，具有定量準確、快速、靈敏度高、特異性強等特點，它已被廣泛地應用于生命科學研究的各個領域。從原理上講有兩大類熒光模式一類為熒光雜交探針，如Taqman、分子信標等，基于能量共振轉移的原理(FRET);另一類為DNA結合染料，主要為Sybr Green I。前面一種方法特異性好，除需要合成序列特異引物外，還需要合成高成本的熒光探針，成本較高；后一種方法經濟，只需合成特異性引物，但易受引物二聚體的影響，特異性相對沒有探針法高。多重實時熒光PCR技術因具有高效快捷、能降低實驗成本、加速實驗進程等優點而得到廣泛的認可。由于儀器的限制，利用探針法在一個反應體系里目前最多只能檢測出四種擴增產物。Agindotan等利用Taqman探針同時檢測出PLRV、PVA、PVX和PVY 4種病毒，但由于探針成本較高，探針法并不適合廣泛應用。目前發展起來的多重實時熒光染料PCR技術可以在同一個反應體系中，通過Tm值分析來區分不同的核酸片段。王小武等利用SYBR Premix ExTaq同時檢測出了豬生殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)、豬圓環病毒 2 型(porcine circovirus type 2,PCV-2)以及豬偽狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus, PRV) 3 種病毒，Chassagne 等利用Sybr Green在一個反應體系里可同時檢測出大腸桿菌的stxl, stx2和eae這三種基因。在多重實時熒光染料PCR病毒檢測中，同時檢測多種病毒，需要所設計的引物擴增條件一致，而擴增片段Tm值要能區分大小使其在一個熔解曲線中呈現出不同的峰。由于染料除了和目的片段也可以和引物二聚體結合而影響實驗特異性，給引物設計增加了難度，而常用的Sybr Green I有“染料重分布”的缺陷對PCR擴增有抑制作用且對擴增產物存在偏愛性，在PCR擴增后熔解曲線分析中，要實現多擴增產物的熔解峰的區分往往是十分困難的。正因為上述種種限制，在一次檢測中每增加一種病毒，在引物設計和擴增條件上就增加了一個級別的難度，這也是目前所報道的熒光染料多重PCR檢測病毒最多還只能檢測三種病毒的原因。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，該方法能能快速、可靠、靈敏度高、特異性強和價格便宜的同時檢測馬鈴薯X病 毒PVX、馬鈴薯Y病毒PVY、馬鈴薯卷葉病毒PLRV、馬鈴薯A病毒PVA以及馬鈴薯S病毒PVS這五種馬鈴薯病毒。為了解決上述技術問題，本發明提供一種多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，包括以下步驟I)、分別合成馬鈴薯X病毒一PVX、馬鈴薯Y病毒一PVY、馬鈴薯卷葉病毒一PLRV、馬鈴薯A病毒一PVA和馬鈴薯S病毒一PVS的所對應的特異性引物；2)、抽提馬鈴薯樣品的總RNA，反轉錄合成cDNA ；3)、將步驟I)所述的所有特異性引物置于多重熒光定量PCR反應體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進行PCR擴增；根據熔解曲線來分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV、PVA和PVS中的至少一種。作為本發明的多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法的改進所述PVX擴增弓丨物對為正向CACAGGCTGCTTGGGACTT，反向TGCCGTTGGAATAGGGAC；擴增片段Tm值為83. 9 ；所述PVY擴增弓丨物對為正向CTGAGATGCCAACTGTGATGA，反向GTTGACATTTGGCGAGGTT；擴增片段Tm值為80. 6 ； 所述PLRV擴增弓丨物對為正向CGCCGAAGACGCAGAAGAGGA，反向AGACTCGGCCCGAAGGTGAA；擴增片段Tm值為89. I ；所述PVA擴增弓丨物對為正向CCAATGCTCAAAGGTAAG，反向TCTACTTGCTTTGGTTTGT；
擴增片段Tm值為78. 2 ；所述PVS擴增弓丨物對為正向GAGATAGGTAGGCCCTCACTT，反向CTGTGCCATTTGCTCGGT ；擴增片段Tm值為86. 8。上述片段Tm是擴增后所得的結論性數據，事先是可以通過設計相應的引物來設定。作為本發明的多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法的進一步改進步驟3)多重熒光定量PCR反應體系由以下成分組成10XPCR buffer 5uL,25mM MgCl25 u L, dNTP (IOmM) I. 5 U L, 20 XEvaGreen 2. 5 U L, Taq DNA Polymerase 2. 5ul，2. 5 U L 步驟
