一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法

專利名稱：一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法
技術領域：
本發明屬于近紅外在線檢測領域，具體涉及一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法。
背景技術：
丹紅注射液具有活血化瘀，通脈舒絡的功能，用于淤血閉阻所致的胸痹及中風、冠心病和心絞痛等癥，是由丹參和紅花組成的復方制劑。丹參具有活血化瘀、理氣止痛的功效，丹參中水溶性酚酸類成分，如丹參素、原兒茶醛、和丹酚酸B等是丹參的主要活性成分。而紅花具有活血通絡的功效，有效成分主要集中在水溶性紅花黃色素，如羥基紅花黃色素A等。醇沉工藝是丹紅注射液生產過程的重要生產環節，直接關系到丹紅注射液成品的功效和質量穩定性。目前，醇沉工藝的質量控制主要依靠經驗和傳統質量分析方法(HPLC等)，耗時費力，缺乏有效的指標性成分含量的實時監測手段，易造成不同批次醇沉液質量的不穩定，導致藥品批次間的質量差異，以及原藥材、能源、時間等的浪費。故研究發展丹紅注射液醇沉過程中關鍵質控指標的在線檢測方法，有助于解決丹紅注射液醇沉過程中關鍵控制指標的質量控制問題，對于中藥工業技術進步和產品質量升級具有重大現實意義。近紅外(NIR)光譜技術作為一種快速無損的綠色分析技術，具有快速分析、樣品處理簡單、無需消耗試劑等特點。近年來，近紅外光譜技術已經越來越多的被應用于中藥研究，包括藥材產地鑒別、有效組分含量測定和制藥過程的在線檢測和監控。從近年來研究進展情況看來，近紅外光譜分析技術是最有希望在中藥生產過程實現在線檢測及質量控制的過程分析技術之一。在中藥質量控制及生產應用領域，近紅外光譜作為一種在線檢測技術應用于指標成分的測定已有相關專利文獻，如專利(CN02137234. 9，CN200710022408. 9，CN200810050095. 2和CN200410090617. 3)等。但是這些專利均為離線采集近紅外光譜，也并沒有將所建模型真正應用于在線分析。目前比較常用的近紅外定量分析建模方法有偏最小二乘回歸(PLSR)、和支持向量機(SVM)等。最小二乘支持向量機(LS-SVM)是SVM的一種改進，兩者的算法原理基本相同。影響LS-SVM模型性能的因素通常有兩個，即核函數的參數取值和懲罰因子C的取值。本發明中使用的核函數為徑向基(RBF)函數，因此需要確定的核函數參數為核寬度O。此外，利用粒子群優化(PSO)算法尋找最優的懲罰因子C和核函數寬度O，并選擇均方誤差(MSE)作為目標函數。

發明內容
本發明的目的在于提供一種丹紅注射液醇沉過程的在線檢測方法。該方法的檢測目標為實現丹紅注射液醇沉過程中各質控指標的在線定量分析，為丹紅注射液醇沉過程質量控制提供方法。本發明是通過以下技術方案實現的
(I)安裝近紅外在線檢測裝置近紅外在線檢測裝置由以下部分組成所述的近紅外在線檢測系統包括醇沉罐I、攪拌器2、過濾器3、第一蠕動泵4、第二蠕動泵4’、近紅外光譜儀5、光纖探頭6、流通池7、循環管路8和醇沉液取樣口 9，過濾器3置于醇沉罐I內，并通過循環管路8連接第一蠕動泵4、流通池7和醇沉液取樣口 9，第二蠕動泵4’通過管路連接醇沉罐I和乙醇溶液，近紅外光譜儀5通過光纖探頭6在線采集流通池7中的醇沉液近紅外光譜。使用時，打開第二蠕動泵，乙醇溶液被泵入醇沉罐，醇沉過程開始，再打開第一蠕 動泵，醇沉液經由過濾器濾除固體顆粒后進入循環管路，到達流通池后，連接在流通池左右兩邊的光纖探頭適時在線采集流通池中醇沉液的近紅外光譜，最后醇沉液分為兩路，一路回醇沉罐,另一路通過取樣口，用于收集醇沉液樣品。流通池及循環管路中醇沉液流速控制在120 mL/min。過濾器用于濾除醇沉液中的大部分固體雜質顆粒，過濾精度為60微米。(2)在線采集丹紅注射液醇沉液的近紅外透射光譜及醇沉液樣本
