專利名稱：抗腸道病毒71型衣殼蛋白1 IgM AlphaLISA檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腸道病毒71型的免疫學檢測，具體地說，涉及抗腸道病毒71型衣殼蛋白I IgM AlphaLISA檢測試劑盒。
背景技術：
腸道病毒71型(EV71)是感染嬰幼兒手足口病(HFMD)的主要病原。EV71感染后導致的癥狀包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎以及脊髓灰質炎樣的麻痹。該病的主要特征是短時間內(nèi)的高死亡率。由于沒有有效的針對EV71的抗病毒治療方法，目前防治手足口病的措施主要是依賴于對該病的快速診斷和及時阻止病毒的流行，試驗室診斷EV71主要依靠基于病毒基因組的反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及病毒分離試驗，但是，這些方法在大部分基層診所和醫(yī)院很難得到完全的應用。IgM抗體在感染EV71的早期以及后期暴露的患者血清中經(jīng)常反復出現(xiàn)，因此，我們可以通過檢測抗EV71的IgM來建立診斷手足口病的診斷方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗腸道病毒71型衣殼蛋白I IgMAlphaLISA檢測試劑盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種抗腸道病毒71型衣殼蛋白IIgM AlphaLISA 檢測試劑盒，其包括供體微珠、受體微珠及生物素化的腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原；其中，所述供體微珠包被有含25mMHEPES、IOOmM NaCl和O. 05% Proclin-300, pH7. 2的鏈霉親和素溶液，濃度為20μ g/ml，500l·! I ;所述所述受體微珠包被有含O. 05% Proclin-300, ρΗ7·2 的 PBS 溶液，濃度為 5 μ g/ml，500 μ I。所述腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原的氨基酸序列如Seq ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。前述的試劑盒，包括供體微珠20 μ g/ml、受體微珠5 μ g/ml及生物素化的腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原37. 5ng/孔；使用時，以總體系20 μ I計，每孔添加量為受體微珠 8 μ I、供體微珠10 μ I、生物素化的腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原37. 5ng及血清2 μ I。借由上述技術方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果利用本發(fā)明的試劑盒進行腸道病毒71型的檢測，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗漆，不受溶血影響。
圖I為EV71 VPl全長的核酸電泳圖；圖2為EV71 VPl蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結果，第一泳道為預染蛋白分子量標準，從上至下分子量依次為175kD、83kD、62kD、48kD、33kD、25kD、17kD、7kD ;第二泳道為EV71 VPl全長1-297，分子量大小約為34kD，與預期結果一致；
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圖3為HiS-標簽EV71 VPl全長蛋白的Western blot鑒定結果。第一泳道為EV71 VPl全長1-297，分子量大小約為34kD。第二泳道為Western blot蛋白分子量標準，從上至下分子量依次為50KD、40KD、30KD、20KD。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。以下實施例中使用的腸道病毒毒株EV71/Fuyang. Anhui. CHU/17. 08/1見Zhang 等.病毒學雜志，2010，7 :94)保存于中國疾病預防控制中心病毒病所。實施例一、EV71 VPl重組蛋白原核表達質粒的構建及鑒定I目的片段擴增I. IPCR循環(huán)擴增以毒株 EV71/Fuyang. Anhui. CHU/17. 08/1 (GenBank No. EU703812)的基因組為模板，進行反轉錄，通過常規(guī)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增所需目的片段EV71 VPl 1-297 (GenBank Number HM579945. I)，其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示，編碼的氨基酸序列如Seq ID No. I所示。上下游引物分別引入Nde I和Xho I酶切位點，引物設計采用Primer Premier 5(—種引物設計軟件)軟件,引物由上海生工公司合成，引物序列見表I。表I引物序列
權利要求
1.抗腸道病毒71型衣殼蛋白IIgM AlphaLISA檢測試劑盒，其特征在于，包括供體微珠、受體微珠及生物素化的腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原；其中，所述供體微珠包被有含 25mM HEPESUOOmM NaCl 和 O. 05% Proclin-300, pH7. 2 的鏈霉親和素溶液；所述受體微珠包被有含O. 05% Proclin-300, pH7. 2的PBS溶液； 所述腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原的氨基酸序列如Seq ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，包括供體微珠20μ g/ml、受體微珠 5 μ g/ml及生物素化的腸道病毒71型衣殼蛋白I抗原37. 5ng/孔；使用時，以總體系20 μ I 的腸道病毒71型衣殼蛋白I計，每孔添加量為受體微珠抗原37. 5ng及血清2 μ I。·8 μ I、供體微珠10 μ I、生物素化
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗腸道病毒71型衣殼蛋白1 IgM AlphaLISA檢測試劑盒，其包括供體微珠、受體微珠及生物素化的腸道病毒71型衣殼蛋白1抗原。本發(fā)明通過ELISA法摸索出生物素化后的VP1的最適量為37.5ng，并通過優(yōu)化供體微珠、受體微珠、血清等試驗反應條件，建立了基于抗EV71 VP1的IgM AlphaLISA檢測方法。利用本發(fā)明的試劑盒進行腸道病毒71型的檢測，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響。
文檔編號G01N33/569GK102590505SQ20121003180
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月13日 優(yōu)先權日2012年2月13日
發(fā)明者董小平, 陳操, 韓俊, 高晨 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所