專利名稱：一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法
技術領域：
本發明涉及細胞內活性氧族和線粒體膜電位的檢測技術領域，具體涉及一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法。
背景技術：
活性氧族(Reactive Oxygen Species, R0S)是生物體氧化反應中形成的氧自由基和非自由基氧的衍生物，其中以超氧陰離子、過氧化氫為最常見的、活性最強。ROS引發的氧化應激是一系列心血管疾病的重要誘發因子，因此準確檢測細胞ROS含量及與之密切相關的線粒體膜電位，對于重大心血管疾病的研究與防治具有重要意義。由于生物體內活性氧的壽命極短、穩態濃度極低，對其準確測定非常困難。目前心肌ROS的檢測方法主要分為直接檢測和間接檢測兩大類。直接檢測方法包括電子自旋共振法、高效液相色譜法、化學發光法和熒光探針法等。其中前兩種對儀器設備要求高，且成本高，效率低，流程復雜；化學發光法相對簡便，但結果可信度較低，且無法實時跟蹤與空間定位。采用熒光探針標記，可結合流式細胞儀和熒光顯微鏡技術進行檢測，其中熒光探針結合共聚焦顯微成像技術是目前唯一能實現活細胞和組織內的ROS“實時、可見、定量”的檢測方法。然而，包括熒光探針法在內的上述ROS直接檢測方法在取材上迄今為止僅限于細胞、冰凍組織或組織勻漿液。其中，取材細胞的檢測往往無法準確反映體內正常代謝及功能狀態下的ROS水平。例如培養的心肌細胞系或分離培養的原代心肌細胞，其細胞表型、性狀及功能特點均較在體狀態發生了極大改變；即使是急性分離的心肌細胞，也不可避免因急性分離過程中伴隨的細胞損傷而對ROS的測量產生干擾。而對于冰凍組織，由于ROS半衰期的短暫，凍融過程將使ROS檢測的靈敏性和特異性大打折扣。其它取材方法如細胞或組織勻漿液，勻漿過程將帶來細胞損傷和/或ROS淬滅，大大降低ROS檢測的準確性和靈敏性。間接檢測方法常基于對ROS介導細胞過氧化損傷的終點效應的觀察，如利用 S-OHdG抗體免疫組化染色的方法檢測DNA氧化損傷，通過丙二醛(MDA)含量的測定評價脂質過氧化損傷程度等方法。由于間接檢測方法觀察的只是累積效應，缺乏特異性，無法對 ROS的生成進行時間和空間定位，且無法區分特定的ROS種類。相對于從細胞和冰凍組織取樣的檢測方法，心臟離體灌流技術既保留了器官功能和代謝的整體性，又去除了在體條件下神經、體液因素的干擾，可用于研究缺血缺氧、心臟急性過負荷、藥物、毒素等多種干預條件對心臟的影響。離體心臟灌流實驗系統是一種用于研究哺乳動物離體心臟在人工控制條件下，各種因素(如營養物質、藥物等)對心臟活動的影響。離體心臟活動的心室壓、心電等信號可用多道生物信號分析系統采集、處理和分析。 因此于離體灌流心臟檢測ROS水平，不僅可以實現ROS “實時、可見、定量”檢測，還能與心臟收縮功能、代謝狀態同步記錄，進而進行多種生理、病理過程以及干預措施中ROS與心臟功能、代謝的實時評價。隨之而來的問題是如何將ROS熒光探針技術應用于離體心臟灌流系統。目前已有多種商業化且應用廣泛的ROS探針，可用于不同類型ROS及不同細胞亞結構分布的ROS標記。然而，并非所有ROS探針都能在離體灌流心臟組織中取得良好的標記效果并能在激光共聚焦成像過程中達到實時、定位的要求。我們在對細胞內02_探針——二氫乙啶 (Dihydroethidium, DHE)及其衍生物的應用中發現,DHE在實驗過程中除了與Of反應生成氧化產物氧化乙啶外，還可產生一種非特異性氧化產物溴乙非啶，且兩者吸收波長非常近似。因此在傳統514nm激發波長下，DHE的特異性和非特異性氧化產物無法區分。因此為剔除溴乙非啶這一非特異性產物，傳統方法需用高效液相色譜進行精確定量。同樣，線粒體靶向(V探針——Mitosox red作為DHE線粒體定位的衍生物，也存在02_特異性的問題。我們發現，通過比較兩種不同的激發波長(即405nm和514nm激發波長)對應580nm吸收波長， 可特異性檢測DHE和Mitosox red與Of的作用產物，即(V特異性標記。此外，本專利技術通過對不同探針光學特性的分析，首次采用三聯負載方法，不僅可大大減少實驗樣本量，還可在同一樣本中對比分析不同測量目標之間的關系。另一個需要解決的問題是，成像采集過程中心臟持續搏動且要同時維持正常灌流，實驗儀器以及灌流系統也需相應的改良以保證圖像的有效采集。圖像采集過程中因心臟收縮造成偽影，本專利技術中采用在灌流液中加用肌纖維抑制劑Blebbistatin(IOmM) 以降低心率，可有效提高成像質量。
