專利名稱：一種sds-page考馬斯亮藍r250快速染色液及染色方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種考馬斯亮藍快速染色液及染色方法和應用，具體涉及一種 SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)考馬斯亮藍R250快速染色液及染色方法和應用。
背景技術：
蛋白質組學研究能夠通過構建細胞中蛋白質表達的時間及空間差異圖譜揭示生命規律。蛋白質的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離技術是蛋白質組學研究的關鍵技術，而對凝膠的染色是得到可分析圖譜的核心技術。在蛋白分析和檢測上，考馬斯亮藍染色、硝酸銀染色和熒光染料染色是廣泛使用在蛋白分析和檢測上的三種染色方法。硝酸銀染色方法是公認的靈敏度較高的凝膠染色方法，靈敏度可達納克級水平，但因其步驟繁瑣延長實驗操作時間增加樣品污染的可能性，較高的凝膠背景導致最終結果差異較大重復性低，同時染色試劑中的戊二醛和甲醛對蛋白質的修飾作用導致染色后的凝膠對質譜的兼容性低。近年來，染色技術的發展熒光染料的研制成功使得熒光染色方法以其高靈敏度、可重復性及很好的質譜兼容性而備受矚目。但由于熒光染料的昂貴價格，所需高端硬件及軟件設備，另眾多研究人員望而卻步。考馬斯亮藍(CBB)染色方法以較高重復性、較低凝膠背景、較高靈敏度及較高的質譜兼容性被廣泛應用在蛋白質組學研究中，廣泛采用的染料有考馬斯亮藍 G250 (CBBG250)和考馬斯亮藍R250 (CBB R250)，能夠檢測到微克級水平的蛋白質。近年來本申請發明人所在實驗室改進了傳統的CBB染色方法，提高染色靈敏度，能夠檢測到納克級的牛血清蛋白質條帶，同時具有較高分辨率及較低背景。但是，染色前固定和敏化步驟繁瑣，延長了操作時間，增加了樣品被污染概率。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，該染色液不需要染色前的固定和敏化步驟，能夠縮短蛋白質染色時間，極大的減少了蛋白質樣品被污染的可能性。本發明的第二個目的在于提供一種利用上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，該方法能夠在極短的時間內完成染色步驟，并在短時間內得到低背景、 高靈敏度、高分辨率的凝膠圖譜，且質譜兼容性高。本發明的最后一個目的在于提供上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液在蛋白質雙向凝膠電泳以及蛋白質western blot定性和/或定量過程中的應用。本發明的第一個目的是通過如下技術方案來實現的一種SDS-PAGE考馬斯亮藍 R250快速染色液,含以下含量的組分體積百分含量為20 40%的乙醇,體積百分含量為 5 10%的甲醇，質量濃度為O. 5 I. 25g/L的CBB R250，體積百分含量為2. 5 5%的磷酸，質量濃度為100 200g/L的硫酸銨。上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，優選含有含以下含量的組分體積百分含量為25 35%的乙醇，體積百分含量為6 9%的甲醇，質量濃度為O. 8 I. Og/L的 CBB R250，體積百分含量為3. 2 4. 2%的磷酸，質量濃度為125 175g/L的硫酸銨。上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，最佳含有以下含量的組分體積百分含量為30%的乙醇，體積百分含量為8%的甲醇，質量濃度為O. 85g/L的CBB R250，體積百分含量為3. 5%的磷酸，質量濃度為150g/L的硫酸銨。其中上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液可以通過如下方法配制獲得首先按上述計量比，將CBB R250粉末溶于乙醇、甲醇以及適量水的混合溶劑中，混勻后密封， 于30 40°C環境中50 150轉/分鐘的條件下過夜，使各原料充分溶解，得染色液I ;接著按計量比取硫酸銨溶解于適量純水中，并加入磷酸，混勻后，得染色液2，將等體積的染色液I與染色液2混勻后，即制備得本發明所述的SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液。