將丹參、紅花藥材水提得到的提取液濃縮至密度為I. 2fl. 23 g/ml，取該濃縮液2 L置于醇沉罐中，保持機械攪拌轉速為300轉/分鐘，流通池7及循環管路8中醇沉液流速控制在120 mL/min,以40 mL/min的流速加入95% (v/v)乙醇2 L,之后再以80 mL/min的流速加入95% (v/v)乙醇5 L，直到使藥液終點乙醇濃度為80% (v/v)。采用透射法采集近紅外光譜，光譜范圍為4500 cm_卜12000 cnT1，掃描次數為32次，分辨率為8 cnT1，以空氣為參比。每隔I分鐘在線采集通過流通池7的醇沉液近紅外光譜；每隔5分鐘從取樣口9采集醇沉液樣本。采集醇沉液樣本的同時采集近紅外光譜。收集不同批次醇沉過程中的醇沉液樣品，隨機選擇其中2批數據作為驗證集，其余樣品作為校正集參與建模。(3)采用傳統分析方法(高效液相色譜法和烘干稱重法)測得醇沉液樣本中各質控指標信息
所述的醇沉液樣本的各質控指標包括丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B濃度和可溶性固形物含量。采用高效液相色譜法(HPLC)測定醇沉液樣本中丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B濃度；使用烘干稱重法測定可溶性固形物含量。a.HPLC 色譜條件Agilent eclipse C18 分析柱(250X 4. 6 mm, 5 u m);流速I mL/min ;柱溫35 V ;進樣量5 y L ;流動相A為甲醇，B為0. 5%甲酸水溶液，梯度洗脫程序為0 20 min, A 9% — 39% ;20 36 min, A 39% — 47% ;36 39min，A :47%—90% ;39 45 min，A :90%。0 13 min，檢測波長為 280 nm，參比波長為 360 nm ；13 21 min，檢測波長為403 nm，參比波長為500 nm ;21 45 min，檢測波長為280 nm，參比波長為360 nm。醇沉液樣本于1500 r/min高速離心機中離心10分鐘，濾過(0. 45 Mm微孔濾膜)，
取續濾液用于液相分析。b.標準曲線繪制分別精密稱取丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B對照品，使用體積比為50:50的甲醇-0. 5%甲酸流動相稀釋，制成單一成分對照品儲備液，濃度分別為84. 80，14. 08，14. 44，162. 60 u g/mL。精密吸取以上單一成分對照品儲備液1，
2.5，5，10，15，20，25，30，35，40 u L,分別注入液相色譜儀，在上述色譜條件下進樣分析；以色譜峰面積Y對濃度X進行線性回歸，丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的線性范圍分別為 16. 96 678. 40，2. 82 112. 64，2. 89 115. 52,32. 52 1300. 80 u g/mL，相關系數R值均大于0. 9999。c.烘干稱重法醇沉液樣本于1500 r/min高速離心機中離心10分鐘，取上清液用于可溶性固形物含量分析。烘干至恒重的扁形瓶(兩次烘干后重量差小于5 mg)稱重Xtl,取樣品約10 mL至扁形瓶，稱重X1，水浴蒸干，105°C烘5 h，取出置干燥器內冷卻30 min，迅速稱重X2。可溶性固形物含量按下式計算 可溶性固形物=(X2- X。)/( X1- X0) X 100%。(4)剔除異常光譜醇沉過程中產生的氣泡以及流通池中的固體顆粒都會影響近紅外光譜的采集，導致異常光譜的產生。本發明計算光譜的馬氏距離，并使用肖維勒(Chauvenet)準則剔除異常光譜。若測量值Xi (I ^ i ^ n)的殘差滿足I Vi I > Wn o則Xi被視為異常數據，予以剔除。其中，Vi為殘差，O為標準差，Wn可查表得到。