專利名稱：一種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法
技術領域：
本發明涉及微生物食源性致病菌檢測領域，公開了一種以生物功能化超順磁性納米粒子和免疫化的熒光量子點免疫識別目標微生物，實現特異性檢測食源性致病菌金黃色葡萄球菌的方法。
背景技術：
隨著生活水平的提高，人們越來越重視食品安全的問題。2003 2004年的統計結果顯示，我國食物中毒致病因素依次為微生物性、化學性、有毒動植物性病原。微生物性病原是導致食物中毒的主要因素，中毒人數最多。因此，快速而準確地檢測與鑒定食品中的病原菌是及時有效控制和預防病原細菌傳播、預防食物中毒的重要前提。金黃色葡萄球菌是一群常堆積成葡萄串狀，革蘭氏陽性球菌，無芽孢、無鞭毛，不能運動，大多數無莢膜。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環境中，是公共場所的一種主要病原菌。金黃色葡萄球菌是污染食品和引起食物中毒的主要病原菌，也是引起化膿性炎性反應、敗血癥及膿毒血癥的病原菌，同時也是檢測醫院消毒效果和醫源性感染的一個重要指標。在歷年食物中毒調查中.該菌占整個細菌性食物中毒的第一位或第二位。目前，國內檢測食品中金黃色葡萄球菌仍采用傳統的方法，傳統的細菌學培養方法需經富集培養、選擇性分離、形態特征觀察、生理生化反應、血清學鑒定等過程，操作繁瑣復雜、耗時費力，而且無法對人工難以培養的病原菌進行檢測。近年來，隨著生物學技術的迅速發展，出現了很多適合于食源性細菌檢測和分析的分子生物學方法和免疫學方法。這些方法具有操作簡便、快速、靈敏度高和特異性強等特點，通常只需要24 48h就可以獲得檢測結果。常用的免疫學方法主要包括ELISA、免疫膠體金技術等；分子生物學方法則主要有依賴PCR的DNA指紋圖譜技術、多重PCR、基因芯片、定量PCR和實時熒光定量PCR等技術。這些方法雖然提高了檢測的靈敏度，大大縮短了檢測時間，但是都存在一定的缺陷。例如ELISA對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分；對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應；分析分子量很小的化合物或很不穩定的化合物有一定的困難。在致病菌的分子生物學檢測方法方面，由于檢樣中存在死的致病菌、特異性DNA或RNA片段存在同源性和檢樣中存在不可培養微生物的情況等問題，常常造成PCR檢測結果與常規方法相比，陽性率變高的現象，除存在不可培養微生物的情況外，均屬于假陽性范疇。免疫磁性分離技術是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發生特異性的結合，載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術代替了常規的選擇性增菌培養過程，可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA) 是致病性金黃色葡萄球菌細胞表面一種特有的蛋白質，它具有與人IgG的Fe片段特異性結合的能力，每個SPA分子可以同時結合2個人IgG分子，因此，可用來建立一種致病性金黃色葡萄球菌快速分離檢驗的體系。
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為了食品安全，為了尋求更簡便、快速、靈敏的食源性致病菌金黃色葡萄球菌的檢測方法，研發了一種特異性磁性分離熒光標記定性定量檢測金黃色葡萄球菌的方法。
發明內容
本發明旨在提供一種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法。這種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，包括如下步驟(I)免疫化的超順磁納米粒子加入到待測樣品，30 40°C混合反應20 60min， 使免疫化的超順磁納米粒子與金黃色葡萄球菌發生特異性結合；(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化的超順磁納米粒子，用磷酸緩沖液洗滌后加入免疫化的熒光量子點，30 40°C混合反應20 60min，使量子點和吸附在免疫化超順磁納米粒子的致病微生物金黃色葡萄球菌發生特異性結合；(3)利用外加磁場收集免疫化超順磁納米粒子，用磷酸緩沖液洗滌后定性或定量熒光檢測；所述的免疫化超順磁納米粒子為表面偶聯人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化熒光量子點為與人免疫球蛋白IgG連接的量子點。