專利名稱：多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種多房棘球絳蟲循環抗原檢測試劑，尤其是涉及一種采用膠體金免疫滲濾技術(immunofiItration)進行的多房棘球絳蟲循環抗原免疫滲濾檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
泡狀棘球蝴病(Alveolar echinococcosis, AE)是由棘球絳蟲屬的多房棘球絳蟲(Echinococcus multicularia, Em)幼蟲寄生所致的人畜共患寄生蟲病，在我國主要分布于內蒙、新疆、西藏、甘肅、寧夏、青海和四川西部等廣大牧區，是我國目前主要防治的寄生蟲病之一。該病被認為是最致命的蠕蟲感染病，是世界性最危險的“人畜共患病”之一。人因攝入棘球絳蟲蟲卵而被感染，繼而幼蟲在患者肝部呈多泡狀、腫瘤樣浸潤遷移生長，迅速破壞肝實質細胞，最終導致肝機能不全或喪失，并伴有肺、腦等重要器官轉移， 確診后10年內患者的死亡率高達90 %以上([l]Filippou D. , Tselepis D. , Filippou G.and Papadopoulos V. Advances in Liver Echinococcosis !Diagnosis and Treatment. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 2007，5 (2) : 152-159.)。該病的有效治療目前仍然主要為外科手術，而術后復發率高是AE防治的一大難題。因而，在注重早期診斷和治療的同時，加強對泡狀棘球蚴病患者療效的監測、病情轉歸消長的監測以及控制疾病的復發同樣具有重要意義。目前主要使用影像學檢查，以及酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和蛋白質印跡 (Western blotting)等免疫學試驗對AE患者進行診斷和病情監測([2]Brunetti E, Kern P, Vuitton D A. Expert consensus for the diagnosis and treatment of cystic and alveolar echinococcosis in humans [J]. Acta tropica, 2010,114 (I) :1-16)。影像學檢查常使一些非典型和體積較小的病灶與肝癌和肝膿腫等相混淆([3]張寬，王會蘋，黃山， 等.肝泡狀棘球蝴病的CT診斷[J].實用放射學雜志，2011,27(7) :1117-1119)，而免疫學診斷具有快速、敏感、特異和價廉等優點，因此目前被廣泛應用于該病的臨床診斷和流行病學調查。但由于免疫學診斷所用抗原種類和質量等因素的影響，往往缺乏敏感性和特異性， 與細粒棘球絳蟲、豬囊尾蝴及其他寄生蟲的抗原存在交叉反應，因此尋找高度敏感、特異的檢測方法一直是AE診斷及防治的研究熱點。目前運用于診斷的重組抗原多以檢測多抗為主，然而基于多抗的免疫學檢測方法的特異性和敏感性均有待提高([4]Carmena D，Benito A, Eraso E.The immunodiagnosis of Echinococcus multilocularis infection. Clin. Microbiol. Infect,2007，13 :460-475)。寄生蟲循環抗原(circulating antigen, CAg)是指生活蟲體排放到宿主體液內的大分子微粒，主要是排泄分泌物或脫落物中具有抗原特性，并且能被血清免疫學試驗所檢出的物質。由于循環抗體在患者治療后仍能長期存在，故不能區別現癥感染和既往感染，不宜作療效考核之用。一般認為檢測CAg能提示有活動性感染存在，可用于判斷現癥患者及評價療效等，因此CAg成為一種診斷靶抗原。隨著對寄生蟲CAg研究的不斷深入，認識到它在寄生蟲病發生發展和病理生理中的作用和地位，對CAg的研究內容已擴展到消長、轉歸等規律性探索，從而對其在免疫病理和免疫調節機制中的作用有所認識。早期的血清學方法使用多房棘球絳蟲粗提物作為抗原，與其他病原體(如細粒棘球蝴)存在交叉反應，因此假陽性也時有發生。隨著分子生物學技術的普及，將重組抗原應用于多房棘球絳蟲實驗已經越來越多，目前研究比較多的多房棘球絳蟲抗原有EM2、EM4、EM10、EM13、EM16等，采用重組DNA技術制備的重組抗原可以克服多房棘球絳蟲粗提物的缺點，能快速、經濟地制備無限量特異重組多房棘球絳蟲抗原([5]李文桂，陳雅棠.多房棘球絳蟲eml8研究進展[J]. 中國人獸共患病學報ISTIC，2009，25(1) :56-57)。建立一種簡便快捷的試劑來篩查，對AE 患者CAg的檢測不僅可以輔助循環抗原檢測對疾病進行診斷，而且對疾病治療的療效考核和病情監測具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒及制備方法。所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒設有檢測板、金標記抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液，所述檢測板設有載體介質、微孔濾膜、吸水介質、多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點；所述多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點依次設在微孔濾膜上；在多房棘球絳蟲循環抗原檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18，將點樣的微孔濾膜固定于吸水介質上，然后放入載體介質內，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜相對的通孔；所述載體介質包括底板和扣于底板上的蓋板，蓋板上開設有正對微孔濾膜的通孔，以便于加樣。所述載體介質可采用PVC板等。所述微孔濾膜可采用硝酸纖維膜等，所述微孔濾膜的孔徑可為O. I O. 5 μ m。所述吸水介質可采用以纖維素為主要成分的紙等。所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法包括以下步驟I)制備多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18 ；2)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2和EM18的單克隆抗體，具體方法如下(I)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2的單克隆抗體；(2)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM18的單克隆抗體；(3)將抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18 單克隆抗體混合；3)硝酸纖維素膜的點樣在多房棘球絳蟲循環抗原檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18，烘干；4)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，具體方法為取1%氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為O. 01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入I %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存備用；