本發明的第二個目的是通過如下技術方案來實現的利用上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，含有以下步驟將SDS-PAGE凝膠置于水浴加熱的 SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液中進行染色，染色結束后取出SDS-PAGE凝膠，并將其置于脫色液中脫色。具體步驟包括將染色液在水浴中加熱至染液溫度均勻，將凝膠置于熱的染液中染色一段時間，染色結束后取出凝膠，置于脫色液中搖床上輕搖一段時間后，取出凝膠在超純水中浸泡至背景干凈即可。本發明將SDS-PAGE凝膠置于水浴加熱的SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液中進行染色的時間為4 8min,最佳為4min。本發明水浴加熱時的溫度為80°C 100°C，水浴加熱的時間為10 20min，水浴加熱主要是將染色液加熱均勻，便于對SDS-PAGE凝膠染色。本發明在脫色液中脫色的時間為20 30min，并將脫色后的SDS-PAGE凝膠置于超純水中浸泡至背景干凈。本發明所述脫色液中含有體積百分含量為20 40%的乙醇和體積百分含量為 I 10%的乙酸。本發明所述的SDS-PAGE膠優選為單向膠，其含有質量百分含量為10 15%的聚丙烯酰胺分離膠和質量百分含量為I 5%的聚丙烯酰胺濃縮膠；或所述的SDS-PAGE膠優選為雙向膠，其含有質量百分含量為10 15%的聚丙烯酰胺分離膠。本發明的最后一個目的是通過如下技術方案來實現的上述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液在蛋白質雙向凝膠電泳以及蛋白質western blot定性和/或定量過程中的應用。與現有技術相比，本發明具有如下優點①本發明快速染色液在配制過程中通過將CBB R250粉末溶于乙醇、甲醇以及適量水的混合溶劑中，并在30 40°C環境中50 150轉/分鐘的條件下過夜使得染料CBBR250 能徹底溶解，保證凝膠染色后背景均勻，便于脫色；②本發明快速染色液中采用染料CBB R250代替了染料CBB G250，能夠縮短蛋白質染色時間；
③使用本發明染色方法可以通過加熱過程縮短染色過程時間，能夠保證最短染色 4分鐘即可觀察到蛋白質條帶；④使用本發明染色方法，能夠檢測到清晰的蛋白質條帶；⑤使用本發明染色方法有很好的質譜兼容性；⑥本染色方法能廣泛的用于植物組織中蛋白質電泳的染色，能夠應用于蛋白質組學及蛋白質western blot研究中。
圖Ia是實施例I中木薯葉片蛋白質不同染色(CBB R250)時間蛋白質單向 SDS-PAGE 圖譜；圖Ib實施例2中巴西橡膠樹C乳清蛋白質不同染色(CBB R250)時間蛋白質單向 SDS-PAGE 圖譜；圖2a是實施例I中木薯葉片蛋白質CBB R250與CBB G250最佳染色時間(4分鐘)單向SDS-PAGE圖譜對比；圖2b是實施例2中巴西橡膠樹C乳清蛋白質CBB R250與CBB G250最佳染色時間(4分鐘)單向SDS-PAGE圖譜對比；圖3是實施例3中木薯葉片蛋白質、巴西橡膠樹C乳清蛋白質及BSA質譜鑒定條帶及編號，其中a是水浴加熱后CBB R250染色液的快速染色得到凝膠圖譜，b是CBBR250常溫染色得到凝膠圖譜，泳道1、4是木薯葉片蛋白質、泳道2、5是巴西橡膠樹C乳清蛋白質、 泳道3、6是牛血清蛋白質。BI、B2、B3、B4、B5、B6是進行質譜鑒定的蛋白質條帶，其中BI、 B4為木薯葉片蛋白質(BI為快速染色樣品，B4為常規染色樣品)，B2、B5為巴西橡膠樹C乳清蛋白質(B2為快速染色樣品，B5為常規染色樣品)，B3、B6為牛血清蛋白質(B3為快速染色樣品，B6為常規染色樣品)。圖4是實施例4中不同牛血清蛋白質(BSA)含量檢測CBB R250及CBB G250的染色靈敏度圖，其中a為CBB R250快速染色結果，b為CBB G250快速染色結果；
