專利名稱：基于流式細(xì)胞術(shù)快速定量檢測淡水環(huán)境中總病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種基于流式細(xì)胞術(shù)快速定量檢測淡水環(huán)境中總病毒的方法。
背景技術(shù)：
近10余年來的研究表明，水環(huán)境中存在大量病毒，這些病毒或感染進(jìn)入水生生物細(xì)胞內(nèi)、或漂浮在水體中，被稱為浮游病毒。浮游病毒是水體中含量最高的生物類群。浮游病毒含噬菌體(噬藻體)、藻類病毒，游離在水中的各種動(dòng)植物病毒以及在極端水環(huán)境中的泉古菌病毒等類群。開發(fā)利用浮游病毒這類戰(zhàn)略生物資源，篩選殺藻病毒(噬藻體)，是控制直至消滅有害藻華(赤潮)暴發(fā)的生物技術(shù)途徑之一。環(huán)境中病毒的定量檢測方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法和顯微鏡技術(shù)(如透射電子顯微鏡法、熒光顯微鏡法)，現(xiàn)有的這些方法大多耗時(shí)費(fèi)力，因此急需檢測結(jié)果穩(wěn)定，可快速定量檢測的淡水環(huán)境中總病毒的方法。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)最先發(fā)展于二十世紀(jì)六十年代，并快速地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域來進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分析。微生物學(xué)家七十年代后期才開始用這個(gè)工具。而如今隨著熒光染料的不斷改進(jìn)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)正在迅速成為ー種在環(huán)境水生微生物領(lǐng)域的不可或缺的工具。它使得微生物分析既可以在群落水平開展也可以在單細(xì)胞水平開展。與其他技術(shù)相比，F(xiàn)CM實(shí)現(xiàn)了快速的數(shù)據(jù)采集和多參數(shù)分析，因此得到了廣泛的應(yīng)用。目前，尚無可詳細(xì)參考的有關(guān)使用流式細(xì)胞儀定量檢測淡水環(huán)境中總病毒方法的報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的解決現(xiàn)有方法大多耗時(shí)費(fèi)カ的問題，建立ー種利用流式細(xì)胞儀快速定量測定淡水環(huán)境中總病毒含量的檢測方法。本發(fā)明提供的基于流式細(xì)胞術(shù)快速定量檢測淡水環(huán)境中總病毒的方法，步驟如下第I、水樣過孔徑為0. 22 iim的濾膜后加入戊ニ醛，使戊ニ醛的最終質(zhì)量濃度為 0. 25%，并立即放入4°C冰箱；固定15min后用液氮冷凍并放置于_80°C的冷藏室中保存。第2、檢測前將第I步保存的水樣置于室溫下解凍；加入Na2EDTA使最終濃度達(dá)到 5mmol/l，隨后加入熒光染料SYBR Green I儲(chǔ)備液。第3、將第2步處理后的水樣于80°C避光染色lOmin，待冷卻至室溫后上流式細(xì)胞儀檢測，水樣測試前用Milli-Q水稀釋至流式細(xì)胞儀檢測濃度小于2X 105COunts/ml。其中第2步中的SYBR Green I儲(chǔ)備液為用過孔徑0. 22 y m濾膜的ニ甲基亞砜 (DMSO)稀釋100倍SYBR Green I原液作為儲(chǔ)備液，保存在_20°C下。染色前，將第I步保存的樣品取出并在室溫下解凍后，于每Iml中加入5iU SYBR Green I儲(chǔ)備液。第3步中的流式細(xì)胞儀，光源功率為50mW，發(fā)射波長488nm的藍(lán)色激光，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定時(shí)，通過調(diào)節(jié)濾光片來收集發(fā)射光信號(hào)，信號(hào)收集軟件為FlowMax。綠色熒光(FLl)被設(shè)定為觸發(fā)參數(shù)，信號(hào)收集波長520 ±20nm，SSC為側(cè)向散射光；所有信號(hào)均被收集在綠色熒光與側(cè)向散射光的ニ維散點(diǎn)圖上。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明方法避免了現(xiàn)有淡水總病毒測定中耗時(shí)費(fèi)力的問題，在水樣采集保存后， 利用本發(fā)明中的方法，僅在30min之內(nèi)即可完成水樣的染色，上機(jī)并給出檢測結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了淡水總病毒的快速定量測定。利用該方法不但可以得到水中總的病毒含量，還可以根據(jù)綠色熒光與側(cè)向散射光的ニ維散點(diǎn)圖來分析病毒的群落結(jié)構(gòu)特征。本該方法操作步驟簡単， 檢測用時(shí)短，在淡水病毒檢測及水生生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖I為利用本發(fā)明方法在流式細(xì)胞儀上得到的淡水樣品中總病毒檢測結(jié)果，其中 Rl所包含的區(qū)域?yàn)槟车畼悠分械牟《?，最終檢測濃度為3. 4X108counts/ml ；圖2為利用本發(fā)明方法在流式細(xì)胞儀上得到的Milli-Q水樣中總病毒檢測結(jié)果。