專利名稱：麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層析技術制作的一種麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
麥角乙二胺(LSD)是已知藥力最強的致幻劑，極易為人體吸收。服用后會產生幻視、幻聽和幻覺，出現驚惶失措、思想迷亂、疑神疑鬼、焦慮不安、行為失控和完全無助的精神錯亂的癥狀。同時會導致失去方向感、辨別距離和時間的能力，因而導致身體嚴懲受傷和死亡。目前有關麥角乙二胺的檢測方法有很多，例如高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)等方法，但是存在需要昂貴的儀器設備，對檢測材料的要求高，需要提純處理等限制。因此研究具有快速、便攜等優點的檢測方法具有現實意義。本發明介紹了一種以膠體金免疫層析法快速檢測麥角乙二胺的檢測試劑盒及其制備方法，該方法具有簡單、快速，無需任何儀器設備，經濟實用等特點，適用于快速定性檢測樣本中是否含有麥角乙二胺。
發明內容
本發明的目的在于提供一種便攜、快速，適合于現場檢測麥角乙二胺的檢測試劑盒及其制備方法。一種用于檢測麥角乙二胺的檢測試劑盒，包括樣品墊(I)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的麥角乙二胺單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(T線)和質控線(C線)，其中檢測線(T線)上包被了麥角乙二胺-BSA偶聯抗原，質控線(C線)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述吸樣墊為吸水紙。本發明采用納米膠體金技術及抗原抗體特異性反應，應用免疫競爭抑制反應的原理制備而成，通過待檢樣本中含有的麥角乙二胺與硝酸纖維素膜上檢測線(T線)包被的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原競爭結合膠體金標記的麥角乙二胺單克隆抗體，通過T線的顯色來判定待檢樣本中是否含有麥角乙二胺。本發明提供了一種麥角乙二胺檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟(I)制備麥角乙二胺偶聯抗原將麥角乙二胺與BSA偶聯，合成麥角乙二胺-BSA偶聯抗原，作為麥角乙二胺偶聯抗原。(2)制備麥角乙二胺單克隆抗體采用麥角乙二胺-BSA偶聯抗原為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗麥角乙二胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化,獲得麥角乙二胺單克隆抗體。(3)制備膠體金取90ml純化水于潔凈的圓底燒瓶中，于電磁加熱套中攪拌并加熱，等待沸騰后，加入4ml I %的氯化金溶液,繼續攪拌lmin,迅速加入6ml I %的朽1檬酸三鈉,溶液顏色由淺黃變成黑色最后變成酒紅色，繼續加熱5min，取出冷卻到室溫，常溫避光保存。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。(4)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用O. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調至7. 0-9. 0，室溫放置10分鐘；在上述溶液中加入麥角乙二胺單克隆抗體，使麥角乙二胺單克隆抗體的濃度為20-80 μ g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入10%的BSA溶液使其濃度為10-60 μ Ι/ml，混合均勻，室溫放置10分鐘；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30 % -100 %初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到麥角乙二胺單克隆抗體-膠體金標記物；將麥角乙二胺單克隆抗體-膠體金標記物按ImL鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥24±2小時，制成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含O. 01-0. I %的Tris，1.0-3.0%的蔗糖、O. 1-1.0%的BSA的O. 02M pH 7. 0-9. O的磷酸鹽緩沖溶液。(4)包被麥角乙二胺-BSA偶聯抗原、羊抗鼠IgG多克隆抗體設定劃膜儀涂覆參數I μ L/cm,分別用微量進樣器取濃度為I. 0-5. Omg/ml的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原、取濃度為O. 5-3. Omg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆麥角乙二胺-BSA偶聯抗原(T線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥24±2小時，保存，備用。(5)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于O. OlM pH 7. 0-8. O的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含O. 5-1. 5% BSA, O. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用(6)組裝試劑盒在PVC支撐板上按順序依次粘附樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，得到所述用于檢測麥角乙二胺的試紙條，試紙條可以裝入塑料卡內，組裝成檢測卡。