專利名稱：一種評測豬飼料消化能的仿生酶法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種仿生酶法，尤其涉及一種評測豬飼料消化能的仿生酶法，屬于飼料消化能的仿生評測領域。
背景技術：
仿生酶法主要是通過模擬動物腸道消化內環境、體外消化吸收營養物質的過程， 能應用于分析測定飼料的消化能。消化能是飼料主要營養指標之一，也是進行飼料配方的主要依據。目前豬飼料消化能值均是通過生物學法獲得，但費時費力費資。隨著對飼料消化能測定方法研究的不斷發現，動物營養學家對體外酶法測定飼料消化能進行了大量研究。 全收糞法測定飼料消化能是比較公較公認的經典測定消化能的方法，但費時、費力，同時， 也有很多因素會影響試驗結果的準確性。仿生酶法通過體外模擬動物胃腸道環境，進行體外營養物質消化率的消化能的測定，雖然省時，省力，但同樣有很多因素影響試驗結果的準確性，例如各階段消化酶的組成，消化酶的活性，酶解溫度與時間等。目前還不能對營養物質的體內消化進行完全的體外模擬，體外消化測定的營養物質消化率和體內法所測值相比還有一定差距。在飼料工業生產中，飼料常規成分分析中飼料養分分析的最大偏差一般要求在3% -5%以下。仿生酶法的精確性是仿生酶法能夠在生產實際進行推廣的前提和基礎。總之，現有的用于評測飼料消化能的仿生酶法均不同程度的存在著精度較低、穩定性和重復性較差等缺陷，不能夠在生產實際中進行推廣應用。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種精度高、穩定性強、 重復性好的評測飼料消化能的仿生酶法。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的一種評測豬飼料消化能的仿生酶法，包括以下步驟(I)將豬飼料粉碎后與緩沖液混合均勻，加入仿生的動物胃液消化酶混合均勻，調整PH值為酸性后進行胃仿生消化， 得到胃仿生消化液；(2)向胃仿生消化液中加入緩沖液，調整pH值后加入仿生的動物小腸消化酶液進行小腸仿生消化，得到小腸仿生消化液；(3)將小腸仿生消化液調整pH值后加入仿生的動物大腸消化酶液進行大腸仿生消化得到大腸仿生消化液；(4)將大腸仿生消化液過濾，測定殘渣重，計算消化能。其中，步驟(I)中所述的緩沖液優選為磷酸鹽緩沖液，進一步優選為pH值為6. O、 濃度為0. 2M的磷酸鹽緩沖液；所述的仿生的動物胃液消化酶為胃蛋白酶；步驟(I)中所述的酸性PH值優選為2. 0 ;所述的消化時間優選為1-6小時，進一步優選為2小時；所述的消化溫度優選為36-40°C，進一步優選為39°C。步驟(2)中所述的緩沖液優選為磷酸鹽緩沖液，更優選為pH值為6. 8、濃度為 0. 2M的磷酸鹽緩沖液；步驟(2)中將胃仿生消化液的pH值調為6. 8后加入仿生的動物小腸消化酶液進行消化。
仿生酶法的關鍵就在于人工消化液的配制，特別是人工小腸消化酶液的配制。為了使人工小腸消化酶液更接近動物體腸道內環境，需要摸索出更接近活體的酶譜。本發明通過試驗發現，動物小腸消化酶液的由胰蛋白酶，糜蛋白酶，淀粉酶和脂肪酶組成時最為接近動物體腸道內環境。本發明通過進一步的試驗發現，動物小腸液主要酶活受到飼料種類，不同能量蛋白及動物個體的影響，酶活性波動極大，將胰蛋白酶，糜蛋白酶，淀粉酶和脂肪酶的酶活控制在以下變化范圍內能夠較好的接近動物體腸道內環境控制胰蛋白酶的酶活變化范圍為21. 24-67. 39U/ml ;控制糜蛋白酶的酶活變化范圍為3. 45-19. 17U/ml ;控制淀粉酶酶活變化范圍為15. 52-251. 43U/ml ;控制脂肪酶酶活變化范圍為0. 021-3. 59U/ ml。本發明通過大量的試驗更進一步的發現，將胰蛋白酶，糜蛋白酶，淀粉酶以及脂肪酶的平均酶活作為體外酶法中人工小腸液的酶活，具有一定的可行性并能更好的模擬體內小腸液的酶活。