5)膠體金與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體的標記；6)制備含O. 5% Tween20的10mmol/L pH7. 4磷酸緩沖鹽溶液作為洗滌液；7)制備多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，具體方法如下多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點依次設在微孔濾膜上；在檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18 ;將點樣的微孔濾膜膜固定于吸水介質上、然后放入載體介質內，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜相對的通孔；裝有微孔濾膜的載體介質為檢測板；檢測板、金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液共同組成多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒。在步驟I)中，所述制備多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18的具體方法可為采用基因克隆技術，PCR擴增編碼多房棘球絳蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得多房棘球絳蟲重組抗原EM2和EM18。在步驟2)第(I)部分中，所述制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2的單克隆抗體的具體方法是將重組抗原EM2與等體積弗氏完全佐劑混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾細胞和 SP2/0小鼠骨髓瘤細胞經細胞融合，篩選分泌高滴度抗體的雜交瘤細胞進行擴大培養、凍存；采用有限稀釋法克隆雜交瘤細胞，小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細胞；待小鼠腹部明顯隆起時，采集腹水，離心取上清，無菌過濾，親和層析純化腹水獲EM2單克隆抗體；在步驟2)第(2)部分中，所述制備多房棘球絳蟲重組抗原EM18的單克隆抗體的具體方法是將重組抗原EM18與等體積弗氏完全佐劑混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾細胞和 SP2/0小鼠骨髓瘤細胞經細胞融合，篩選分泌高滴度抗體的雜交瘤細胞進行擴大培養、凍存；采用有限稀釋法克隆雜交瘤細胞，小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細胞；待小鼠腹部明顯隆起時，采集腹水，離心取上清，無菌過濾，親和層析純化腹水獲EM18單克隆抗體；在步驟2)第(3)部分中，所述抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體可按體積比I : (O. 2 5)混合；所述羊抗鼠IgG多克隆抗體的終濃度為I 4mg/mL ;兩者點樣量為I μ L/mm3 ;所述抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體濃度可為I 4mg/mL。在步驟3)中，所述烘干的溫度可為37°C。在步驟4)中，所述檸檬酸三鈉的濃度可為2 %。在步驟5)中，所述膠體金與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體的標記的具體方法如下(I)取膠體金10mL，用O. ImoI/L NaOH調至ρΗ5· 4，加100 μ g抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體，混勻，放置5min,加入5% BSA ImL混勻，4°C、10000r/min離心Ih,棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用PBS稀釋至ImL,得膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體；(2)取膠體金10mL，用O. ImoI/L NaOH調至ρΗ5· 4，加100 μ g抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體，混勻，放置5min，加入5% BSA ImL混勻，4°C、10000r/min離心lh, 棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用PBS稀釋至ImL,得膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體；(3)將膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體混合，所述抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體混合以體積比I : (O. 2 5)混合。本發明采用膠體金免疫滲濾技術建立多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，可用于全血、血清和血漿等標本中多房棘球絳蟲循環抗原的檢測。檢測時，所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
圖I為本發明所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒中檢測板的組裝示意圖。圖2為本發明所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒實施例的結構組成示意圖。圖3為實驗結果模式示意圖。在圖3中，⑴為使用前的示意圖，⑵為無效試驗 (產品質量問題)，(3)多房棘球絳蟲循環抗原陰性，(4)多房棘球絳蟲循環抗原陽性。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。本發明所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒設有載體介質、微孔濾膜、吸水介質、檢測點、對照點、金標記抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液。