具體實施例方式如無特殊指明，以下所采用的試劑或方法均為常規試劑或常規方法，其中w/v指重量體積百分含量，v/v指體積百分含量。實施例I(I)、本實施例所采用的快速染色液含以下含量的組分體積百分含量為30%的乙醇，體積百分含量為10%的甲醇， 質量濃度為I. 25g/L的CBB R250，體積百分含量為5%的磷酸，質量濃度為100g/L的硫酸銨。具體采用以下方式配制而成染色液11 :量筒量取300mL乙醇，IOOmL甲醇，電子天平稱取I. 25g CBB R250粉末，純水定溶至500mL，混勻后密封，于37°C環境中100轉/分鐘的條件下過夜，使染料充分溶解。染色液21電子天平稱取IOOg硫酸銨，加300mL純水充分溶解，量筒量取59mL85%的磷酸，純水定容至500mL。充分混合染色液11和染色液21，命名為染色液R備用。作為對比，配制含有CBB G250的快速染色液，染色液10 :量筒量取300mL乙醇， IOOmL甲醇，電子天平稱取I. 25g CBB G250粉末，純水定容至500mL，混勻后密封，于37°C 環境中100轉/分鐘的條件下過夜，使染料充分溶解。染色液20 電子天平稱取IOOg硫酸銨，加300mL純水充分溶解，量筒量取59ml 85%的磷酸，定容至500ml。充分混合染色液10 和染色液20，命名為染色液G備用。(2)、木薯葉片蛋白質的提取使用BPP法提取木薯葉片蛋白質(具體提取方法可以參閱文獻Xuchu Wang*， Minjing Shi,Xiuli Lu et al. (2010)A method for protein extraction from different subcellular fractions of laticifer latex in Hevea brasiliensis compatible with 2-DE and MS. Proteome Science,8,35),獲得木薯葉片蛋白質的粗提取物,溶于蛋白質裂解液中，蛋白質裂解液含[7M尿素，2M硫脲，質量百分含量2% CHAPS (乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸鹽)，13mM DTT(二硫蘇糖醇)，下同]在室溫融解蛋白2小時以上。使用Tris平衡酚進行蛋白抽提，使用過飽和的硫酸銨沉淀蛋白質，裂解液裂解蛋白質沉淀得到蛋白液，使用 Bradford法進行蛋白質定量,配制含有30微克蛋白質的單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣體系。(3)、單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配制使用質量百分含量為12. 5%的SDS-PAGE配制兩塊厚度I. 5毫米的分離凝膠，膠凝結好后，配制質量百分含量為4%的SDS-PAGE濃縮膠，使用15齒梳制作15孔濃縮膠，最大上樣體積為100微升。(4)、單向 SDS-PAGE 電泳將含有30微克蛋白質的蛋白液加入到凝膠上樣孔中，使用Hoefer SE 600chroma 單向凝膠電泳儀器，設置恒功率參數，進行單向SDS-PAGE電泳。(5)、凝膠染色將染色液R和染色液G分別在100°C的水浴中加熱至少10分鐘，注意不要密封染色液瓶口，以防止染色液爆瓶發生危險。將電泳結束后的凝膠剝離，做好切角標記，用超純水清洗凝膠表面，將兩塊凝膠平均分成若干等份，分別使用熱的染色液R和染色液G染色不同時間，即將凝膠置于在水浴中加熱的染色液中1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、8分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、 45分鐘、60分鐘，使用常溫的染色液R和染色液G分別染色過夜,作為對照。(6)、凝膠的脫色將染色結束的凝膠放入超純水清洗掉凝膠表面的染料，放入脫色液中緩慢搖床搖動脫色20 30分鐘，其中脫色液含有體積百分含量為40%的乙醇和體積百分含量為1% 的乙酸，取出凝膠放入超純水中浸泡至凝膠背景干凈為止。使用GE掃描儀掃描凝膠，進行圖像分析。(7)、結果通過圖la、圖2a可見，CBB R250快速染色方法對木薯葉片蛋白質單向SDS-PAGE 凝膠染色具有很好的效果，在加熱染色時間最短為4分鐘時即可得到清晰的蛋白質條帶，同時CBB R250染色效果要優于CBB G250。實施例2(I)、本實施例所采用的快速染色液含以下含量的組分體積百分含量為30%的乙醇，體積百分含量為10%的甲醇， 質量濃度為I. 25g/L的CBB R250，體積百分含量為5%的磷酸，質量濃度為100g/L的硫酸銨。其配制過程同實施例I。(2)、巴西橡膠樹C乳清蛋白質的提取使用BPP法提取巴西橡膠樹C乳清蛋白質(提取方法同上)，采集的新鮮膠乳經過超速離心后分離出C乳清組分，溶于等體積的蛋白質裂解液BPP中，使用Tris平衡酚進行蛋白抽提，使用過飽和的硫酸銨沉淀蛋白質，裂解液裂解蛋白質沉淀得到蛋白液。