其中，將胰蛋白酶的平均酶活控制為43. 92±1. 93U/ml、糜蛋白酶的平均酶活控制為6. 89±0. 48U/ml、淀粉酶平均酶活控制為108. 19±9. 01U/ml ;脂肪酶平均酶活控制為 0. 416±0. 12U/ml時，與動物小腸體內小腸液的酶活最為接近。步驟⑵中所述的消化時間優選為2-14小時,進一步優選為4-12小時,最優選為 4小時；所述的消化溫度優選為36-40°C，更優選為39°C。步驟(3)中將小腸仿生消化液中加入EDTA溶液終止酶反應后將pH值調整pH值 4. 8后加入仿生的動物大腸消化酶液進行大腸仿生消化；所述的仿生的動物大腸消化酶液是碳水化合物酶；步驟(3)中所述的消化時間為優選16-22小時，優選為20小時。本發明中所述的消化方式優選為在轉速為60-200轉/min (優選為轉速105轉/ min)的水浴搖床中消化。仿生酶法的精確性是仿生酶法能夠在生產實際進行推廣的前提和基礎。在飼料工業生產中，飼料常規成分分析中飼料養分分析的最大偏差一般要求在3% -5%以下。本試驗通過分別測定了 4種日糧、3種飼料原料的干物質和有機物消化率。結果顯示，原料品和日糧干物質和有機物的消化率變異系數均在2%以下，其中日糧測定結果的精確性要高于原料的測定結果。說明本發明的仿生酶法已達到了在飼料工業中的飼料養分分析的精度要求，具有精度高、穩定性強、重復性好等優點，能夠在生產實際中推廣應用。
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I試驗豬小腸液消化酶活性的周變化。
24種小腸消化液酶活的次數分布圖。
3胃仿生消化階段不同時間段干物質及有機物的消化率。 4小腸仿生消化階段不同時間干物質及有機物的消化率。 5大腸仿生消化階段不同時間干物質及有機物的消化率。 6兩種酶法干物質消化率與生物學法消化能值的相關性。 7兩種酶法有機物消化率與生物學法消化能值的相關性. 8仿生法DE值與生物學法DE值班相關性。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。試驗例I不同飼料營養水平對生長豬小腸消化酶組成活性及緩沖液的影響I. I材料與方法I. I. I試驗動物及飼養管理選取14頭健康的達蘭去勢公豬，在空腸前端安裝瘺管，特術部安全恢復后，從中選取10頭，平均體重為22. 77±0. 89kg，飼養于代謝籠(I. 25X0. 55X0. 8m3)。試驗在農業部飼料效價與安全監督檢驗測試中心(北京)畜禽試驗基地進行。采用全封閉式豬舍。舍內溫度、通風強度、濕度、二氧化碳和氨濃度自動化控制，豬舍溫度恒定為25°C。自由采食和飲水。試驗期間試驗動物及衛生管理按中國農業大學農業部飼料工業中心常規程序進行。1.1.2試驗設計試驗采用5X5(處理X時間)拉丁方設計，每個處理設2個重復，每個重復I頭試驗豬。每個處理隨機飼喂一種試驗日糧，分別為HEHP (高能高蛋白日糧)，HELP (高能低蛋白日糧)，LEHP (低能高蛋白日糧)，LELP (低能低蛋白日糧)，ST (對照日糧)。每個處理每14天隨機飼喂一種日糧，試驗共進行60天，每9天適應期后，分別于第10天、12天、14 天的 9:30-10:30,13:30-14:30,17:30-18:30 通過瘺管收集小腸食糜，按照 Furuya(1979) 的方法制備小腸液，_70°C保存，分別測定腸液中胰蛋白酶，糜蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶活性。 研究在四種極端日糧情況下小腸液消化酶活性的變化規律和變異范圍。I. I. 3試驗日糧試驗日糧設兩個能量水平(3600kcal/kg 3200kcal/kg)，兩個蛋白水平(21 % 13%),以豆油和玉米蛋白粉調制能量蛋白水平。分別為HEHP (高能高蛋白日糧)，HELP (高能低蛋白日糧)，LEHP (低能高蛋白日糧)，LELP (低能低蛋白日糧)，ST (對照日糧)，對照日糧的營養水平參考NRC(1998)豬的營養需要量進行配制，日糧配方和營養水平見表I。