(5)選擇近紅外光譜建模波段和預處理方法；采用一階導數法(Savitzky-Golay平滑)和標準正交變換算法預處理近紅外光譜數據，分別用于消除基線漂移、噪音及固體顆粒等對光譜的影響。在選擇建模波段時需排除以下波段450(T5450 cnT1波段，即“水峰”；7500^12000 cnT1波段，存在較大的噪聲，且沒有顯著的特征吸收。然后，通過光譜和質控指標的相關系數確定建模波段。因此，對于可溶性固形物含量模型使用545(T7500 cnT1波段，對于丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B模型則使用5450飛100 cnT1波段。(6)使用多元校正算法建立各質控指標模型，并采用各模型評價指標考察模型性能；多元校正方法為偏最小二乘(PLSR)法或最小二乘支持向量機(LS-SVM)。其中LS-SVM算法選擇徑向基(RBF)作為核函數。本發明利用粒子群優化(PSO)算法對徑向基核函數的懲罰因子C和核函數寬度O進行尋優，并選擇均方誤差(MSE)作為目標函數。模型評價指標包括模型評價指標包括相關系數(R)、校正集和驗證集預測誤差均方根(RMSEC、RMSEP)、校正集和驗證集相對偏差(RSEC和RSEP)。當R值接近于1，RMSEC和RMSEP值相互接近且RMSEP小于2倍的RMSEC，RSEC和RSEP相互接近且小于20%時說明所見模型具有較好的穩定性和預測精度，可以用于丹紅注射液醇沉過程的在線檢測。(7)將已建模型用于在線分析丹紅注射液醇沉過程中各質控指標的變化趨勢。在線采集丹紅注射液醇沉液的近紅外光譜圖，將光譜數據輸入到校正模型中，經過計算即可實時得知醇沉液中各質控指標的信息。本發明將近紅外在線分析技術引入到丹紅注射液的醇沉過程，實現對各質控指標(丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B和可溶性固形物含量)的實時監測，有利于提高丹紅注射液醇沉過程的質量控制水平，充分保證產品質量穩定、可靠。


圖I是醇沉過程近紅外在線檢測系統簡圖。圖2是醇沉過程中可溶性固形物含量的變化趨勢。圖3是醇沉過程中丹參素濃度的變化趨勢。圖4是醇沉過程中原兒茶醛濃度的變化趨勢。圖5是醇沉過程中羥基紅花黃色素A濃度的變化趨勢。圖6是醇沉過程中丹酚酸B濃度的變化趨勢。圖7是近紅外光譜和可溶性固形物含量的相關系數圖。
圖8是近紅外光譜和丹參素濃度的相關系數圖。圖9是PLSR模型在線分析醇沉過程中可溶性固形物含量預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖10是PLSR模型在線分析醇沉過程中丹參素濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖11是PLSR模型在線分析醇沉過程中原兒茶醛濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖12是PLSR模型在線分析醇沉過程中羥基紅花黃色素A濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖13是PLSR模型在線分析醇沉過程中丹酚酸B濃度預測值與實際測定值的趨勢 對照圖。圖14是LS-SVM模型在線分析醇沉過程中丹參素濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖15是LS-SVM模型在線分析醇沉過程中原兒茶醛濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖16是LS-SVM模型在線分析醇沉過程中羥基紅花黃色素A濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖17是LS-SVM模型在線分析醇沉過程中丹參素濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。圖18是LS-SVM模型在線分析醇沉過程中丹酚酸B濃度預測值與實際測定值的趨勢對照圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例做進一步的說明。實施例I :
