專利名稱：一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及薄膜纖維材料的微流控芯片技術領域，特別提供了一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術。
背景技術：
微流控芯片實驗室作為本世紀一項重要的科學技術已經在包括化學、生物學、醫學等多個領域展現了其獨特的優勢，更因其同細胞尺寸匹配、環境同生理環境相近、傳熱傳質快、通量高可以集成等特點而成為新一代細胞研究的重要平臺，隨著近二十年的發展，基于微流控芯片系統的細胞研究已經有所突破，同細胞相關的多種應用型研究已經開始在芯片領域出現，其中細胞分析技術成為其中備受關注的重要分支研究。現有階段的基于微流控芯片的細胞分析平臺大多是利用同生物相容性好的PDMS硅膠材料作為芯片材料，利用軟刻蝕技術形成微通道實現芯片內的細胞培養和各種生物物理、生物化學刺激以便得到在不同細胞外微環境下細胞的行為變化，諸如存活、增殖、凋亡、分化等。隨著微流控芯片制造技術的不斷發展，除了·上述利用PDMS硅膠作為材料的芯片外，利用紙制品、纖維素膜等薄膜纖維材料構建新型的微流控“紙”芯片，因其具有工藝簡單，價格低廉、攜帶方便等多種優勢逐漸成為微流控芯片制造領域的重要研究方面，特別是將其用于更為廣闊的細胞研究成為近期的熱點研究問題之一。而利用該種新型微流控“紙”芯片進行細胞分析還處于空白階段。
發明內容
本發明的目的在于提供一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術。本發明提供了一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，該技術主要包括三個基本方面:第一個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術，第二個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾，第三個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的細胞培養、刺激與分析評價。本發明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，該技術具體說是利用噴蠟打印機在紙、硝酸纖維素膜上進行蠟打印，使其表面形成圖案化微流控通道圖案，經過一系列無菌處理后在其上進行細胞培養，并給予細胞不同藥物配伍的藥物進行刺激，利用細胞學常用的檢測方法對細胞的各種行為進行分析。本發明以噴蠟打印機為主要加工器械，以紙、硝酸纖維素膜為芯片制作材料，利用噴蠟打印的方法在纖維薄膜材料表面形成親疏水性質不同的圖案，并進行細胞培養、藥物刺激、生物學檢測等。該微流控芯片制作方法適用于多種纖維薄膜材料，方法簡單易操作，圖案樣式靈化，制備后的“紙”芯片易于無菌消毒處理，可用于多種細胞的培養與多種藥物的刺激，具有一定的普適性。此外，在細胞試驗過程中，由于微流控芯片本身所具有的特點，還具有細胞及試劑消耗量低等優勢。本發明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，所述薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術為利用噴蠟打印機將圖案印染在選定的薄膜纖維材料上。所述的薄膜纖維材料為打印紙、濾紙、纖維素膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜中的一種或多種。所述的圖案可利用制圖軟件按照預設樣式進行繪圖，可用的制圖軟件為Auto Computer AidedDesign (AutoCAD)、Macromedia Freehands CorelDRAW 中的一種或多種。本發明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，所述薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾中的無菌處理技術包括紫外光照對薄膜材料兩面進行照射消毒、臭氧消毒、根據材料本身性質不同也可進行高壓滅菌。所述薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾中的表面修飾為細胞貼附的薄膜纖維材料可被涂覆修飾，修飾方法為直接浸泡入可用于增加細胞貼附的試劑；其中可用于增加細胞貼附的試劑為以下試劑的一種或多種:一型膠原、二型膠原、四型膠原、層粘蛋白、纖維粘連蛋白、明膠。本發明提供的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，所述薄膜纖維材料微流控芯片的細胞培養、刺激與分析評價為先對進行過表面修飾的薄膜微芯片進行清洗，然后根據所選用的細胞類型采用相應的細胞培養基對薄膜微芯片進行浸泡，最后采用生物學上常用的細胞檢測手段對藥物刺激后的細胞進行檢測。所述清洗所使用的溶液為無菌水、PBS、Hanks溶液中的一種或多種。所述細胞類型為腫瘤細胞、正常細胞、干細胞中的一種。所述細胞培養基為高糖DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養基、低糖DMEM培養基、1640培養基、Alpha-MEM培養基、DMEM/F12培養基中的一種。所述細胞檢測手段包括細胞死活標記染色、免疫熒光染色、PCR檢測、蛋白質檢測。本發明的優點是提供一種新型的基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其操作簡便，成本低廉，試劑及細胞消耗量低，是一種可廣泛用于各種細胞分析的新技術。
圖1為硝酸纖維素膜材料微流控芯片示意圖；圖2為打印紙材料微流控芯片示意圖；圖3為薄膜纖維材料微流控芯片細胞顯微照片，其中，1:ACCM人涎樣囊性癌細胞，2 =GES人正常胃粘膜細胞，3:MSC小鼠骨髓間充質干細胞；圖4為薄膜纖維材料微流控芯片細胞藥物刺激后熒光照片；圖5為薄膜纖維材料微流控芯片間充質干細胞分化圖片，其中，1:成骨ALP染色結果，2:成脂肪Oi1-Red O染色結果。