表I日糧組成和營養水平(飼喂基礎)項目日糧 NE levels (Mcal/kg)1對照組ST低能低蛋組高能低蛋組低能高蛋組原料玉米68.558.364.369.141.2豆粕(CP, 45.6%)2530.212.514.8527.6麥麩3.1019.856.822.15豆油03.206.00玉米蚩白粉05.0005.2石粉1.11.01.01.01.0磷酸氫鈣0.850.80.90.80.8食鹽0.450.450.450.450.45頂混料1.01.01.01.01.0合計100.00100.00100.00100.00100.00化學分析值(％) 粗蛋白17.4420.8313.6413.0821.84粗脂肪％2.842.422.657.872.66粗纖維％3.53.094.863.436.4粗灰分％6.25.68.25.99.1有機物％93.894.491.894.190.9總能MJZkg12.6113.3811.9313.3212.46注1預混料為每千克日糧提供維生素A，5，512IU ;維生素D3，2，200IU ;維生素 E，64IU ;維生素 K3，2. 2mg ;維生素 B12，27.6ii g ;核黃素，5. 5mg ;D_ 泛酸，13. 8mg ;煙酸， 30. 3mg ;氯化膽堿，551mg ;猛，401職;鐵，IOOmg ;鋅，IOOmg ;銅，IOOmg ;碘,0. 3mg ;硒,0. 3mg。I. I. 4瘺管安裝部位與過程試驗豬術前禁飼24h，自由飲水。手術室及手術臺0.01%的新潔爾滅噴霧消毒后， 再用紫外燈照射30min。手術器械、T型孌管、以0. 05%新潔爾滅浸泡30min后在以生理鹽水清洗、浸泡。動物術部(劍狀骨至肛門的腹中線兩側寬各3 4cm，長6 8cm)除毛、清潔后， 將動物腹部向上綁定在手術臺上，用碘酊消毒在用75%的酒精棉球脫碘。用0. 3%鹽酸普魯卡因做局部菱形麻醉后，從腹中線中間切開一個長約3cm的縱向切口，切開皮脂層，在沿腹白線依次切開腹壁肌肉層、腹膜層，用鑷子將腹腔內的氣囊膜撥開，即可看到十二指腸， 用腸鉗小心將十二指腸游離段牽出，即可看到空腸，牽出空腸段，注意保護好腸系膜，在空腸中后部找到卵黃囊憩室后，用生理鹽水潤濕所拉出的腸道，然后將十二指腸及其余空腸送回腹腔，在皮膚切口外部僅暴露以卵黃囊憩室為中心的一段長約70mm的空腸段。在卵黃囊憩室附近沿空腸背向腸系膜的一側做一長約12mm的縱向切口，以使套管的槽型部恰好通過。用鑷子輕輕錯開切口，送入套管的槽型部。用4號縫合線沿空腸切口做荷包縫合。用生理鹽水擦拭切口，再沿縫合部位涂上一層用青霉素鉀、硫酸鏈霉素鈉混合粉劑，用生理鹽水潤濕腸道后將裝有套管的空腸送回腹腔并使其自然復位。依次縫合腹膜層、肌肉層和皮脂層，并在每層縫合完成后沿切口涂上青、鏈霉素粉。全部縫合完成后，使套管在動物皮膚創口外露出20mm，套入外墊圈使其貼在皮膚外部，最后塞緊套管塞，手術完成，將鴨放回代謝籠中。荷術鴨放入代謝籠中，禁飼3天，自由飲水。每天口服慶大霉素、補液鹽和葡萄糖 3次(慶大霉素8萬單位、0.9% NaCLUO %葡萄糖，20ml/每次)。每天早晚用碘酊擦拭術部消毒。術后第4、5、6天分別限量飼喂50g、100g、150g日糧，第7天自由采食，第9天術部拆線。北京鴨手術恢復后(術后30天)于瘺管開口處皮脂層縫合一食糜收集裝置。3天后試驗動物即可收集小腸液。I. I. 5樣本瓶的制備與食糜采集方案取體積分別是50ml、80ml，直徑分別是3. IcmA. 2cm,高均是5. 