所述免疫化超順磁納米粒子為以四氧化三鐵納米粒子為核心，醛基化修飾，表面偶聯人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化熒光量子點為與人免疫球蛋白IgG連接的量子點。步驟(2)和(3)所述的外加磁場為2000 6500Gs。所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟(I)醛基化磁珠的制備將以四氧化三鐵為核心的納米磁珠與聚乙二醇混合，加入介質乙醇/雙蒸水，再依次加入丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和過氧化苯甲酰，攪拌20 60min ;溫度升至60 70度，反應8 12h，洗滌，用磁場分離，獲得了醛基功能化的磁珠；其中四氧化三鐵為核心的納米磁珠與聚乙二醇、丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和過氧化苯甲酰的重量比為I : 80 150 10 20 200 300 80 120。(2)連接抗體人類免疫球蛋白IgG溶在磷酸緩沖溶液中，加到步驟⑴中制得的醛基化磁珠中，4°C輕搖2.5小時。(IgG與醛基化磁珠的質量比為I : 8 20，優選為 I 8 10)。多余的抗體用磁性分離器分離，用PBS清洗2 5次；懸浮在相同的緩沖液中，4°C保存。所述免疫化熒光量子點的制備方法包括如下步驟(A)將pH 7. 25 7. 5、含有交聯劑的磷酸緩沖液與表面修飾有羧基的量子點混合，反應5 20min以活化羧基；交聯劑優選為1_乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，反應時交聯劑的濃度為10 50mg/mL ；(B)加入保護劑反應20 60min ;保護劑優選為N-羥基硫代琥珀酰亞胺，濃度為 5mg/mL 至 20mg/mL ；(C)加入人類免疫球蛋白IgG混合，反應0. 5 4hr，除去未反應的人類免疫球蛋白IgG，收集免疫化熒光量子點；所述人類免疫球蛋白IgG與量子點的用量比為20 40g/mol。半導體量子點，簡稱為量子點(quantum dots)，通常由周期表II-VI或III-V族元素合成的半導體材料，正是由于量子點的超微尺寸，半徑從10 lOOnm，這個物理尺寸決定了它們的量子效應，使其具有獨特的性質。相對于有機熒光基團，QDs具有獨特的光學和電子性能，量子點的激發光譜寬而且呈連續連續分布，同時熒光發射光譜的半寬峰高(FWHM) 窄且對稱分布，典型的半寬峰高為30nm，此外，量子點與熒光染料相比，激發和發射光譜之間的斯托克斯位移大，有利于熒光信號的檢測。同時量子點的熒光發射波長可充分利用其量子效應通過控制其合成時的直徑大小和材料組分來進行連續調諧，因此合成不同直徑大小的量子點就能獲得多種可以辨別的不同顏色熒光，使其熒光發射范圍從可見光至紅外波長，此外，量子點還具有非常好的量子產額、好的耐光漂白的穩定性以及長的熒光壽命的優點。這些性質為熒光成像、熒光檢測以及超靈敏生物鑒定和診斷提供了新的可能性。致病性金黃色葡萄球菌細胞表面一種特有的蛋白質金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA) 能夠與人IgG的Fe片段特異性結合，每個SPA分子可以同時結合2個人IgG分子，與IgG 偶聯的納米磁珠能與樣品中被檢微生物食源性致病菌金黃色葡萄球菌發生特異性結合。連有食源性致病菌金黃色葡萄球菌的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集，利用外加磁場(2000 6500Gs)吸附收集上述磁性粒子,棄去檢樣混合液；在此基礎上，將偶聯有人IgG的熒光量子點加入到濃集后的反應體系中，使之與連有磁性顆粒的食源性致病菌金黃色葡萄球菌發生特異性結合。提供外加磁場，被載于磁性顆粒并且偶聯有突光量子點的目標微生物金黃色葡萄球菌向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，利用外加磁場(2000 6500GS)吸附磁性粒子收集磁性粒子，可進行熒光定性定量檢測。若樣品中含有金黃色葡萄球菌，通過上述方法，可將免疫化的熒光量子點(間接)連接到免疫化超順磁納米粒子，經過磁性收集，進行熒光檢測(復合物結構免疫量子點-金黃色葡萄球菌-免疫磁珠)。本發明方法不僅能夠從各種樣本中迅速分離目標菌，同時加以高效富集，且富集分離后的細菌經快速的熒光標記，既能通過熒光顯微鏡定性鑒定，又能被熒光分光光度計定量的檢測。整個檢測過程僅需2個小時，操作方便、簡單，可靠性好，對配套設備要求低。