其中所述樣品墊為玻璃纖維，吸樣墊為吸水紙。本發明所述試劑盒的檢測方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出麥角乙二胺檢測裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，10-15分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。本發明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術測定麥角乙二胺，檢測時，將被測樣品加在試劑盒上的樣品墊上，可以直接觀察到免疫反應的結果，完成樣品檢測。本發明可用于檢測樣本中可能存在的麥角乙二胺，具有使用方便、操作簡單、反應迅速、經濟實用等特點。
圖I麥角乙二胺檢測試劑盒結構示意圖；附圖符號說明I :樣品墊；2 :膠體金墊(膠體金標記麥角乙二胺單克隆抗體的聚酯膜)3 :硝酸纖維素膜(T :包被了麥角乙二胺-BSA偶聯抗原的檢測線；C :包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體的質控線)；4 :吸樣墊；5:PVC 支撐板；圖2本發明試劑盒的檢測結果示意圖。自左至右依次為C線一條線陽性檢測結果；T、C兩條線陰性檢測結果；無效。
具體實施例方式實施例I :麥角乙二胺檢測試劑盒的制備I.制備麥角乙二胺偶聯抗原將麥角乙二胺與BSA偶聯，合成麥角乙二胺-BSA偶聯抗原，作為麥角乙二胺偶聯抗原。2.制備麥角乙二胺單克隆抗體采用麥角乙二胺-BSA偶聯抗原為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗麥角乙二胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進行純化,獲得麥角乙二胺單克隆抗體。3.制備膠體金取90ml純化水于潔凈的圓底燒瓶中，于電磁加熱套中攪拌并加熱，等待沸騰后，加入4ml I %的氯化金溶液,繼續攪拌lmin,迅速加入6ml I %的朽1檬酸三鈉,溶液顏色由淺黃變成黑色最后變成酒紅色，繼續加熱5min，取出冷卻到室溫，常溫避光保存。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。4.制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，加入O. 15ml的O. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調至8. 0，室溫放置10分鐘；在上述溶液中加入52. 6 μ I濃度為3. 8mg/ml的麥角乙二胺單克隆抗體，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入O. 15ml 10%的BSA溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30% -100%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到麥角乙二胺單克隆抗體-膠體金標記物；將麥角乙二胺單克隆抗體-膠體金標記物按ImL鋪50cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥24小時，制成膠體金墊。上述膠體金復溶液為含O. 01%的Tris，2.0%的蔗糖、O. 5%的BSA的(λ 02M pH
8.O的磷酸鹽緩沖溶液。(4)包被麥角乙二胺-BSA偶聯抗原、羊抗鼠IgG多克隆抗體
設定劃膜儀涂覆參數I μ L/cm,分別用微量進樣器取濃度為2. 5mg/ml的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原、取濃度為I. Omg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆麥角乙二胺-BSA偶聯抗原(T線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥24小時，保存，備用。(5)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于50ml O. OlM pH 8. O的磷酸鹽緩沖溶液處理液中30min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含I. 0% BSA, O. 5% Tweeen-2，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用(6)組裝試劑盒在PVC支撐板上按順序依次粘附樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，得到所述用于檢測麥角乙二胺的試紙條，試紙條可以裝入塑料卡內，組裝成檢測卡。其中所述樣品墊為玻璃纖維，吸樣墊為吸水紙。實施例2 :麥角乙二胺檢測試劑盒的檢測I.檢測方法取出麥角乙二胺檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘后觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。2.結果判定 陽性T線不顯色，僅C線顯色，判定為陽性結果；陰性Τ線、C線均顯色，判定為陰性結果；無效C線不顯色，說明不正確操作或試劑盒已經變質損壞。檢測樣品時，樣品因毛細管作用向吸樣墊一端層析。