參見圖I和2，所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒實施例設有檢測板8、金標記抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體9和洗滌液10，所述檢測板8設有載體介質 (包括底板I和扣于底板上的蓋板2)、微孔濾膜5、吸水介質6、多房棘球絳蟲循環抗原檢測點3和對照點4 ;所述多房棘球絳蟲循環抗原檢測點3和對照點4依次設在微孔濾膜5上； 在多房棘球絳蟲循環抗原檢測點3處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點4處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18，將點樣的微孔濾膜5固定于吸水介質6上，然后放入載體介質內，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜5相對的通孔；所述載體介質包括底板I 和扣于底板上的蓋板2，蓋板2上開設有正對微孔濾膜5的通孔，以便于加樣。檢測板8、金標記抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體9和洗滌液10共同構成多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒。 所述載體介質可采用PVC板等。所述微孔濾膜可采用硝酸纖維膜等，所述微孔濾膜的孔徑可為O. I O. 5 μ m。所述吸水介質可采用以纖維素為主要成分的紙等。所述多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法包括以下步驟I)制備多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18采用基因克隆技術，PCR擴增編碼多房棘球絳蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得多房棘球絳蟲重組抗原EM2和EM18。2)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2和EM18的單克隆抗體將重組抗原EM2與等體積弗氏完全佐劑混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾細胞和 SP2/0小鼠骨髓瘤細胞經細胞融合，篩選分泌高滴度抗體的雜交瘤細胞進行擴大培養、凍存。采用有限稀釋法克隆雜交瘤細胞。小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細胞。待小鼠腹部明顯隆起時，采集腹水，離心取上清，無菌過濾，親和層析純化腹水獲EM2單克隆抗體。多房棘球絳蟲重組抗原EM18的單克隆抗體的制備同以上方法。3)硝酸纖維素膜的點樣在檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18，晾干；4)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1%氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入I %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存備用；5)膠體金與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體的標記取膠體金10mL，用O. lmol/L NaOH調至pH5. 4，加100 μ g抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體，混勻，放置5min，加入5% BSA ImL混勻，4°C、10000r/min離心lh,棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用PBS稀釋至 ImL,得膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體；抗多房棘球絳蟲循環抗原HM18的單克隆抗體的制備同以上方法；6)洗滌液制備制備含O. 5% Tween20的10mmol/L pH7. 4磷酸緩沖鹽溶液作為洗滌液；7)制備多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點依次設在微孔濾膜上；在檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18。將點樣的微孔濾膜膜固定于吸水介質上、然后放入載體介質內，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜相對的通孔；裝有微孔濾膜的載體介質為檢測板；檢測板、金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液共同組成多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒。以下給出斑點金免疫滲濾法檢測患者的臨床標本I)平衡向反應孔中滴加I滴洗滌液以平衡檢測膜；2)加樣取待測樣本加入反應孔，以使待測樣本中的抗原與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體結合，并等待液體向下滲濾并被吸水紙吸收；3)洗滌向反應孔中滴加4滴洗滌液，以清晰薄膜，并等待液體向下滲濾并被吸水紙吸收；4)加金標抗體向反應孔中滴加I滴金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體， 使其上的標記物識別抗原，并等待液體向下滲濾并被吸水紙吸收；5)洗滌向反應孔中滴加4滴洗滌液，以清晰薄膜，并等待液體向下滲濾并被吸水紙吸收；結果判斷參見圖3，通過目測讀取試驗結果，只在多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒檢測板對照區有一紫紅色條帶出現，則判為陰性；在檢測區及對照區均有一紫紅色條帶出現，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區和對照區均不出現紫紅色條帶，為無效結果。以下給出多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的性能檢定
I)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現象。2)陽性標本符合率用多房棘球絳蟲陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陰性符合率。陰性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。4)批內差異同一批次多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。5)批間差異不同批次多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。6)干擾試驗檢測結果不受標本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。7)交叉反應采用本多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(η = 30)、類風濕病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系統疾病的檢測， 未發現交叉反應。8)穩定性檢測應用Arrhenius法則,將多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。以下給出具體實施例。