具體實施例方式按照圖1所示在電腦上用Freehand軟件進行繪圖，利用噴蠟打印機將該圖案打印于硝酸纖維素薄膜上，將該圖案剪裁為22*22毫米大小的方塊并置于無菌6-孔板中，在無菌臺內紫外雙面照射各12小時。用水配制10微克/毫升一型膠原溶液，并將其加入孔板中，使硝酸纖維素膜完全浸泡在其中，放置于37度培養箱中2個小時。用無菌PBS沖洗硝酸纖維素膜三次，靜置。加入2毫升1640培養基于孔板中，使硝酸纖維素膜完全浸沒，置于37度培養箱中備用。取長勢良好的ACCM人涎樣囊性癌細胞進行消化、傳代處理，按照沒孔IX IO5個/mL細胞將其接種 于備用的硝酸纖維素膜上，放入細胞培養箱，待24小時后細胞完全帖附，如圖3所示。換用含有藥物的條件培養基，條件培養基為分別含有O微摩爾每升、I微摩爾每升、5微摩爾每升的放射菌素D，藥物作用24小時后進行細胞死活染色，細胞凋亡染色。采用羅丹明123、DAP1、PI三種物質的染色，分別確定細胞線粒體膜電位、核大小、細胞死亡三種情況，以確定ACCM細胞的凋亡情況，如圖4所示。實施例1利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片，構型如圖1所示。采用一型膠原進行表面修飾后芯片接種ACCM細胞，接種密度I X IO5個/mL，24小時細胞貼壁之后換用含O微摩爾每升、I微摩爾每升、5微摩爾每升的放射菌素D的1640培養基，24小時之后細胞死活、凋亡等方面的相關染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。其結果如圖3所示。實施例2利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片系統，構型如圖2所示。采用層粘蛋白修飾后芯片接種GES，接種密度I X IO5個/mL，24小時細胞貼壁之后換用含O微摩爾每升、
I微摩爾每升、5微摩爾每升的放射菌素D的高糖DMEM培養基，24小時之后對細胞死活、凋亡等方面進行染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。實施例3利用實驗室自行設計并制作的 微流控芯片系統，構型如圖1所示。芯片接種小鼠骨髓間充質干細胞，接種密度I X IO5個/mL，24小時細胞貼壁之后換用多種配伍的LG-DMEM+10%FBS+1 μ M地塞米松+胰島素成脂肪誘導分化培養基，每天換液，7天之后成脂肪Oil Red染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。其結果如圖5所示，間充質干細胞發生了不同情況的成脂肪、成骨分化。實施例4胚胎干細胞:利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片系統，其俯視圖如圖2所示。芯片接種小鼠胚胎干細胞，接種密度I X IO5個/mL，24小時細胞貼壁之后，每天換液，并施加不同時間的多種藥物刺激，分別為有道神經分化、誘導骨分化、誘導脂肪分化的條件誘導分化劑，刺激7天之后可檢測到胚胎干細胞的分化情況，比如成骨分化、成神經分化、成脂肪細胞分化等。
權利要求
1.一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于該技術主要包括三個基本方面第一個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術，第二個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾，第三個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的細胞培養、刺激與分析評價。
2.按照權利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術為利用噴蠟打印機將圖案印染在選定的薄膜纖維材料上。
3.按照權利要求2所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述的薄膜纖維材料為打印紙、濾紙、纖維素膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜中的一種或多種。
4.按照權利要求2所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述的圖案可利用制圖軟件按照預設樣式進行繪圖，可用的制圖軟件為AutoCAD、Freehand、CorelDRAW 中的一種或多種。
5.按照權利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾中的無菌處理技術包括紫外光照射消毒、臭氧消毒、高壓滅菌。
6.按照權利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于 所述薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾中的表面修飾為將薄膜纖維材料直接浸泡入可用于增加細胞貼附的試劑中；其中可用于增加細胞貼附的試劑為以下試劑的一種或多種一型膠原、二型膠原、四型膠原、層粘蛋白、纖維粘連蛋白、明膠。
7.按照權利要求I所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述薄膜纖維材料微流控芯片的細胞培養、刺激與分析評價為先對進行過表面修飾的薄膜微芯片進行清洗，然后根據所選用的細胞類型采用相應的細胞培養基對薄膜微芯片進行浸泡，最后采用生物學上常用的細胞檢測手段對藥物刺激后的細胞進行檢測。
8.按照權利要求7所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述的清洗所使用的溶液為無菌水、PBS、Hanks溶液中的一種或多種。
9.按照權利要求7所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述細胞類型為腫瘤細胞、正常細胞、干細胞中的一種。
10.按照權利要求7所述基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，其特征在于所述細胞檢測手段包括細胞死活標記染色、免疫熒光染色、PCR檢測、蛋白質檢測。
全文摘要
本發明提供了一種基于薄膜纖維材料微流控芯片的細胞分析技術，該技術主要包括三個基本方面第一個基本方面是薄膜纖維材料微流控芯片的制作技術，第二個是薄膜纖維材料微流控芯片的無菌處理技術與表面修飾，第三個是薄膜纖維材料微流控芯片的細胞培養、刺激與分析評價；本發明具有操作簡便，成本低廉，試劑及細胞消耗量低等優點，是一種可廣泛用于各種細胞分析的新技術。
文檔編號G01N33/68GK103255195SQ201210037430
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者秦建華, 高興華, 張敏, 張旭, 馬慧朋 申請人:中國科學院大連化學物理研究所