I.安裝近紅外在線檢測裝置
參見圖1，近紅外在線檢測裝置由以下部分組成所述的近紅外在線檢測系統包括醇沉罐I、攪拌器2、過濾器3、第一蠕動泵4、第二蠕動泵4’、近紅外光譜儀5、光纖探頭6、流通池7、循環管路8和醇沉液取樣口 9。過濾器3置于醇沉罐I內，并通過循環管路8連接第一蠕動泵4、流通池7和醇沉液取樣口 9，第二蠕動泵4’通過管路連接醇沉罐I和乙醇溶液，近紅外光譜儀5通過光纖探頭6在線采集流通池7中的醇沉液近紅外光譜。流通池7及循環管路8中醇沉液流速控制在120 mL/min。過濾器3用于濾除醇沉液中的大部分固體雜質顆粒，過濾精度為60微米。使用時，打開第二蠕動泵4’，乙醇溶液被泵入醇沉罐1，醇沉過程開始。打開第一蠕動泵4，醇沉液經由過濾器3濾除固體顆粒后進入循環管路8，到達流通池7后，連接在流通池7左右兩邊的光纖探頭6適時在線采集流通池7中醇沉液的近紅外光譜，最后醇沉液分為兩路，一路回醇沉罐，另一路通過取樣口 9，作為收集的醇沉液樣品。2.近紅外光譜和醇沉液樣本的在線采集
將丹參、紅花藥材水提得到的提取液濃縮至密度為I. 2fl. 23 g/ml，取該濃縮液2 L置于醇沉罐I中，保持機械攪拌轉速為300轉/分鐘，流通池7及循環管路8中醇沉液流速控制在120 mL/min,以40 mL/min的流速加入95% (v/v)乙醇2 L,之后再以80 mL/min的流速加入95% (v/v)乙醇5 L，直到使藥液終點乙醇濃度為80% (v/v)。開始加醇時作為醇沉過程計時零點。醇沉過程中每隔I分鐘在線采集醇沉液近紅外光譜圖，每隔5分鐘從取樣口采集醇沉液樣本。近紅外在線檢測系統參見圖I。所取樣本分別用于丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B和可溶性固形物含量的測定。重復10批丹紅注射液的醇沉實驗，每批次的實驗都以相同方式進行取樣和采集光譜。共得到270個醇沉液樣本，計算所有近紅外光譜的馬氏距離，并使用肖維勒(Chauvenet)準則剔除異常光譜。若測量值Xi(ISis^n)的殘差滿足I Vi I > Wn o則Xi被視為異常數據,予以剔除。其中，Vi為殘差，O為標準差，Wn可查表得到。根據計算結果，有11個樣本的光譜異常，將這些樣本剔除后剩余數據用于建立定量模型。3.各指標成分濃度和可溶性固形物含量的測定
采用高效液相色譜法(HPLC)測定醇沉液樣本中丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B濃度。使用烘干稱重法測定可溶性固形物含量。醇沉過程中各質控指標變化趨勢參見圖疒6。4.選擇近紅外光譜建模波段和預處理方法
采用一階導數法(Savitzky-Golay平滑)和標準正交變換算法預處理近紅外光譜數據，分別用于消除基線漂移、噪音及固體顆粒等對光譜的影響。在選擇建模波段時需排除以下波段4500 5445 cm—1波段，即“水峰” ；7500 12000cnT1波段，存在較大的噪聲，且沒有顯著的特征吸收。為了保證光譜選擇區域的準確性，本發明對光譜和質控指標的相關系數進行了考察。以可溶性固形物含量和丹參素為例，其相關系數分別參見圖7和圖8，從圖中可以看到相關系數大于0.8的光譜主要集中在所選擇的光譜區域內。此外，其他質控指標與丹參素有相類似結果。因此，對于可溶性固形物含量模型使用5445 7500 cnT1波段，對于丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B模型則使用5445 6100 cnT1波段。5.采用偏最小二乘回歸(PLSR)法建立各質控指標模型