使用 Bradford法進行蛋白質定量,配制含有30微克蛋白質的單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣體系。(3)、單向SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配制使用質量百分含量為12. 5%的SDS-PAGE配制兩塊厚度I. 5毫米的分離凝膠，膠凝結好后，配制質量百分含量為4%的SDS-PAGE濃縮膠，使用15齒梳制作15孔濃縮膠，最大上樣體積為100微升。(4)、單向 SDS-PAGE 電泳將含有30微克蛋白質的蛋白液加入到凝膠上樣孔中，使用Hoefer SE 600chroma 單向凝膠電泳儀器，設置恒功率參數，進行單向SDS-PAGE電泳。(5)、凝膠染色將染色液R和染色液G分別在100°C的水浴中加熱至少10分鐘，注意不要密封染色液瓶口，以防止染料爆瓶發生危險。將電泳結束后的凝膠剝離，做好切角標記，用超純水清洗凝膠表面，將兩塊凝膠平均分成若干等份，分別使用始終100°c的水浴條件下熱的染色液R和染色液G染色不同時間1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、8分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘，使用常溫的染色液R和染色液G分別染色過夜,作為對照。(6)、凝膠的脫色將染色結束的凝膠放入超純水清洗掉凝膠表面的染料，放入脫色液中緩慢搖床搖動脫色20 30分鐘，脫色液含有體積百分含量為20 %的乙醇和體積百分含量為10 %的乙酸。取出凝膠放入超純水中浸泡至凝膠背景干凈為止。使用GE掃描儀掃描凝膠，進行圖像分析。(7)、結果:通過圖lb、圖2b可見，CBB R250快速染色方法對巴西橡膠樹C乳清蛋白質單向 SDS-PAGE凝膠染色具有很好的效果。通過實施例I和實施例2中的圖譜2a、2b可知，在加熱染色時間最短為4分鐘時即可得到清晰的蛋白質條帶，同時CBB R250染色效果要優于CBB G250。同時，通過實施例I和實施例2中分別對木薯葉片蛋白質和巴西橡膠樹C乳清蛋白質單向SDS-PAGE電泳凝膠進行最佳染色時間(4分鐘)CBB R250和CBB G250快速染色后發現，如圖2a、2b所示，使用CBB R250染色的凝膠，能夠得到更清晰的蛋白質條帶，特別是針對低豐度蛋白質條帶(如箭頭所示)，CBB R250快速染色方法要優于CBB G250。實施例3(I)、本實施例采用的快速染色液的組分和配制方法同實施例1，并將染色液R均勻分成兩等份；(2)、木薯葉片蛋白質，巴西橡膠樹C乳清蛋白質，牛血清蛋白質的單向SDS-PAGE 電泳使用質量百分含量為12. 5%的SDS-PAGE配制兩塊厚度I. 5毫米的分離凝膠，膠凝結好后，配制質量百分含量為4%的SDS-PAGE濃縮膠，使用15齒梳制作15孔濃縮膠，最大上樣體積為100微升。將蛋白液按照木薯葉片蛋白質、巴西橡膠樹C乳清蛋白質、牛血清蛋白質的上樣順序各30微克樣品加入到凝膠上樣孔中，使用Hoefer SE 600chroma單向凝膠電泳儀器，設置恒功率參數，進行單向SDS-PAGE電泳。(3)、凝膠的染色及脫色兩份染色液R取一份100°C的水浴中加熱至少10分鐘，另一份不做加熱處理。將兩塊凝膠做好切角標記，用超純水清洗凝膠表面，一塊放入100°c的水浴條件下熱的染色液 R中染色4分鐘,一塊放入常溫染色液R中染色過夜。將染色結束的凝膠放入超純水清洗掉凝膠表面的染料，放入脫色液中緩慢搖床搖動脫色20 30分鐘，取出凝膠放入超純水中浸泡至凝膠背景干凈為止。使用GE掃描儀掃描凝膠，進行圖像分析。(4)、質譜鑒定分別選取CBB R250快速染色和常溫染色下的木薯葉片蛋白質、巴西橡膠樹C乳清蛋白質、牛血清蛋白質電泳分離后的高豐度蛋白質條帶(如圖3所示)，進行膠內酶解和質譜鑒定。通過生物信息學分析質譜結果。(5)、結果通過對木薯葉片蛋白質、巴西橡膠樹C乳清蛋白質及BSA單向SDS-PAGE凝膠分別進行CBB R250快速染色(圖3a)和常溫染色(圖3b)，切取高豐度蛋白質條帶(字母編號) 進行膠內酶解和質譜鑒定，結果證實CBB R250快速染色方法具有很好的質譜兼容性(見表
I)，適用于蛋白質組學研究。表I蛋白條帶質譜鑒定結果
權利要求