發明內容
為了克服上述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，涉及探針選擇、標記方法、成像條件的設置、圖像采集參數的選擇等關鍵環節，具有實時、原位、可定位、定量的特點，且成本低，效率高，可信度與重復性好。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，包括以下步驟第一步，離體心臟灌流模型的建立，取小型哺乳動物經肝素化、麻醉后迅速開胸取出心臟并固定于Langendorff灌流系統,經主動脈逆行灌流以95% 02+5% CO2混合氣體飽和的 K-H 液(37°C，pH 7. 4, mmol/L) NaCl 115，NaHC0325，glucose 11, KCl 4. 0，CaCl2L 5， MgSO4O. 9，KH2PO4O. 9，為實時測量心臟收縮功能，在左心房肺靜脈入口處剪一開口，將一連接于壓力傳感器的球囊經左心房插入左心室，完全排出球囊內空氣后充入去離子水直至達到5-10mmHg的初始舒張壓，由多道生理記錄系統連續實時采集左室壓力指標，心率HR、左室收縮壓LVSP、左室舒張末壓LVEDP、左室壓變化最大速率土LV dP/dtmax的數據，由計算機自動記錄并計算處理進行心功能評價，第二步，離體灌流系統與探針負載裝置和顯微鏡的儀器關聯，采用Zeiss LSM 510 共聚焦顯微鏡，載物臺正中放置3-5cm直徑、1-1. 5cm高的光學玻璃皿，將灌流心臟左室心尖部貼于玻璃皿上，將灌流管道末端鉗夾固定，保證心臟穩定貼于玻璃皿上避免移位，玻璃皿側壁放置一引流管，經蠕動泵驅動可自動引流灌流心臟的流出液，熒光探針的負載利用微量泵裝置，將置于注射器內的探針濃縮液經微量泵勻速泵入，注射器通過軟管接三通與心臟灌流裝置的灌流終端相連，通過三通的開閉和微量泵泵速調節以控制熒光探針濃縮液的輸入時機和輸入速度，第三步，熒光探針負載，離體心臟于基礎灌流狀態下穩定15-20分鐘后，給予針對OpH2O2、線粒體特異性O2'和粒線體膜電位的熒光探針DHE (I(T5moI/L)，DCFDA(5X1 (T5moI/ L)，MitoSOX Red (2. 5Xl(T6mol/L)，TMRE (5Xl(T6mol/L)，同時給予 DAPI (I μ g/ml)和 / 或 MitoGreen (5X10^7mol/L)襯染細胞核和線粒體，熒光探針負載濃度與速度通過設置微量泵泵入速度控制，微量泵泵入速度=探針工作液濃度/探針濃縮液濃度*100%，采用二聯或三聯負載方法，所用熒光探針特異性、工作濃度及熒光顯微鏡成像時所用激發/吸收波長見下表，
權利要求
1.一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，離體心臟灌流模型的建立，取小型哺乳動物經肝素化、麻醉后迅速開胸取出心臟并固定于Langendorff灌流系統，經主動脈逆行灌流以95% 02+5 % CO2混合氣體飽和的 K-H 液(37°C, pH 7.4，mmol/L) NaCl 115，NaHC0325, glucose 11，KCl 4.0，CaCl2L 5， MgSO4O. 9，KH2PO4O. 9，為實時測量心臟收縮功能，在左心房肺靜脈入口處剪一開口，將一連接于壓力傳感器的球囊經左心房插入左心室，完全排出球囊內空氣后充入去離子水直至達到5-10mmHg的初始舒張壓，由多道生理記錄系統連續實時采集左室壓力指標，心率HR、左室收縮壓LVSP、左室舒張末壓LVEDP、左室壓變化最大速率土LV dP/dtmax的數據，由計算機自動記錄并計算處理進行心功能評價，第二步，離體灌流系統與探針負載裝置和顯微鏡的儀器關聯，采用Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡，載物臺正中放置3-5cm直徑、1-1. 5cm高的光學玻璃皿，將灌流心臟左室心尖部貼于玻璃皿上，將灌流管道末端鉗夾固定，保證心臟穩定貼于玻璃皿上避免移位，玻璃皿側壁放置一引流管，經蠕動泵驅動可自動引流灌流心臟的流出液，熒光探針的負載利用微量泵裝置，將置于注射器內的探針濃縮液經微量泵勻速泵入，注射器通過軟管接三通與心臟灌流裝置的灌流終端相連，通過三通的開閉和微量泵泵速調節以控制熒光探針濃縮液的輸入時機和輸入速度，第三步，熒光探針負載，離體心臟于基礎灌流狀態下穩定15-20 分鐘后，給予針對02_、H2O2、線粒體特異性02_、和粒線體膜電位的熒光探針DHE(10_5mol/ L), DCFDA(5Xl(T5mol/L)，MitoSOX Red (2. 