專利名稱：基于lamp的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物基因檢測方法，尤其涉及一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，適用于微生物定性檢測。
背景技術：
微生物是包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生動物和顯微藻類等在內的一大類生物群體。微生物個體微小，卻與人類生活關系密切，涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及健康、食品、醫藥、工農業和環保等諸多領域。微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行，在人類疾病中有50%是由病毒引起。食品污染嚴重威脅人類身體健康，食源性致病菌是引起細菌性食物中毒的病原體。因此，微生物檢測在人類社會生活中具有極其重要的意義，開發一種快速靈敏的微生物基因檢測方法十分必要。傳統檢測微生物的培養方法，需要分離、篩選和生化鑒定，必要時還需要血清學鑒定，一般為4 6d，費時費力，具有靈敏度低、特異性差、假陽性和耗時費力等缺點。各種常規PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶鏈式反應)方法具有敏感性強、特異性高、簡便和快速等優點，有較多應用于微生物基因檢測的報道，但由于存在PCR 后處理產生污染導致的假陽性等問題以及需要特殊的儀器設備而限制了其在基層單位的應用。近年來發展起來的LAMP (loop-mediated isothermal amplification,環介導等溫擴增技術)以其靈敏度高、速度快和特異性強等優點在基因定性檢測方面得到廣泛應用，并且已經成為當前核酸定性檢測的重要方法之一。LAMP是一種新型的等溫核酸擴增方法，該方法針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物一白色焦磷酸鎂沉淀。該方法具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結果及反應時間短、特異性強和靈敏度高等優因此隳待開發一種精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗方法。
發明內容
本發明的目的就在于克服現有技術存在的缺點和不足，并針對LAMP出現的白色焦磷酸鎂沉淀肉眼難以辨別問題做出改進，提供一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法(簡稱檢測方法)。本發明的目的是這樣實現的基本思路本檢測方法先按照國標法用緩沖蛋白胨水增菌培養待檢樣品，然后利用水煮法提取樣品DNA，接著將提取到的樣品DNA進行恒溫擴增，最后通過熒光顯色法用肉眼直接判斷檢測結果。
具體地說，本檢測方法包括下列步驟①用緩沖蛋白胨水(Buffer Peptone Water簡稱BPW)按照國標法培養待檢樣品 4h ；②用水煮法從待測樣品中提取DNA ；③將DNA加入到LAMP反應體系中，65°C保溫Ih ；④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結果，對樣品進行定性分析；所述LAMP反應體系包括LAMP反應液和熒光顯色劑；a) LAMP 反應液LAMP 反應液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，20 μ mol/L 內引物 FIP、BIP 各 2. O μ 1， 20ymol/L 夕卜引物 F3、Β3 各 I. 0μ l，25mmol/L dNTPs 3. O μ l,50mmol/L MgS043. O μ I,
I.OmoI/L甜菜堿5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I，無菌雙蒸水2. O μ I組成，反應液總體積 22. 5 μ I ；b)熒光顯色劑突光顯色劑是由10 μ mol/L-20mmol/L 的I丐黃綠素 I μ I 和 60 μ mol/L—0· Imol/ LMnCl2 O. 5μ I 組成。本發明的工作原理在本發明提供的LAMP反應體系中含有熒光顯色劑(鈣黃綠素和MnCl2)，在等溫擴增反應之初，鈣黃綠素與熒光淬滅劑MnCl2結合而不發熒光。由于反應生成的焦磷酸根離子更容易與錳離子結合從而釋放了鈣黃綠素，游離的鈣黃綠素就可以自發熒光，在鎂離子存在的條件下，這種熒光效果得到了加強。因此，當使用本發明檢測樣品時，在恒溫條件(65°C 左右)保溫約Ih后，在日光燈下陽性樣本管呈綠色，陰性樣本管呈橙色，在紫外燈下，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光。在本發明中，針對微生物檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應體系，如引物、dNTPs、Mg2+濃度、甜菜堿、鈣黃綠素及MnC12濃度的優化，通過優化方案，反復實驗，建立了本檢測方法，其靈敏度可在每個反應體系中檢出10拷貝，可以滿足快速檢測病源微生物的要求，并且通過熒光顯色判斷的結果與瓊脂糖電泳的結果完全一致。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果I、與傳統培養法相比，檢測速度快，僅5h，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過 6h ；2、特異性好，靈敏度高；3、步驟簡單，可重復性高；4、可同時進行多個樣品檢測。在本發明可對微生物進行定性檢測，并可替代一直沿用的傳統的培養法和血清學檢測方法。