在適當波段范圍內，采用一階導數法(Savitzky-Golay平滑)和標準正交變換算法預處理方法，剔除異常光譜后將剩余數據用于建立PLSR模型。可溶性固形物含量、丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B模型的校正和驗證結果見表I。可以看出，PLSR模型的校正集和驗證集相關系數均大于0. 93，RMSEC和RMSEP值較小而且互相接近，RSEP值都能控制在20%以內。各質控指標PLSR模型的校正和驗證結果相近，泛化能力強，具有較好的模型穩定性和預測能力。
權利要求
1.一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法，其特征在于，通過以下步驟實現 (1)設計近紅外在線檢測裝置該裝置包括醇沉罐(I)、攪拌器(2)、過濾器(3)、第一蠕動泵(4)、第二蠕動泵(4’)、近紅外光譜儀(5)、光纖探頭(6)、流通池(7)、循環管路(8)和醇沉液取樣口(9)，過濾器(3)置于醇沉罐(I)內，并通過循環管路(8)連接第一蠕動泵4、流通池7和醇沉液取樣口 9，第二蠕動泵4’通過管路連接醇沉罐I和乙醇溶液，近紅外光譜儀5通過光纖探頭6在線采集流通池7中的醇沉液近紅外光譜； (2)在線采集近紅外透射光譜及醇沉液樣本 將丹參、紅花藥材水提得到的提取液濃縮至密度為I. 2fl. 23 g/ml，取該濃縮液2 L置于醇沉罐中，保持機械攪拌轉速為300轉/分鐘，流通池(7 )及循環管路(8 )中醇沉液流速控制在120 mL/min,以40 mL/min的流速加入體積比為95%的乙醇2L,之后再以80 mL/min的流速加入體積比95%的乙醇5 L，直到使藥液終點乙醇濃度為80% ； 采用透射法采集近紅外光譜，光譜范圍為4500 cm_卜12000 cnT1，掃描次數為32次，分辨率為8 cm-1,以空氣為參比，每隔I分鐘在線采集通過流通池(7)的醇沉液近紅外光譜；每隔5分鐘從取樣口(9)采集醇沉液樣本，收集不同批次醇沉過程中的醇沉液樣品，隨機選擇其中2批數據作為驗證集，其余樣品作為校正集參與建模； (3)采用高效液相色譜法和烘干稱重法測得醇沉液樣本中各質控指標信息 所述的醇沉液樣本的各質控指標包括丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B濃度和可溶性固形物含量；采用高效液相色譜法測定醇沉液樣本中丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B濃度；使用烘干稱重法測定可溶性固形物含量； a.高效液相色譜條件Agilent eclipse C18分析柱，250> 4. 6 mm，5 y m ;流速I mL/min ;柱溫35 °C;進樣量5 U L ;流動相A為甲醇，B為0. 5%甲酸水溶液，梯度洗脫程序為:0 20 min, A 9% — 39% ;20 36 min, A 39% — 47% ;36 39 min,A :47% —90% ;39 45 min，A :90% ;0 13 min，檢測波長為 280 nm，參比波長為 360 nm ;13 21min，檢測波長為403 nm，參比波長為500 nm ;21 45 min，檢測波長為280 nm，參比波長為360 nm ； b.標準曲線繪制分別精密稱取丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B對照品，使用體積比為50:50的甲醇-0. 5%甲酸流動相稀釋，制成單一成分對照品儲備液，濃度分別為84. 80，14. 08，14. 44，162. 60 u g/mL ;吸取以上單一成分對照品儲備液1,2. 5,5,10，15，20，25，30，35，40 u L，分別注入液相色譜儀，在上述色譜條件下進樣分析；以色譜峰面積Y對濃度X進行線性回歸，丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B的線性范圍分別為 16. 96 678. 40,2. 82 112. 64,2. 89 115. 52,32. 