圖3為利用本發(fā)明方法檢測河水稀釋水樣所得濃度與稀釋程度的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I天津某淡水水樣中病毒總量的檢測第I、將采集到的淡水水樣過0. 22 y m濾膜，加入適量戊ニ醛進(jìn)行固定，使戊ニ醛的最終質(zhì)量濃度為0. 25%，并立即放入4°C冰箱；待15min后用液氮冷凍并放置于_80°C的冰箱中保存。第2、取出上步冷凍后的樣品于室溫下解凍，取Iml于已滅菌的離心管中，加入 10 u I濃度為0. 5mol/l的Na2EDTA溶液(最終濃度達(dá)為5mmol/l)，隨即加入5 的SYBR Green I儲(chǔ)備液(用過孔徑0. 22 y m濾膜的ニ甲基亞砜稀釋100倍SYBR Green I原液作為儲(chǔ)備液)。第3、震蕩混勻后于80 0C避光染色lOmin，冷卻至室溫后，用Mi 11 i_Q水稀釋至流式細(xì)胞儀檢測濃度小于2X 105counts/ml。進(jìn)樣，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖I所示，左側(cè)部分為儀器背景，右側(cè)Rl內(nèi)為病毒。此淡水樣品中所含總病毒濃度為3. 4 X 108counts/ml。實(shí)施例2空白水樣中病毒總量的檢測將Milli-Q水作為待測水樣，按照實(shí)施例I中的方法步驟進(jìn)行檢測。由于Milli-Q 水不含有病毒、細(xì)菌等，檢測結(jié)果如圖2所示，僅可看到背景部分，無病毒群落出現(xiàn)。此樣品可作為陰性對(duì)照樣品。實(shí)施例3方法的檢出限將某河水水樣用Milli-Q水進(jìn)行稀釋，稀釋后每個(gè)樣品中的河水量分別占 0. 05%,0. 1%,0. 5%A. 0%、10%、25%、50%、80%、100%。將上述樣品按照實(shí)施例I中的方法處理后，上流式細(xì)胞儀檢測。檢測結(jié)果表明(圖3)，本發(fā)明中的方法可檢出淡水中病毒的最低濃度為4. 04X 104counts/ml，方法的相關(guān)性很好，相關(guān)系數(shù)R2 > 0. 99 (n = 9)，方法的重復(fù)性很好，檢測樣品(n = 9)平均誤差小于 10%。
權(quán)利要求
1.一種基于流式細(xì)胞術(shù)快速定量檢測淡水環(huán)境中總病毒的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下第I、水樣過孔徑為O. 22μπι的濾膜后加入戊二醛，使戊二醛的最終質(zhì)量濃度為O.25%，并立即放入4°C冰箱；固定15min后用液氮冷凍并放置于_80°C的冷藏室中保存；第2、檢測前將第I步保存的水樣置于室溫下解凍；加入Na2EDTA使最終濃度達(dá)到 5mmol/l，隨后加入熒光染料SYBR Green I儲(chǔ)備液；第3、將第2步處理后的水樣于80°C避光染色lOmin，待冷卻至室溫后上流式細(xì)胞儀檢測，水樣測試前用Milli-Q水稀釋至流式細(xì)胞儀檢測濃度小于2X 105COunts/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于第2步中所述的SYBRGreen I儲(chǔ)備液為 用過孔徑O. 22 μ m濾膜的二甲基亞砜(DMSO)稀釋100倍SYBR Green I原液作為儲(chǔ)備液，保存在-20°C下；染色前，將第I步保存的樣品取出并在室溫下解凍后，于每Iml中加入5μ I SYBR Green I儲(chǔ)備液，于80°C避光染色lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于第3步中所述的流式細(xì)胞儀，光源功率為 50mff,發(fā)射波長488nm的藍(lán)色激光，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定時(shí)，通過調(diào)節(jié)濾光片來收集發(fā)射光信號(hào)，信號(hào)收集軟件為FlowMax;綠色熒光(FLl)被設(shè)定為觸發(fā)參數(shù)，信號(hào)收集波長 520±20nm，SSC為側(cè)向散射光；所有信號(hào)均被收集在綠色熒光與側(cè)向散射光的二維散點(diǎn)圖上。
全文摘要
一種基于流式細(xì)胞術(shù)快速定量檢測淡水環(huán)境中總病毒的方法，屬于生物技術(shù)和水環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域。該方法包括過膜、固定、保存、染色、稀釋、檢測共六個(gè)主要步驟。具體操作過程如下將采集到的水樣過0.22μm的濾膜后；加入戊二醛4℃固定15min后經(jīng)液氮冷凍；保存于–80℃冰箱；檢測前加入Na2EDTA以及熒光染料SYBRGreenI于80℃避光染色10min；待樣品降至室溫后用Milli-Q水稀釋；上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。本發(fā)明方法避免了現(xiàn)有淡水總病毒測定方法耗時(shí)費(fèi)力的問題，實(shí)現(xiàn)了淡水病毒的快速定量測定，在淡水病毒檢測及水生生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N15/14GK102590068SQ20121006328
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者余輝, 王瑩瑩, 馬麗麗, 馬克·巴特蘭姆 申請(qǐng)人:南開大學(xué)