圖I為沙門氏菌紫外燈下觀察結果圖，圖中I-標準陽性模板， 2-陰性對照，3-沙門氏菌陽性樣本，4-沙門氏菌陽性樣本，5-沙門氏菌陽性樣本，6-沙門氏菌陰性樣本，
7-沙門氏菌陰性樣本，8-沙門氏菌陰性樣本；圖2為沙門氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖，圖中I-DNA Marker,2_標準陽性模板， 3_陰性對照，4-沙門氏菌陽性樣本，5-沙門氏菌陽性樣本，6-沙門氏菌陽性樣本，7-沙門氏菌陰性樣本，8-沙門氏菌陰性樣本，9-沙門氏菌陰性樣本；圖3為志賀氏菌紫外燈下觀察結果圖，圖中I-標準陽性模板， 2-陰性對照，3-志賀氏菌陽性樣本，4-志賀氏菌陽性樣本，5-志賀氏菌陽性樣本，6-志賀氏菌陰性樣本，7-志賀氏菌陰性樣本，8-志賀氏菌陰性樣本；圖4為志賀氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖，圖中I-DNA Marker,2_標準陽性模板， 3_陰性對照，4-志賀氏菌陽性樣本,5-志賀氏菌陽性樣本,6-志賀氏菌陽性樣本，7-志賀氏菌陰性樣本，8-志賀氏菌陰性樣本，9-志賀氏菌陰性樣本；圖5為紫外燈下靈敏度實驗觀察圖，圖中I-稀釋10 1倍,2-稀釋10 2倍,3-稀釋10 3倍，4-稀釋10 4倍,5-稀釋10 5倍,6_稀釋10 6倍，7-稀釋10 7倍,8-稀釋10 8倍,9-稀釋10 9倍， ο-稀釋 Kr1。倍；圖6為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測靈敏度實驗結果圖，圖中I-DNA Marker, 2-稀釋 10 1 倍，3_ 稀釋 10 2 倍，4-稀釋10 3倍，5-稀釋10 4倍,6_稀釋10 5倍，7-稀釋10 6倍，8-稀釋10 7倍,9_稀釋10 8倍，10-稀釋 10 9 倍，11-稀釋 10 10 倍。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社， 2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I :反應體系組成a) LAMP 反應液LAMP 反應液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，20 μ mol/L 內引物 FIP、BIP 各 2. O μ 1， 20ymol/L 夕卜引物 F3、Β3 各 I. 0μ l，25mmol/L dNTPs 3. O μ l,50mmol/L MgS043. 0 μ I, I. OmoI/L甜菜堿5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I，無菌雙蒸水2. O μ I組成，反應液總體積 22. 5 μ I0b)突光顯色劑突光顯色劑是由10 μ mo I /T-20mmo1 /I,的隹丐黃綠素 1μ I 和 60 μ mol/L-0· Imo I/ LMnCl2 O. 5μ I 組成。
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實施例2 :利用本檢測方法檢測食品中沙門氏菌a、食物樣品預處理取3種被沙門氏菌污染的食物樣品和3種無污染食物樣本分別稱取25g (mL)放入 6個盛有225mT, BPff的無菌均質杯中，以8000r/min 10000r/min均質Imin 2min,或置于盛有225mL BPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打Imin 2min ;若樣品為液態,不需要均質，振蕩混勻即可；無菌操作將樣品轉至500mL錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養，于36°C ±1°C培養4h ;如為冷凍產品，應在45°C以下不超過15min解凍。b、細菌模板DNA的制備分別取100 μ L細菌培養物，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無菌水，充分混勻，IOCTC水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。C、等溫擴增取1μ I步驟b中樣本上清分別加入到22.5μ I含有沙門氏菌內外引物的 LAMP反應液中，再加入1.5μ I熒光顯色劑，65°C恒溫擴增60min ;同時用標準陽性模板 pMD18-T-invA質粒和無菌雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照。