若被測樣品中含有麥角乙二胺，它們將和檢測線(T線)上包被的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原競爭結合膠體金標記的麥角乙二胺單克隆抗體上有限的抗體結合位點，當樣品中的麥角乙二胺達到一定濃度時，與膠體金標記的麥角乙二胺單克隆抗體發生免疫反應并完全飽和，此時膠體金復合物已無空余的位點和檢測線上包被的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原結合，此時T線不顯色，此為陽性結果。若被測樣品中不含麥角乙二胺，標記了麥角乙二胺單克隆抗體的膠體金顆粒將隨同樣品層析至T線位置后，與T線上包被的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原發生免疫結合反應，膠體金顆粒在T線位置堆積使得T線呈現出一條肉眼可見的紅色條帶，此為陰性結果。無論被測樣品中是否含有麥角乙二胺，膠體金標記物均會與包被在質控線(C線)上的羊抗鼠IgG多克隆抗體結合而顯色，C線顯色是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為試劑的內控標準。
權利要求
1.一種麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊緊密粘附在PVC支撐板上；所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標記的麥角乙二胺單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被了麥角乙二胺-BSA偶聯抗原作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質控線(C線)；所述吸樣墊為吸水紙。
2.—種權利要求I所述的麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的麥角乙二胺單克隆抗體由麥角乙二胺-BSA偶聯抗原作為免疫原免疫BALB/C小鼠獲得。
3.—種權利要求I所述的麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金的制備方法為取90ml純化水于潔凈的圓底燒瓶中，于電磁加熱套中攪拌并加熱，等待沸騰后，加入4ml I %的氯化金溶液，繼續攪拌lmin，迅速加入6ml I %的檸檬酸三鈉，溶液顏色由淺黃變成黑色最后變成酒紅色，繼續加熱5min，取出冷卻到室溫，常溫避光保存。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。
4.一種權利要求I所述的麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用O. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調至7. 0-9. O,室溫放置10分鐘；在上述溶液中加入麥角乙二胺單克隆抗體，使麥角乙二胺單克隆抗體的濃度為20-80 μ g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入10 %的BSA溶液使其濃度為10-60 μ I/ml，混合均勻，室溫放置10分鐘；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解；12000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30% -100%初始膠體金體積的膠體金復溶液溶解，得到麥角乙二胺單克隆抗體-膠體金標記物；將麥角乙二胺單克隆抗體-膠體金標記物按ImL鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥24±2小時，制成膠體金墊。
5.一種權利要求I及權利要求5所述的麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金復溶液為含O. 01-0. 1%的Tris，I. 0-3. O %的蔗糖、O. 1-1. 0%的BSA的O. 02M pH 7. 0-9. O的磷酸鹽緩沖溶液。
6.一種權利要求I所述的麥角乙二胺檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上的兩條線的包被方法為設定劃膜儀涂覆參數I μ L/cm,分別用微量進樣器取濃度為I. 0-5. Omg/ml的麥角乙二胺-BSA偶聯抗原、取濃度為O. 5-3. Omg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆麥角乙二胺-BSA偶聯抗原(T線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥24±2小時，保存，備用。
全文摘要
一種用于檢測麥角乙二胺的檢測試劑盒，該試劑盒包括樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)，在PVC支撐板上依次連續粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，所述膠體金墊為膠體金標記的麥角乙二胺單克隆抗體聚酯膜，所述硝酸纖維素膜上依次包被了麥角乙二胺-BSA偶聯抗原作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質控線(C線)。本發明采用膠體金免疫層析技術制備麥角乙二胺檢測試劑盒，用于檢測樣本中可能存在的麥角乙二胺，本試劑盒制備方法簡單，具有使用方便、反應迅速、經濟實用等特點。
文檔編號G01N33/558GK102937647SQ201210034598
公開日2013年2月20日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者陳立柱, 楊利 申請人:北京寶瑞源科技孵化有限公司