5Xl(T6mol/L)，TMRE (5Xl(T6mol/L)，同時給予 DAPI (I μ g/ml)和/或MitoGreen (5Xl(r7mol/L)襯染細胞核和線粒體，熒光探針負載濃度與速度通過設置微量泵泵入速度控制，微量泵泵入速度=探針工作液濃度/探針濃縮液濃度*100%，采用二聯或三聯負載方法，所用熒光探針特異性、工作濃度及熒光顯微鏡成像時所用激發/吸收波長見下表，
2.根據權利要求I所述的一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，離體心臟灌流模型的建立，戍巴比妥鈉(50mg/kg, i.p.)麻醉并肝素化 (500IU/kg, i. v.)兔,迅速開胸取出心臟并固定于Langendorff灌流系統,經主動脈逆行灌流以 95% 02+5% CO2 混合氣體飽和的 K-H 液(37°C,pH 7. 4,mmol/L) NaCl 115，NaHC0325， glucosell, KCl 4.0，CaCl2L 5，MgSO4O. 9，KH2PO4O. 9，為實時測量心臟收縮功能，在左心房肺靜脈入口處剪一開口，將一連接于壓力傳感器的球囊經左心房插入左心室，完全排出球囊內空氣后充入去離子水直至達到5-10mmHg的初始舒張壓，由多道生理記錄系統連續實時采集左室壓力指標，心率HR、左室收縮壓LVSP、左室舒張末壓LVEDP、左室壓變化最大速率土LV dP/dtmax的數據，由計算機自動記錄并計算處理進行心功能評價，待心率和收縮功能穩定后換用添加有肌纖維抑制劑Blebbistatin(5mM)的灌流液灌注心臟以降低心率， 第二步，離體灌流系統與探針負載裝置和顯微鏡的儀器關聯，采用Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡，載物臺正中放置5cm直徑、I. 5cm高的光學玻璃皿，將灌流心臟左室心尖部貼于玻璃皿上，將灌流管道末端鉗夾固定，保證心臟穩定貼于玻璃皿上避免移位，玻璃皿側壁放置一引流管，經蠕動泵驅動可自動引流灌流心臟的流出液。熒光探針的負載主要利用微量泵裝置，將置于注射器內的50X探針濃縮液經微量泵勻速泵入，注射器通過軟管接三通與心臟灌流裝置的灌流終端相連，通過三通的開閉和微量泵泵速調節以控制熒光探針濃縮液的輸入時機和輸入速度，第三步，熒光探針負載，離體心臟于基礎灌流狀態下穩定15分鐘后，給予(V熒光探針 DHE (5Xl(r6mol/L)，同時用Vybrant Ruby (2. 5X10^6mol/L)襯染細胞核，熒光探針負載濃度與速度通過設置微量泵泵入速度控制，微量泵泵入速度設置為心臟冠脈流出液流速的2%， 即若兔離體心臟冠脈流出液流速為20ml/min，則微量泵泵入速度設置為(20ml/minX2% =O. 4ml/min,即24ml/h)，所用熒光探針濃度、配制方法及熒光顯微鏡成像時所用激發/吸收波長如下，
3.根據權利要求I所述的一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，大鼠離體心臟灌流模型的建立，戊巴比妥鈉(50mg/kg，i.p.)麻醉并肝素化 (500IU/kg, i. v.)大鼠，迅速開胸取出心臟并固定于Langendorff灌流系統，經主動脈逆行灌流以 95% 02+5% CO2 混合氣體飽和的 K-H 液(37°C，pH 7. 4，mmol/L) =NaCl 115， NaHC0325, glucose 11，KCl 4. 