d、結果判定在紫外燈下觀察，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光，取5 μ ILAMP 產物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣本都有條帶，陰性樣本則無條帶(見圖I、圖2)。 圖I為沙門氏菌紫外燈下觀察結果，圖2為沙門氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。e、結論重復試驗3次，所得檢測結果相同，并且通過熒光顯色判斷的結果與瓊脂糖電泳的結果完全一致。說明其不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性，而且依據熒光顯色法判斷結果的方法可靠。①沙門氏菌外引物序列Sal F3 5/ -CGGCCCGATTTTCTCTGG-3'；Sal B3 5/ -CGGCAATAGCGTCACCTT-3'；②沙門氏菌內引物序列Sal FIP 5/ -ATCCGCATCAATAATACCGGCCTTTGGTATGCCCGGTAAACAGA-3'；Sal BIP 5/ -GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA—3'；③標準陽性模板pMD18-T_invA質粒包含沙門氏菌invA基因5' -CCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGG ATGGTATGCCCGGTAMCAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAA-CGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGC TATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTAT-3/ 。實施例3 :利用本檢測方法檢測食品中志賀氏菌a、食物樣品預處理取3種被志賀氏菌污染的食物樣品和3種無污染食物樣本分別稱取25g (mL)樣品放入6個盛有225mT, BPff的無菌均質杯中，以8000r/min 10000r/min均質Imin 2min, 或置于盛有225mL BPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打Imin 2min ;若樣品為液態, 不需要均質，振蕩混勻即可；無菌操作將樣品轉至500mL錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養，于36°C ±1°C培養4h ;如為冷凍產品，應在45°C以下不超過15min解凍。b、細菌模板DNA的制備分別取100 μ L細菌培養物，12000r/min離心2min，去上清，加入50 μ L無菌水，充分混勻，10CTC水浴IOmin, 12000r/min離心2min,上清即為模板DNA。C、等溫擴增取Ιμ 步驟b中樣本上清分別加入到22. 5μ I含有志賀氏菌內外引物的 LAMP反應液中，再加入1.5μ I熒光顯色劑，65°C恒溫擴增60min ;同時用標準陽性模板 pMD18-T-ipaH質粒和無菌雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照。d、結果判定在紫外燈下觀察，陽性樣本管顯示強熒光，陰性樣本管則不顯示熒光；取 5 μ ILAMP產物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性樣本都有條帶，陰性樣本則無條帶(見圖 3、圖4)。圖3為志賀氏菌紫外燈下觀察結果，圖4為志賀氏菌I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。e、結論重復試驗3次，所得檢測結果相同，并且通過熒光顯色判斷的結果與瓊脂糖電泳的結果完全一致；說明其不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重復性，而且依據熒光顯色法判斷結果的方法可靠。①志賀氏菌外引物序列Shi F3 5/ -TCTGGAGGACATTGCCCG-3'；Shi B3 5/ -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'；②志賀氏菌內引物序列Shi FIP 5/ -GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3'；Shi BIP 5/ -TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3/ ；③標準陽性模板pMD18-T_ipaH質粒包含志賀氏菌ipaH基因5 ' -CCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACT CTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGC CGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAA GCCGTGAAGAGAATGA-3'。