圖I為醛基化磁珠與IgG的連接示意圖。圖2為免疫量子點-金黃色葡萄球菌-免疫磁珠復合物在可見光(A)和紫外光激發⑶下的照片。圖3為金黃色葡萄球菌濃度(X)與熒光吸收(y)的線性關系
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明實施例I免疫化超順磁性納米磁珠的制備I、醛基化超順磁性納米磁珠的制備將以四氧化三鐵為磁核的磁珠0. 06g和6. Og聚乙二醇混合,加到6mL的雙蒸水中，分散30分鐘。混合液室溫下移到搖瓶中，連續攪拌。115mL的分散介質乙醇/雙蒸水 (V V = 3 2)加到瓶中。8mL(0. 68g)丙烯醛，15mL(13. 5g)苯乙烯，0. 3mL(0. 28g) 二乙烯苯，6. Og過氧化苯甲酰依次加入，攪拌30min。溫度升至65°C，反應持續10h，可以獲得淺棕色乳液。用0. IM的鹽酸和雙蒸水洗幾次，磁場分離。獲得了醛基功能化的磁珠。2、醛基化磁珠和人免疫球蛋白IgG的連接Img人類IgG (溶在PH7. 2,0. 01mol/l的磷酸緩沖溶液中)加到2mL醛基化磁珠中 (5mg/mL)，4°C輕搖2. 5小時。多余的抗體用磁性分離器分離，用PBS(PH6. 0,0. Olmol/1，含 0. 1% BSA)清洗3次。收集到的產物懸浮在相同的緩沖液中，4°C保存。實施例2熒光量子點與人免疫球蛋白IgG的連接將I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC HCL)作為交聯劑， N-羥基丁二酰亞胺(NHS)作為保護劑，將表面修飾有羧基的量子點(QDs-COOH)與抗體 (Ab)上的末端氨基交聯反應生成酰胺鍵，得到免疫化的量子點。抗體與量子點的摩爾比為 I : 10 至 I : 30。具體做法為60ul (7. 8*10_6mol) QDs (發紅光)原液加入到磷酸緩沖溶液 PBS (0. 01mol/L, pH 7. 2)和6mg EDC HCL (最終濃度為20mg/mL)的混合液中，混合液室溫下渦旋5min，再反應15-20min以便讓QDs上的自由羧基完全活化；同樣的，I. 5mg NHS (最終濃度為5mg/mL)加入到上面的混合液中，室溫潤旋15min,反應60min,在這步中，QDs上的自由羧基和NHS上的羥基酯化反應生成半穩定的具有胺活性的NHS(羥基丁二酰胺)-酯。 接下來120ul抗體(2mg/ml)加到體系中，渦旋至少2h，沒反應的抗體分子最后通過超濾濃縮離心管去除掉，QDs和抗體通過強烈的共價鍵結合在一起，最后收集產品，0 4°C保存。實施例3樣品的檢測檢測的原理如圖I所示。將實施例I制得的免疫化的超順磁性納米磁珠分散在磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L,pH=7. 2)中(濃度為mg/ml，分別取用50 y L的免疫磁珠滴入3mL 不同濃度(105cfu/mL, 104cfu/mL, 103cfu/mL, 102cfu/mL, lOcfu/mL)的金黃色葡萄球菌菌液樣品液中。室溫搖床振蕩充分反應0. 5h，在外加磁場的作用下，用磷酸鹽緩沖液(0. Olmol/ L，pH 7. 2)洗滌2 3次，定容至0. 2mL體系，得到“磁珠-沙門氏菌”復合物。然后向洗滌后的體系中分別滴加50uL實施例2中制備的的免疫化的量子點，在室溫搖床下振蕩0. 5h，使金黃色葡萄球菌表面上的抗原與量子點上連接的IgG抗體充分免疫結合，在外加磁場的作用下，用磷酸鹽緩沖液(0. 01mol/L，pH 7. 2)洗滌3 4次，目的是去除未結合的免疫量子點，最終分別用600ul的PBS懸浮。采用配有數碼CCD相機(Olympus， DP70)的熒光顯微鏡(Olympus，BX51)對上述各100 y L的體系進行暗場(熒光)與明場 (日光)觀察。具體步驟如下，將上述600 ii L的體系，先渦流2min混合均勻，取15 ii L滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，觀察體系中結合物。熒光光度計測定其FIs。圖2為免疫量子點-金黃色葡萄球菌-免疫磁珠復合物在可見光(A)和紫外光激發⑶下的照片。結果判定與報告結果判定結合發熒光菌體的形態、熒光亮度與菌量綜合判定。陽性及可疑陽性結果菌體紅色熒光亮度為+，菌體形態特征符合金黃色葡萄球菌,且多數視野中均能檢出數個菌體。陰性結果無紅色熒光，或菌形模糊，為陰性。報告方法量子點突光鏡檢結果為陰性報告為“未檢出金黃色葡萄球菌”。