實施例I在硝酸纖維膜檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，將點樣的微孔濾膜膜固定于吸水介質上、然后放入載體介質內組裝成檢測板，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜相對的通孔，制備成的膠體金免疫滲濾檢測板，密封室溫保存備用。其中，抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體濃度為lmg/mL， 是將抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體以體積比I : I混合；羊抗鼠IgG多克隆抗體的終濃度為lmg/mL ;兩者點樣量為I μ L/ mm3 ；將膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體濃度為lmg/mL,以體積比I : I混合后，制備成金金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，裝瓶備用。制備含O. 5% Tween20的lOmmol/L pH7. 4磷酸緩沖鹽溶液作為洗滌液，裝瓶備用。膠體金免疫滲濾檢測板、金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液共合組成多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒。向反應孔中滴加I滴洗滌液以平衡檢測膜；取待檢標本血清50 μ L加樣于多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾檢測板加樣區；待液體吸收后，滴加4滴洗滌液；待液體吸收后，向反應孔中滴加I滴金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體；最后再滴加4滴洗滌液后觀察結果。只在多房棘球絳蟲循環抗原檢測板對照區有一紫紅色條帶出現，則判為陰性；在檢測區及對照區均有一紫紅色條帶出現，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區和對照區均不出現紫紅色條帶，為無效結果。實施例2與實施例I相似，區別在于硝酸纖維膜檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體僅由抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體組成，不含有抗多房棘球絳蟲循環抗原 EM18單克隆抗體。結果判斷與實施例I相同。實施例3與實施例I相似，區別在于硝酸纖維膜檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體僅由抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體組成，不含有抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體。結果判斷與實施例I相同。實施例4性能驗證試驗按實施例I的方案制備多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，然后進行性能驗證。I)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現象。2)陽性標本符合率用多房棘球絳蟲陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陰性符合率。陰性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。4)批內差異同一批次多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。5)批間差異不同批次多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。6)干擾試驗檢測結果不受標本溶血(η = 50)、脂血(η = 50)和黃疸(η = 50) 的干擾。7)交叉反應采用本多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(η = 30)、類風濕病(η = 30)、免疫性肝炎(η = 30)等自身免疫系統疾病的檢測， 未發現交叉反應。8)穩定性檢測應用Arrhenius法則，將多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。本發明所制備的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，均可用于全血、 血清和血漿等標本中多房棘球絳蟲循環抗原的檢測，標本用量微小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果。且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
權利要求
1.多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，其特征在于設有檢測板、金標記抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液，所述檢測板設有載體介質、微孔濾膜、吸水介質、 多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點；所述多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點依次設在微孔濾膜上；在多房棘球絳蟲循環抗原檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18，將點樣的微孔濾膜固定于吸水介質上， 然后放入載體介質內，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜相對的通孔；所述載體介質包括底板和扣于底板上的蓋板，蓋板上開設有正對微孔濾膜的通孔。
2.如權利要求I所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，其特征在于所述載體介質采用PVC板；所述微孔濾膜可采用硝酸纖維膜，所述微孔濾膜的孔徑可為O. I O. 5 μ m ;所述吸水介質可采用以纖維素為主要成分的紙。
