專利名稱：一種狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法
技術領域：
本發明涉及ー種狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法，即以表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞作為抗原和載體顆粒，通過與人、犬和貓的血清抗體進行凝集反應，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗體是否達到免疫保護水平；屬于生物工程技術領域。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的ー種致死性傳染病，一旦發病即導致100%死亡。防止狂犬病發生的根本手段是對動物進行暴露前預防免疫或對人進行暴露后緊急治療。兩種方法都是通過注射疫苗，使接種動物或人產生足夠水平的中和抗體，從而阻止病毒感染的發生。免疫動物或人體內狂犬病病毒中和抗體達到0. 5IU/mL以上，既可有效防止狂犬病病毒的感染，中和抗體水平越高，其維持免疫保護的時間越長，因此，定量監測血清內中和抗體滴度，對于判斷免疫效果和免疫持續期具有重要的意義。用于測定狂犬病病毒中和抗體的方法包括小鼠腦內中和試驗、蝕斑抑制試驗、快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)和熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)等，其中RFFIT法和FAVN法分別是WHO和OIE推薦的標準方法。但是，這些檢測方法所需時間較長(一般在48h以上)，操作復雜(需要使用活病毒和動物、細胞)，而且檢測成本高。為了改進這些方法，不同的實驗室和研究人員分別建立了酶聯免疫吸附試驗、熒光標記抗體檢測和乳膠凝集試驗等方法，但這些技術均以病毒顆粒或純化蛋白作為抗原， 存在檢測抗體針對性不強或成本高的缺點。
發明內容
本發明涉及ー種狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法，解決了傳統測定狂犬病病毒中和抗體的方法時間長、操作復雜、檢測成本高等問題。本發明公開的狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法，采用以下技術解決方案
以表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞作為抗原和載體顆粒，通過與血清抗體進行凝集反應，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗體是否達到免疫保護水平。基本方案以攜帶狂犬病病毒糖蛋白基因的pIRES-neo真核表達載體分別轉染人胚腎細胞四3、犬腎細胞MDCK和貓腎細胞F81，通過G418篩選，分別獲得穩定表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞系。然后，將該細胞系在1%多聚甲醛中固定后，取其產物分別與人、犬和貓的待檢血清進行反應，當血清中狂犬病病毒中和抗體水平達到免疫保護水平吋，會出現明顯的凝集現象，否則不凝集。本發明的狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法的建立 1.狂犬病病毒糖蛋白基因表達載體的構建
利用商品化的真核表達質粒載體pIRES-neo (CL0NTECH公司產品)，通過常規的分子克隆技術構建表達狂犬病病毒糖蛋白基因(GenBank :AF499686. 2)的載體pIRES_neo/G。2.穩定表達細胞系的建立在轉染試劑(脂質體等)的介導下，將構建的真核表達載體pIRES-neo/G分別轉染至人胚腎細胞四3、犬腎細胞MDCK和貓腎細胞F81中，通過G418篩選，獲得穩定表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞系。3.抗原與載體顆粒的制備