量子點熒光鏡檢結果為陽性或可疑陽性結果結果記錄中出現陽性或可疑陽性結果，均應按依照國家標準對陽性結果及可疑陽性結果進行培養法檢查，并根據培養法檢查結果做報告。圖3為金黃色葡萄球菌濃度(X)與熒光吸收(y)的線性關系。從圖中可以看出，被免疫磁珠分離出的金黃色葡萄球菌可被免疫量子點特異性結合。經熒光分光光度計檢測，OD值與菌濃度成正比。現階段檢測限大約在102Cfu/ml左右。
權利要求
1.一種快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)免疫化的超順磁納米粒子加入到待測樣品，30 40°C混合反應20 60min，使免疫化的超順磁納米粒子與金黃色葡萄球菌發生特異性結合；(2)外加磁場，在外加磁場吸引作用下，收集免疫化的超順磁納米粒子，洗滌后加入免疫化的熒光量子點，30 40°C混合反應20 60min，使量子點和吸附在免疫化超順磁納米粒子表面的金黃色葡萄球菌發生特異性結合；(3)利用外加磁場收集免疫化超順磁納米粒子，洗滌后定性或定量熒光檢測；所述的免疫化超順磁納米粒子為表面偶聯人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化熒光量子點為與人免疫球蛋白IgG連接的量子點。
2.權利要求I所述速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述的免疫化超順磁納米粒子的制備方法包括以下步驟(1)醛基化磁珠的制備將以四氧化三鐵為核心的納米磁珠與聚乙二醇混合，加入體積濃度為60% 70%的乙醇水溶液，再依次加入丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和過氧化苯甲酰，攪拌30min ;60 70度下反應9 12h,洗漆,用磁場分離,收集固體,獲得醒基化磁珠；(2)、連接抗體步驟(I)中制得的醛基化磁珠中加入含有人免疫球蛋白IgG的磷酸緩沖溶液，2 6°C振蕩2 4小時；IgG與醛基化磁珠的質量比為I : 8 20;取固體洗滌。
3.權利要求2所述速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，四氧化三鐵為核心的納米磁珠與聚乙二醇、丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和過氧化苯甲酰的重量比為I : 80 150 10 20 200 300 80 120 ;IgG與醛基化磁珠的質量比為I : 8 10。
4.權利要求I所述速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述的免疫化熒光量子點的制備方法包括以下步驟(A)將pH7. 25 7. 5、含有交聯劑的磷酸緩沖液與表面修飾有羧基的量子點混合，反應5 20min以活化羧基；反應時交聯劑的濃度為10 50mg/mL ；(B)加入保護劑反應20 60min;保護劑濃度為5mg/mL至20mg/mL ；(C)加入人類免疫球蛋白IgG混合，反應0.5 4hr，除去未反應的人類免疫球蛋白 IgG,收集免疫化熒光量子點。
5.權利要求4所述速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述人類免疫球蛋白IgG與量子點的用量比為20 40g/mol。
6.權利要求4所述速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述交聯劑為 I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，保護劑為N-羥基硫代琥珀酰亞胺。
7.權利要求4所述速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，其特征在于，步驟(2)和(3)所述的外加磁場為2000 6500Gs。
全文摘要
本發明涉及微生物食源性致病菌檢測領域，公開了快速檢測篩選金黃色葡萄球菌的方法，以生物功能化超順磁性納米粒子和免疫化的熒光量子點免疫識別目標微生物，實現特異性檢測食源性致病菌金黃色葡萄球菌。本方法不僅能夠從各種樣本中迅速分離目標菌，同時加以高效富集，且富集分離后的細菌經快速的熒光標記，既能通過熒光顯微鏡定性鑒定，又能被熒光分光光度計定量的檢測；操作方便、簡單，可靠性好，對配套設備要求低。
文檔編號G01N33/569GK102590506SQ201210035468
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者趙渝, 陳艷, 顧鳴 申請人:上海師范大學