實施例4 :本檢測方法的靈敏度實驗a、取Iml過夜培養的沙門氏菌培養液做10倍倍比稀釋，稀釋至10_9 ;取每個稀釋度的菌液10 μ 1,12000r/min離心2min,去上清,加入50 μ L無菌水，充分混勻，100°C水浴 IOmin, 12000r/min 離心 2min,上清即為模板 DNA。b、等溫擴展取I μ I步驟a中樣本上清加入到22. 5 μ I含有沙門氏菌內外引物的LAMP反應液中，再加入I. 5μ I熒光顯色劑，65°C恒溫擴增60min ;同時用標準陽性模板 pMD18-T-invA質粒和無菌雙蒸水分別做陽性對照和陰性對照；C、結果判定在紫外燈下觀察，稀釋倍數為KT1-KT8號的樣本管顯示強熒光，稀釋倍數為10_9-10,號的樣本管則不顯示熒光(見圖5);取5 μ I LAMP產物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，稀釋倍數為10-1-10-8號的樣本管都有條帶，稀釋倍數為10-9-10-10號的樣本管則無條帶(見圖6)。圖5為紫外燈下靈敏度實驗觀察圖，圖6為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測靈敏度實驗結果圖。d、結論結果顯示當菌液稀釋至10 8時仍能檢測出，最低檢測極限為50CFU/ ml ο上述實驗說明本發明具有良好的靈敏度。總之，本檢測方法特異性好，靈敏度高，重復性好，操作簡便，結果肉眼可辨，而且對樣品的檢測僅需不到6個小時就能完成，而傳統的培養法約需I周左右才能完成，因此， 使用本檢測方法可以大大縮短檢測時間。本檢測方法的操作只需I人即可完成整個操作過程，一次可檢測多個(由實際檢測需要決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
權利要求
1.一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，其特征在于包括下列步驟①用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國標法培養待檢樣品4h；②用水煮法從待測樣品中提取DNA；③將DNA加入到LAMP反應體系中，65°C保溫Ih；④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結果，對樣品進行定性分析。所述LAMP反應體系包括LAMP反應液和熒光顯色劑；a)LAMP反應液LAMP 反應液由 LAMP IOXbuffer 2. 5 μ 1，20 μ mol/L 內引物 FIP、BIP 各 2. O μ 1， 20ymol/L 夕卜引物 F3、B3 各 I. O μ 1，25mmol/L dNTPs 3. O μ l,50mmol/L MgS043. 0 μ I,I.OmoI/L甜菜堿5 μ 1，Bst DNA聚合酶大片段I. O μ I，無菌雙蒸水2. O μ I組成，反應液總體積 22. 5 μ I ；b)突光顯色劑突光顯色劑是由10 μ mol/L-20mmol/L的I丐黃綠素I μ I和60 μ mol/L-0. Imo I/ LMnCl2O. 5 μ I 組成。
2.按權利要求I所述的一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，其特征在于沙門氏菌外引物序列Sal F3，如SEQ NO. I所示；沙門氏菌外引物序列Sal B3，如SEQ NO. 2所示；沙門氏菌內引物序列Sal FIPjn SEQ NO. 3所示；沙門氏菌內引物序列Sal BIP JBSEQ NO. 4所示;標準陽性模板pMD18-T-invA質粒包含沙門氏菌invA基因，如SEQ NO. 5所示。
3.按權利要求I所述的一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，其特征在于志賀氏菌外引物序列Shi F3，如SEQ NO. 6所示；志賀氏菌外引物序列Shi B3，如SEQ NO. 7所示；志賀氏菌內引物序列Shi FIPJn SEQ NO. 8所示；志賀氏菌內引物序列Shi BIP, SEQ NO. 9所示；標準陽性模板pMD18-T-ipaH質粒包含志賀氏菌ipaH基因，如SEQ NO. 10所示。
全文摘要
本發明公開了一種基于LAMP的微生物目視化熒光顯色基因檢測方法，涉及一種微生物基因檢測方法。本檢測方法是①用緩沖蛋白胨水(BPW)按照國標法培養待檢樣品4h；②用水煮法從待測樣品中提取DNA；③將DNA加入到LAMP反應體系中，65℃保溫1h；④通過與對照組比較，肉眼觀察待測樣品結果，對樣品進行定性分析。本發明與傳統培養法相比，檢測速度快，僅5h，加上樣品DNA的提取制備，總共不超過6h；特異性好，靈敏度高；步驟簡單，可重復性高；可同時進行多個樣品檢測。本發明可對微生物進行定性檢測，并可替代一直沿用的傳統的培養法和血清學檢測方法。
文檔編號G01N21/64GK102586438SQ20121004771
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者盧暄, 王業富, 鄭虎 申請人:武漢大學