0，CaCl2L 5，MgSO4O. 9，KH2PO4O. 9，為實時測量心臟收縮功能， 在左心房肺靜脈入口處剪一開口，將一連接于壓力傳感器的球囊經左心房插入左心室，完全排出球囊內空氣后充入去離子水直至達到5-10mmHg的初始舒張壓，由多道生理記錄系統連續實時采集左室壓力指標，心率HR、左室收縮壓LVSP、左室舒張末壓LVEDP、左室壓變化最大速率土LV dP/dtmax的數據，由計算機自動記錄并計算處理進行心功能評價，待心率和收縮功能穩定后換用添加有肌纖維抑制劑Blebbistatin(IOmM)的灌流液灌注心臟以降低心率，第二步，離體灌流系統與探針負載裝置和顯微鏡的儀器關聯，采用Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡，載物臺正中放置3cm直徑、Icm高的光學玻璃皿，將灌流心臟左室心尖部貼于玻璃皿上，將灌流管道末端鉗夾固定，保證心臟穩定貼于玻璃皿上避免移位，玻璃皿側壁放置一引流管，經蠕動泵驅動可自動引流灌流心臟的流出液，熒光探針的負載利用微量泵裝置， 將置于注射器內的20X探針濃縮液經微量泵勻速泵入，注射器通過軟管接三通與心臟灌流裝置的灌流終端相連，通過三通的開閉和微量泵泵速調節以控制熒光探針濃縮液的輸入時機和輸入速度，第三步，熒光探針負載，離體心臟于基礎灌流狀態下穩定15分鐘后，給予O2-熒光探針 DHE (5Xl(r6mol/L)，同時用Vybrant Ruby (2. 5X10^6mol/L)襯染細胞核，熒光探針負載濃度與速度通過設置微量泵泵入速度控制，微量泵泵入速度設置為心臟冠脈流出液流速的5%， 即若大鼠離體心臟冠脈流出液流速為8ml/min，則微量泵泵入速度設置為(8ml/minX5% =O. 4ml/min,即24ml/h)，所用熒光探針濃度、配制方法及熒光顯微鏡成像時所用激發/吸收波長如下，
4.根據權利要求I所述的一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，小鼠離體心臟灌流模型的建立，戊巴比妥鈉(50mg/kg，i.p.)麻醉并肝素化 (500IU/kg, i. v.)小鼠，迅速開胸取出心臟并固定于Langendorff灌流系統，經主動脈逆行灌流以 95% 02+5% CO2 混合氣體飽和的 K-H 液(37°C，pH 7. 4，mmol/L) =NaCl 115， NaHC0325, glucose 11，KCl 4. 0，CaCl2L 5，MgSO4O. 9，KH2PO4O. 9，為實時測量心臟收縮功能， 在左心房肺靜脈入口處剪一開口，將一連接于壓力傳感器的球囊經左心房插入左心室，完全排出球囊內空氣后充入去離子水直至達到5-10mmHg的初始舒張壓，由多道生理記錄系統連續實時采集左室壓力指標，心率HR、左室收縮壓LVSP、左室舒張末壓LVEDP、左室壓變化最大速率土LV dP/dtmax的數據，由計算機自動記錄并計算處理進行心功能評價，待心率和收縮功能穩定后換用添加有肌纖維抑制劑Blebbistatin(IOmM)的灌流液灌注心臟以降低心率，第二步，離體灌流系統與探針負載裝置和顯微鏡的儀器關聯，采用Zeiss LSM 510共聚焦顯微鏡，載物臺正中放置3cm直徑、Icm高的光學玻璃皿，將灌流心臟左室心尖部貼于玻璃皿上，將灌流管道末端鉗夾固定，保證心臟穩定貼于玻璃皿上避免移位，玻璃皿側壁放置一引流管，經蠕動泵驅動可自動引流灌流心臟的流出液，熒光探針的負載主要利用微量泵裝置，將置于注射器內的20X探針濃縮液經微量泵勻速泵入，注射器通過軟管接三通與心臟灌流裝置的灌流終端相連，通過三通的開閉和微量泵泵速調節以控制熒光探針濃縮液的輸入時機和輸入速度，第三步，熒光探針負載，離體心臟于基礎灌流狀態下穩定20分鐘后， 給予針對H2O2和線粒體膜電位的熒光探針DCFDA(5X10_6mol/L)和TMRE (5X10_6mol/L)，同時給予DAPI (I μ g/ml)襯染細胞核，微量泵泵入速度設置為心臟冠脈流出液流速的5%，即 若小鼠離體心臟冠脈流出液流速為2ml/min，則微量泵泵入速度設置為(2ml/minX5% =O.lml/min,即6ml/h)，本專利技術采用三聯負載方法，所用熒光探針濃度、配制方法及熒光顯微鏡成像時所用激發/吸收波長如下，
全文摘要
一種離體灌流心臟活性氧族和線粒體膜電位的檢測方法，通過離體灌流心臟缺血再灌注模型的建立，實現將離體心臟灌流系統與探針負載裝置及激光共聚焦顯微鏡的關聯，進而進行活性氧族和線粒體膜電位的熒光探針的實時負載和顯微鏡成像，最后通過圖像處理和數據分析，本發明能夠對穩定灌流狀態下以及以急性超負荷、缺血再灌注等為代表的多種離體心臟模型中心臟ROS和線粒體膜電位進行實時、定位測量。本發明具有直接、準確、可見、時間和空間定位，與搏動心臟代謝與功能同步測量的特點，而且成本低，效率高，可信度與重復性好。
文檔編號G01N21/64GK102608089SQ20121006469
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者喻秋珺, 王海昌 申請人:喻秋珺