1.一種SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，其特征是含以下含量的組分體積百分含量為20 40%的乙醇，體積百分含量為5 10%的甲醇，質量濃度為O. 5 I. 25g/L 的CBB R250，體積百分含量為2. 5 5%的磷酸，質量濃度為100 200g/L的硫酸銨。
2.根據權利要求I所述的SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，其特征是含以下含量的組分體積百分含量為25 35%的乙醇，體積百分含量為6 9%的甲醇，質量濃度為 O. 8 I. Og/L的CBB R250，體積百分含量為3. 2 4. 2%的磷酸，質量濃度為125 175g/ L的硫酸銨。
3.根據權利要求2所述的SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，其特征是含以下含量的組分體積百分含量為30%的乙醇，體積百分含量為8%的甲醇，質量濃度為O. 85g/L 的CBB R250，體積百分含量為3. 5%的磷酸，質量濃度為150g/L的硫酸銨。
4.一種利用權利要求1、2或3所述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，其特征是含有以下步驟將SDS-PAGE凝膠置于水浴加熱的SDS-PAGE考馬斯亮藍 R250快速染色液中進行染色，染色結束后取出SDS-PAGE凝膠，并將其置于脫色液中脫色。
5.根據權利要求4所述的利用SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，其特征是將SDS-PAGE凝膠置于水浴加熱的SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液中進行染色的時間為4 8min。
6.根據權利要求5所述的利用SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，其特征是水浴加熱時的溫度為80°C 100°C。
7.根據權利要求4所述的利用SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，其特征是所述的脫色液中含有體積百分含量為20 40%的乙醇和體積百分含量為 I 10%的乙酸。
8.根據權利要求7所述的利用SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，其特征是在脫色液中脫色的時間為20 30min，并將脫色后的SDS-PAGE凝膠置于超純水中浸泡至背景干凈。
9.根據權利要求4所述的利用SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液進行染色的方法，其特征是所述的SDS-PAGE膠為單向膠，其含有質量百分含量為10 15%的聚丙烯酰胺分離膠和質量百分含量為I 5%的聚丙烯酰胺濃縮膠；或所述的SDS-PAGE膠為雙向膠，其含有質量百分含量為10 15%的聚丙烯酰胺分離膠。
10.權利要求1、2或3所述SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液在蛋白質雙向凝膠電泳以及蛋白質western blot定性和/或定量過程中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種SDS-PAGE考馬斯亮藍R250快速染色液，含以下含量的組分體積百分含量為20～40％的乙醇，體積百分含量為5～10％的甲醇，質量濃度為0.5～1.25g/L的CBB R250，體積百分含量為2.5～5％的磷酸，質量濃度為100～200g/L的硫酸銨。該染色液不需要染色前的固定和敏化步驟，能夠縮短蛋白質染色時間，極大的減少了蛋白質樣品被污染的可能性。還公開了利用上述染色液對SDS-PAGE凝膠進行染色的方法以及上述染色液在蛋白質雙向凝膠電泳以及蛋白質western blot定性和/或定量過程中的應用。
文檔編號G01N1/30GK102607920SQ201210067779
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月15日 優先權日2012年3月15日
發明者常麗麗, 王丹, 王旭初, 王海燕, 郭安平 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所