3.如權利要求I所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18；2)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2和EM18的單克隆抗體，具體方法如下(1)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2的單克隆抗體；(2)制備多房棘球絳蟲重組抗原EM18的單克隆抗體；(3)將抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體混合；3)硝酸纖維素膜的點樣在多房棘球絳蟲循環抗原檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18，烘干；4)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，具體方法為取1%氯金酸ImL加入到 IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為O. 01 %，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入I %檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存備用；5)膠體金與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體的標記；6)制備含O.5% Tween20的lOmmol/L pH7. 4磷酸緩沖鹽溶液作為洗滌液；7)制備多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒，具體方法如下多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點依次設在微孔濾膜上；在檢測點處包被抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體，在對照點處包被多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18 ;將點樣的微孔濾膜膜固定于吸水介質上、然后放入載體介質內，所述載體介質的一側開有與微孔濾膜相對的通孔；裝有微孔濾膜的載體介質為檢測板；檢測板、金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液共同組成多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒。
4.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述制備多房棘球絳蟲抗原EM2和EM18的具體方法為采用基因克隆技術，PCR擴增編碼多房棘球絳蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得多房棘球絳蟲重組抗原EM2和EM18。
5.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)第(I)部分中，所述制備多房棘球絳蟲重組抗原EM2的單克隆抗體的具體方法是將重組抗原EM2與等體積弗氏完全佐劑混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾細胞和 SP2/0小鼠骨髓瘤細胞經細胞融合，篩選分泌高滴度抗體的雜交瘤細胞進行擴大培養、凍存；采用有限稀釋法克隆雜交瘤細胞，小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細胞；待小鼠腹部明顯隆起時，采集腹水，離心取上清，無菌過濾，親和層析純化腹水獲EM2單克隆抗體。
6.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)第(2)部分中，所述制備多房棘球絳蟲重組抗原EM18的單克隆抗體的具體方法是將重組抗原EM18與等體積弗氏完全佐劑混合免疫小鼠，免疫小鼠的脾細胞和 SP2/0小鼠骨髓瘤細胞經細胞融合，篩選分泌高滴度抗體的雜交瘤細胞進行擴大培養、凍存；采用有限稀釋法克隆雜交瘤細胞，小鼠腹腔注射陽性雜交瘤細胞；待小鼠腹部明顯隆起時，采集腹水，離心取上清，無菌過濾，親和層析純化腹水獲EM18單克隆抗體。
7.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)第(3)部分中，所述抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體按體積比I : (O. 2 5)混合。
8.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟2)第(3)部分中，所述羊抗鼠IgG多克隆抗體的終濃度為I 4mg/mL ;兩者點樣量為I μ L/mm3 ;所述抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體濃度為I 4mg/mL。
9.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述烘干的溫度為37°C;在步驟4)中，所述檸檬酸三鈉的濃度可為 2%。
10.如權利要求3所述的多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒的制備方法， 其特征在于在步驟5)中，所述膠體金與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體的標記的具體方法如下(1)取膠體金10mL，用O.lmol/L NaOH調至ρΗ5· 4，加100 μ g抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體，混勻，放置5min,加入5% BSA ImL混勻，4°C、10000r/min離心Ih,棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用PBS稀釋至 ImL,得膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體；(2)取膠體金10mL，用0.lmol/L NaOH調至ρΗ5· 4，加100 μ g抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體，混勻，放置5min，加入5% BSA ImL混勻，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用PBS稀釋至ImL,得膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體；(3)將膠體金標記的抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體混合，所述抗多房棘球絳蟲循環抗原EM2單克隆抗體和抗多房棘球絳蟲循環抗原EM18單克隆抗體混合以體積比I : (0. 2 5)混合。
全文摘要
多房棘球絳蟲循環抗原斑點金免疫滲濾試劑盒及制備方法，涉及一種多房棘球絳蟲循環抗原檢測試劑。試劑盒設有檢測板、金標記抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體和洗滌液，所述檢測板設有載體介質、微孔濾膜、吸水介質、多房棘球絳蟲循環抗原檢測點和對照點。制備多房棘球絳蟲循環抗原；制備抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體；制備膠體金；膠體金與抗多房棘球絳蟲循環抗原的抗體的標記；制備斑點金免疫滲濾試劑盒。可用于全血、血清、血漿等標本中多房棘球絳蟲循環抗原的檢測。檢測時，所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
文檔編號G01N33/577GK102608321SQ20121005122
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者劉凡, 林麗蓉, 石松林 申請人:廈門大學