5cm的大小兩只聚丙烯塑料瓶，將大瓶在離瓶口 I. 5cm處縱切，然后將小瓶放入大瓶，兩瓶之間的縫隙處用粘合劑密封。特粘合劑干燥后，用注射器注入自來水，待液面離密封處約0.5cm處停止注射， 再用粘合劑密封注射孔。蓋好小瓶瓶蓋后，放入_20°C冷凍保存以備隔天進行食糜采集。試驗正式開始后，在每個處理的的第10天、12天、14天的9:30-10:30， 13:30-14:30,17:30-18:30通過瘺管收集空腸食糜，樣本瓶收集食糜至瓶身2/3處時停止收集，搖勻后全部轉入50mL離心管中，于4°C條件下1250g離心lOmin。離心結束后取上清液分裝轉入ImL離心管中，-70°C保存。待整個腸液收集試驗結束后，將每個重復內各時間段收集的樣品等體積混合后各取10份、每份0. 5mL小腸液分別裝于I. 5mL離心管中， 于-70°C保存待測(Furuya(1979))。I. I. 6測定指標與方法將待測的食糜上清液在4°C冷水浴中解凍后分析測定胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性和小腸液中相關離子的濃度，其中的胰蛋白酶根據Wirnt(1974b)方法測定，以TAME(Sigma，T4626)為底物，其活性單位(U/mL)定義為在25°C、pH值為8. 10 條件下，每分鐘釋放I U mol對-甲苯磺酰-L-精氨酸所具有的活性。糜蛋白酶根據 Wirnt (1974a)方法測定，BTEE (Sigma, B6125)為底物，其活性單位(U/mL)定義為在 250C、pH值為7. 80條件下，每分鐘釋放I y mol苯甲酰-L-酪氨酸所具有的活性。淀粉酶根據Dahlqvist (1962)方法測定，以可溶性淀粉為底物，其活性單位(U/mL)定義為在25°C、 pH值為6. 90條件下,每分鐘釋放I ii mol麥芽糖所具有的活性。脂肪酶采用英磅Randox公司的脂肪酶試劑盒(L1188)進行測定，脂肪酶活性單位定義為37°C時，pH8. 90下每分鐘水解I微摩爾甘油三脂所具有的活性。K+、Ca2+、Mg2+和Cl—離子濃度分別采用朗道(Randox) NA7167、PT7168、CA2390、MG531 和 CI1645 試劑盒測定。1.1.7統計分析采用SAS 8. 2的GLM模型統計分析蛋白和能量兩因素對胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的影響。多重比較采用Duncan法進行，顯著水平為P < 0. 05。I. 2結果與分析
I. 2. I豬小腸液消化酶活性及離子濃度的周變化節律從試驗期內豬小腸液中淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶的活性隨時間變化來看，除脂肪酶外，采樣時間對小腸液中的三種消化酶有顯著影響(圖I)，在整個試驗周期中，從變異幅度看，淀粉酶變化幅度最大，淀粉酶活性變化范圍為15. 52-251. 43U/ml，平均酶活為108. 19±9.01U/ml。胰蛋白酶活性變化范圍為21. 24-67. 39U/ml，平均酶活為 43. 92 ± I. 93U/ml。胰蛋白酶活性變化范圍為3. 45-19. 17U/ml，平均酶活為6. 89 ±0. 48。脂肪酶活性變化范圍為0. 021-3. 59U/ml，平均酶活為0. 416±0. 12U/ml (表2)。表2試驗豬小腸液消化酶活性的周變化節律
權利要求
1.一種評測豬飼料消化能的仿生酶法，包括以下步驟(1)將豬飼料粉碎后與緩沖液混合均勻，加入仿生的動物胃液消化酶，混合均勻后調整PH值為酸性進行胃仿生消化，得到胃仿生消化液；(2)向胃仿生消化液中加入緩沖液并調整pH值后加入仿生的動物小腸消化酶液進行小腸仿生消化，得到小腸仿生消化液；(3)將小腸仿生消化液調整pH值后加入仿生的動物大腸消化酶液進行大腸仿生消化得到大腸仿生消化液；(4)將大腸仿生消化液過濾，測定殘渣重，計算消化能。