52 1300. 80 u g/mL,相關系數 R值均大于0. 9999 ； c.烘干稱重法醇沉液樣本于1500r/min高速離心機中離心10分鐘，取上清液用于可溶性固形物含量分析，烘干至恒重的扁形瓶稱重Xtl，取樣品10 mL至扁形瓶，稱重X1，水浴蒸干，105°C烘5小時，取出置干燥器內冷卻30 min，迅速稱重X2，可溶性固形物含量按下式計算可溶性固形物=(X2- X0)/( X1- X0) X 100% ； (4)剔除異常光譜 計算光譜的馬氏距離，并使用肖維勒準則剔除異常光譜，若測量值Xi(l ^n)的殘差滿足I Vi I > Wn O則Xi被視為異常數據,予以剔除,其中，Vi為殘差，o為標準差,Wn可查表得到； (5)選擇近紅外光譜建模波段和預處理方法； 采用一階導數法和標準正交變換算法預處理近紅外光譜數據，分別用于消除基線漂移、噪音及固體顆粒等對光譜的影響，對于可溶性固形物含量模型使用545(T7500 cnT1波段，對于丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A和丹酚酸B模型則使用5450飛100 cnT1波段； (6)使用多元校正算法建立各質控指標模型，并采用各模型評價指標考察模型性能； 多元校正方法為偏最小二乘法或最小二乘支持向量機，其中LS-SVM算法選擇徑向基作為核函數，利用粒子群優化算法對徑向基核函數的懲罰因子C和核函數寬度0進行尋優，并選擇均方誤差作為目標函數；模型評價指標包括模型評價指標包括相關系數(R)、校正集和驗證集預測誤差均方根(RMSEC、RMSEP)、校正集和驗證集相對偏差(RSEC和RSEP)，當R值接近于1，RMSEC和RMSEP值相互接近且RMSEP小于2倍的RMSEC，RSEC和RSEP相互接近且小于20%時說明所見模型具有較好的穩定性和預測精度，可以用于丹紅注射液醇沉過程的在線檢測； (7)將已建模型用于在線分析丹紅注射液醇沉過程中各質控指標的變化趨勢 在線采集丹紅注射液醇沉液的近紅外光譜圖，將光譜數據輸入到校正模型中，經過計算即可實時得知醇沉液中各質控指標的信息。
2.根據權利要求I所述的一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法，其特征在于，流通池(7)及循環管路(8)中醇沉液流速控制在120 mL/min，過濾器(3)的過濾精度為60微米。
3.根據權利要求I所述的一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法，其特征在于，采集醇沉液樣本的同時采集近紅外光譜。
4.根據權利要求I所述的一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法，其特征在于，步驟(3)a中醇沉液樣本于1500 r/min高速離心機中離心10分鐘,0. 45 Mm微孔濾膜濾過,取續濾液用于液相分析。
全文摘要
本發明提供一種丹紅注射液醇沉過程在線檢測方法，包括①設計近紅外在線檢測系統；②在線采集丹紅注射液醇沉液的近紅外透射光譜及醇沉液樣本；③采用高效液相色譜法和烘干稱重法測得醇沉液樣本中各質控指標信息；④剔除異常光譜；⑤選擇近紅外光譜建模波段和預處理方法；⑥使用多元校正算法建立各質控指標模型，并采用各模型評價指標考察模型性能；⑦將已建模型用于在線分析醇沉過程中各質控指標的變化趨勢。本發明將近紅外在線檢測技術應用于丹紅注射液醇沉過程中各化學指標成分及可溶性固形物含量的測定，為丹紅注射液醇沉過程的在線控制提供依據及有效的指導。
文檔編號G01N21/35GK102621092SQ20121007047
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月17日 優先權日2012年3月17日
發明者劉象銀, 劉雪松, 吳增增, 吳永江, 王振華, 王臣臣, 蘇曉濤, 金葉, 陸世海 申請人:浙江大學, 菏澤步長制藥有限公司