2)所述的cDNA、PVX擴增引物對0. L、PVY擴增引物對0. L、PLRV擴增引物對0. 28 u L,PVA擴增引物對0. 25u L和PVS擴增引物對0. 23 y L，用dd H2O定容至50 u L ；多重熒光PCR 反應程序為95°C 5min ；40 個循環95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 31s ;熔解曲線程序為95°C 15s,60°C 20s, 95°C 15s ;從60°C開始收集熒光信號。在本發明中，根據熔解曲線來分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV、PVA和PVS中的至少一種，具體如下根據熔解曲線所顯示的峰，出現Tm值為83. 9的峰，說明有PVX病毒；出現Tm值為80. 6的峰，說明有PVY病毒；出現Tm值為89. I的峰，說明有PLRV病毒；出現Tm值為78. 2的峰，說明有PVA病毒；出現Tm值為86. 8的峰，說明有PVS病毒。本發明的技術方案具體如下第一步、PCR引物設計從NCBI中搜索目前已登記的馬鈴薯病毒PVX、PVY、PLRV, PVA及PVS所有的序列分析結果，應用引物設計軟件分別設計引物。設計引物通過不斷調整，選擇可以有效區分五種病毒TM值的引物，設計引物的時候注意擴增片段長短以及引物自身和引物間二聚體的問題。 表I、本發明中所設計的PCR弓丨物
權利要求
1.多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是包括以下步驟 1)、分別合成馬鈴薯X病毒一PVX、馬鈴薯Y病毒--PVY、馬鈴薯卷葉病毒一PLRV、馬鈴薯A病毒—PVA和馬鈴薯S病毒一PVS的所對應的特異性引物； 2)、抽提馬鈴薯樣品的總RNA，反轉錄合成cDNA； 3)、將步驟I)所述的所有特異性引物置于多重熒光定量PCR反應體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進行PCR擴增；根據熔解曲線來分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV, PVA和PVS中的至少一種。
2.根據權利要求I所述的多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是 所述PVX擴增引物對為 正向CACAGGCTGCTTGGGACTT，反向TGCCGTTGGAATAGGGAC ； 所述PVY擴增引物對為 正向CTGAGATGCCAACTGTGATGA，反向GTTGACATTTGGCGAGGTT ； 所述PLRV擴增引物對為 正向CGCCGAAGACGCAGAAGAGGA，反向AGACTCGGCCCGAAGGTGAA ； 所述PVA擴增引物對為 正向CCAATGCTCAAAGGTAAG，反向TCTACTTGCTTTGGTTTGT ； 所述PVS擴增引物對為 正向GAGATAGGTAGGCCCTCACTT， 反向CTGTGCCATTTGCTCGGT。
3.根據權利要求2所述的多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是所述步驟3)為根據熔解曲線所顯示的峰，出現Tm值為83. 9的峰，說明有PVX病毒；出現Tm值為80. 6的峰，說明有PVY病毒；出現Tm值為89. I的峰，說明有PLRV病毒；出現Tm值為78. 2的峰，說明有PVA病毒；出現Tm值為86. 8的峰，說明有PVS病毒。
4.根據權利要求1、2或3所述的多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，其特征是所述步驟3)多重熒光定量PCR反應體系由以下成分組成10XPCR buffer5 u L, 25mM MgCl2 5 u L, dNTP (IOmM) I. 5 u L, 20 XEvaGreen 2. 5 u L, Taq DNA Polymerase2.5ul，2. L步驟2)所述的cDNA、PVX擴增引物對0. L、PVY擴增引物對0. L、PLRV擴增引物對0. 28 u L、PVA擴增引物對0. 25 ii L和PVS擴增引物對0. 23 y L，用dd H2O定容M 50 u L ； 所述多重熒光PCR反應程序為95°C 5min ;40個循環95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 31s ;熔解曲線程序為95°C 15s,60°C 20s, 95°C 15s ;從60°C開始收集熒光信號。
全文摘要
本發明公開了一種多重實時熒光PCR同時檢測五種馬鈴薯病毒的方法，包括以下步驟1)、分別合成馬鈴薯X病毒--PVX、馬鈴薯Y病毒--PVY、馬鈴薯卷葉病毒--PLRV、馬鈴薯A病毒--PVA和馬鈴薯S病毒--PVS的所對應的特異性引物；2)、抽提馬鈴薯樣品的總RNA，反轉錄合成cDNA；3)、將步驟1)所述的所有特異性引物置于多重熒光定量PCR反應體系中，以步驟2)所述的cDNA為模板，進行PCR擴增；根據熔解曲線來分析馬鈴薯樣品是否攜帶PVX、PVY、PLRV、PVA和PVS中的至少一種。
文檔編號G01N21/64GK102618667SQ20121008083
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者丁先鋒, 姜永厚, 程菊會, 董沁芳, 郭江峰 申請人:浙江理工大學