將該細胞系用PBS (pH7. 4)洗滌3次后，加入等體積的1%多聚甲醛固定后，2000rpm離心3min，細胞沉淀用等體積PBS (pH7. 4)重懸，即獲得攜帯抗原的載體顆粒。4.細胞凝集試驗
取攜帯抗原的載體顆粒，分別與稀釋后的人、犬和貓待檢血清等體積混合后，37°C反應 15min,當血清中狂犬病病毒中和抗體水平達到免疫保護水平吋，會出現明顯的凝集現象， 否則不凝集。發明的積極效果在于采用真核傳代細胞建立了ー種凝集試驗方法，可用于檢測狂犬病病毒中和抗體水平，在制備和檢測程序上，均不同于目前廣泛使用的紅細胞凝集試驗和乳膠凝集試驗。本方法具有以下特盧"采用真核細胞表達的狂犬病病毒糖蛋白(無需純化)作為抗原。糖蛋白是唯一能夠誘導中和抗體的狂犬病病毒結構蛋白，因此，以其作為抗原，可以特異性檢測具有中和活性的抗體。②以本動物細胞作為載體顆粒。分別以攜帶糖蛋白的人胚腎細胞四3、犬腎細胞MDCK和貓腎細胞F81為載體顆粒，原因一是普通凝集試驗采用的乳膠(Latex)顆粒制備成本高，而且吸附的抗原需要純化，エ藝復雜；二是人、犬和貓的血清中不存在針對各自體細胞的特異性抗體，采用人胚腎細胞四3、犬腎細胞MDCK和貓腎細胞F81分別作為檢測人、犬和貓血清的凝集載體，可避免出現假陽性。j制備、操作簡單、 反應快速，整個檢測過程僅需半小吋。與乳膠凝集試驗相比，省去了載體顆粒與抗原的包被過程，只需在載玻片上滴加稀釋的血清和表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞懸液，混勻即可ンi1 判定準確。特異性檢測中和抗體，且能準確判定抗體的保護力。
圖1、CL0NTECH公司的真核表達質粒載體；
圖2、熒光抗體檢測293細胞表達糖蛋白(左為正常細胞對照，右為轉染后細胞系)； 圖3、293細胞凝集(左為呈葡萄串狀凝集的細胞，右為均勻分布的未凝集細胞)； 圖4、熒光抗體檢測MDCK細胞表達糖蛋白(左為正常細胞對照，右為轉染后細胞系)； 圖5、MDCK細胞凝集(左為呈葡萄串狀凝集的細胞，右為均勻分布的未凝集細胞)； 圖6、熒光抗體檢測F81細胞表達糖蛋白(左為正常細胞對照，右為轉染后細胞系)； 圖7、F81細胞凝集(左為呈葡萄串狀凝集的細胞，右為均勻分布的未凝集細胞)。具體實施方案
下面結合實施例，對本發明做進ー步描述。其作用被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。實施例1
狂犬病病毒糖蛋白基因真核表達載體的構建
利用商品化的真核表達質粒載體pIRES-neo (圖1)的多克隆酶切位點^^. BamHI插入狂犬病病毒糖蛋白基因(GenBank :AF499686. 2)，構建表達糖蛋白基因的表達盒。EcoR V私BamH I雙酶切體系(寶生物工程(大連)有限公司產品)兩種內切酶各 10U，K緩沖液2Pl，pIRES-ne0質粒 μδ,蒸餾水補至20μ1。37°C水浴1小時后，1%瓊脂糖凝膠電泳回收5. 3bp條帶(回收步驟參照Axygen公司DNA凝膠回收試劑盒說明書)。DNA連接體系(寶生物工程(大連)有限公司產品)T4 DNA連接酶200U，反應緩沖液 μ ，狂犬病病毒糖蛋白基因片段和回收的pIRES-ne0片段各0. 5μδ,蒸餾水補至10μ1。 16°C水浴4小時后，轉化感受態Dffia。轉化條件5μ1連接產物加入ΙΟΟμΙ感受態Dffia (寶生物工程(大連)有限公司產品)，冰浴30min，42°C熱激90秒，取轉化產物涂Amp抗性LB平板，37°C培養12小吋。重組pIRES-neo/G鑒定挑取單菌落，置Amp抗性LB中37°C培養12小吋，提取質粒(步驟參照Axygen公司質粒小量提取試劑盒說明)，EcoR . BamH I雙酶切質粒(體系同上)，1%瓊脂糖凝膠電泳出現5. 3bp和1. 75bp條帶，為重組質粒pIRES-neo/G。實施例2
人狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法的建立 1.穩定表達細胞系的建立