2.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(I)中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，其PH值優選為6. O、其濃度優選為O. 2M ;步驟(I)中所述的酸性pH值為2. O。
3.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(I)中所述的仿生的動物胃液消化酶為胃蛋白酶；步驟(I)中所述的消化時間為1-6小時，優選為2小時；所述的消化溫度為36-40°C，優選為39°C。
4.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(2)中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，其PH值優選為6. 8、其濃度優選為O. 2M。
5.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于將胃仿生消化液的pH值調為6.8后加入仿生的動物小腸消化酶液進行消化。
6.按照權利要求I或5所述的仿生酶法，其特征在于所述的仿生的動物小腸消化酶液由胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶組成；其中，控制胰蛋白酶的平均酶活為43.92 ± I. 93U/ml ;控制糜蛋白酶的平均酶活為6. 89 ±O. 48 U/ml ;控制淀粉酶的平均酶活為108. 19±9· 01 U/ml ;控制脂肪酶的平均酶活為O. 416±0. 12U/ml。
7.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(2)中所述的消化時間為2-14 小時，優選為4-12小時，最優選為4小時；所述的消化溫度為36-40°C，優選為39°C。
8.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(3)中將小腸仿生消化液中加入EDTA溶液終止酶反應后再將其pH值調整為4. 8后加入仿生的動物大腸消化酶液進行大腸仿生消化；所述的仿生的動物大腸消化酶液是碳水化合物酶。
9.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(3)中所述的消化時間為16-22 小時，優選為20小時。
10.按照權利要求I所述的仿生酶法，其特征在于步驟(1)、(2)或(3)中所述的消化方式為在轉速為60-200轉/min的水浴搖床中進行消化；優選的，在轉速105轉/min的水浴搖床中進行消化。
全文摘要
本發明公開了一種評測豬飼料消化能的仿生酶法，該方法包括以下步驟(1)將飼料粉碎后與緩沖液混合，再加入仿生的動物胃液消化酶液,混合均勻后調整pH值為酸性進行胃仿生消化，得到胃仿生消化液；(2)向胃仿生消化液中加入緩沖液、調整pH值后加入仿生的動物小腸消化酶液進行小腸仿生消化，得到小腸仿生消化液；(3)將小腸仿生消化液調整pH值、加入仿生的動物大腸消化酶液進行大腸仿生消化得到大腸仿生消化液；(4)將大腸仿生消化液過濾，測定殘渣重，計算消化能。本發明評測豬飼料消化能的仿生酶法具有精度高、穩定性強和重復性好等優點，能夠在生產實際中進行推廣應用。
文檔編號G01N5/04GK102590017SQ201210042189
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優先權日2012年2月22日
發明者方洛云, 蔣林樹 申請人:北京農學院