在脂質體2000的介導下，將構建的真核表達載體pIRES-neo/G轉染至人胚腎細胞293 中。轉染步驟取10μ1脂質體2000，與的pIRES-neo/G等體積混合5min ；去除細胞培養基，將混合液平鋪在單層細胞上，370C 5%C02感作30min，加入含5%小牛血清的DMEM培養基，37°C 5%C02培養。次日，去除細胞培養基，以含15(^g/mL G418和5%小牛血清的DMEM 對細胞進行篩選，獲得穩定表達neo基因的293細胞系。利用商品化FITC標記的狂犬病病毒抗體對獲得的細胞進行染色，熒光顯微鏡下鑒定糖蛋白表達情況(圖2)。2.抗原與載體顆粒的制備
將該細胞系用PBS (pH7. 4)洗滌3次后，加入等體積1%多聚甲醛4°C固定20min后， 獲得攜帯抗原的載體顆粒。2000rpm離心3min，去除上清，細胞沉淀用等體積PBS (pH7. 4) 重懸，并調整細胞濃度至1 X 106/mL。3.細胞凝集試驗的建立
取0. 5IU/mL的狂犬病病毒標準血清(AFSSA，法國)，分別用PBS (pH7. 4)稀釋5倍和 10倍。將細胞和稀釋血清等體積混合后，37°C反應15min。光學顯微鏡(OLYMPUS產品)20 倍物鏡下觀察(圖3)。當5倍稀釋的血清發生凝集，10倍稀釋的血清不發生凝集吋，檢測成立；待測樣品若5倍稀釋后凝集，10倍稀釋后不凝集吋，抗體水平判定為0. 5IU/mL ；待測樣品若5倍和10倍稀釋后均凝集，抗體水平判定為大于0. 5IU/mL ；待測樣品若5倍和10倍稀釋后均不凝集，抗體水平判定為小于0. 5IU/mL。4.人血清樣品的檢測
人血清樣品8份，由本實驗室工作人員提供。細胞凝集試驗法檢測步驟取待檢血清和0. 5IU/mL的狂犬病病毒標準血清，分別用PBS (pH7. 4)稀釋5倍和10倍。取25μ1細胞和稀釋血清等體積混合后，37°C濕盒內反應15min。光學顯微鏡20倍物鏡下觀察凝集情況。FAVN法檢測步驟對待檢血清按β1』2』3、.. . 312進行稀釋，加入100 TCID50的狂犬病病毒CVS-Il感作一定時間后，加入ΒΗΚ-21細胞，培養48h。丙酮固定細胞后，加熒光標
5記抗體染色，熒光顯微鏡下讀取結果。以100 TCID5tl CVS-Il的復制完全被抑制作為最終抑制效價判定結果。以0. 5IU/mL作為狂犬病最低保護水平。檢測結果如表1所示，細胞凝集試驗的檢測結果與FAVN (金標準)法完全一致。表1人血清樣品檢測結果
權利要求
1.一種通過細胞凝集反應檢測狂犬病病毒中和抗體水平的方法，其特征為以表達狂犬病病毒糖蛋白的人宮頸癌HeLa細胞裂解物同時作為抗原和載體顆粒，通過與人、犬和貓的血清抗體分別進行凝集反應，判定血清中所含狂犬病病毒中和抗體是否達到免疫保護水平。
2.如權利要求1所述檢測狂犬病病毒中和抗體水平的方法，包括以下步驟1)狂犬病病毒糖蛋白基因表達載體的構建利用真核表達質粒載體pIRESneo，通過常規的分子克隆技術構建表達狂犬病病毒糖蛋白基因的載體PlRESneo-G ；2)穩定表達細胞系的建立在轉染試劑的介導下，將構建的真核表達載體PlRESneo-G轉染至人宮頸癌HeLa細胞中，通過G418篩選，獲得穩定表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞系；3)抗原與載體顆粒的制備將該細胞系用PBS洗滌3次后，加入PBS凍融裂解3次后，獲得攜帯抗原的載體顆粒；4)細胞凝集試驗取攜帯抗原的載體顆粒與待檢血清等體積混合后，37°C反應15min，當血清中狂犬病中和抗體水平達到免疫保護水平吋，會出現明顯的凝集現象，否則不凝集。
全文摘要
本發明提供一種狂犬病病毒中和抗體細胞凝集試驗檢測方法，即以表達狂犬病病毒糖蛋白的細胞作為抗原和載體顆粒，通過與人、犬和貓的血清抗體進行凝集反應，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗體是否達到免疫保護水平；解決了傳統測定狂犬病病毒中和抗體的方法時間長、操作復雜、檢測成本高等問題。
文檔編號G01N33/569GK102539757SQ201210051228
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者劉曄, 張守峰, 張菲, 扈榮良 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所