專利名稱：膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術，特別是一種膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建。
背景技術：
1988年，Rousselet等發現神經膠質細胞的條件培養液具有神經營養作用，1993年美國華裔科學家Lin等從神經膠質瘤細胞條件培養液中純化了這種具有神經營養作用的蛋白質，克隆其基因并將之命名為膠質細胞源生神經營養因子(glial cellline-derived neurotrophic factor, GDNF)。隨后的大量研究表明，GDNF不僅對多巴胺能神經元具有很強的促存活作用，而且對運動神經元、去甲腎上腺素神經元、外周感覺神經元和交感神經元都有很強的促存活作用；而且GDNF對發育中的運動神經元也有良好的營養作用。GDNF對運動神經元的作用在迄今發現的所有神經營養因子中是活性最強的一個，可以促進運動神經元的存活、分化及代謝功能，對胚胎期或出生后損傷的運動神經元都有很強的修復作用。GDNF的這種對運動神經元所具有的修復損傷作用，為運動神經元性疾病(如脊髓損傷)的治療開辟了新途 徑。然而，⑶NF是一種生物大分子，難以通過血腦屏障，因而很難直接轉移到中樞神經系統。此外盡管GDNF在哺乳動物體內分布較廣，但其含量甚微，因此我們利用基因工程的方法以期獲得高產量的活性因子用于脊髓損傷的治療。長期以來，許多神經系統疾病如脊髓損傷、帕金森氏綜合癥、脊髓側束硬化癥等的治療是臨床攻克的難題。應用細胞因子直接注射(一次性治療)或神經組織移植(細胞替換)療效有限，且一些神經遺傳性疾病以及需合適微環境的神經再生的治療，僅用細胞介導療法很難達到理想的效果。因此人們想通過基因治療來解決這些問題。然而體內基因治療(in vivo)存在某些缺陷，如攜帶外源基因的載體很難特異性靶向神經細胞或組織區域，而且也不能替換死亡的神經元。間接體內基因療法(ex vivo)雖已應用于脊髓損傷的移植治療，但是載體細胞的選擇較為困難。作為中樞神經系統基因治療的載體細胞應當符合下例條件:①易于獲取和增殖，包括許多已建株的細胞和胚胎及新生期幼稚細胞載體細胞經轉基因處理后移植到脊髓內仍能具有成活和分裂能力載體細胞在脊髓內不能造成浸潤生長，以免局部成為軸突生長的障礙，甚至形成腫瘤；④載體細胞在體內應能長期持續表達所攜帶的目的基因；⑤免疫原性小；⑥載體細胞能自身分泌某些營養物質如細胞外基質最為重要的是載體細胞或其衍生的細胞能替換死亡的神經元或能使已脫髓鞘的軸突重新髓鞘化。近年研究提示,神經干細胞(neural stem cells, NSCs)不僅可在體外大量擴增，而且回輸到體內可以長期存活、適當整合于中樞神經組織且可分化成神經元、少突膠質細胞和星型膠質細胞能并穩定表達外源基因，因此是一種理想的載體細胞。盡管NSCs可產生一系列神經營養因子如⑶NF，BDNF, NGF, NT-3, NT_4/5[57]，但這些因子表達有限因而作用甚微。因此，GDNF修飾的胚胎NSCs的構建為神經系統疾病，尤其是脊髓損傷、帕金森氏綜合癥、脊髓側束硬化癥等疾病提供了新的更好的治療方法。
發明內容
本發明的目的是構建一種膠質細胞源生神經營養因子基因(GDNF)修飾的胚胎神經干細胞(NSCs)。所構建的⑶NF-NSCs對神經元具有明顯的促存活作用，對多巴胺神經元具有重要的營養作用，同時仍然保持了 NSCs的干細胞特性，且回輸體內后長期存活并可分化成穩定表達外源基因的神經元、少突膠質細胞和星型膠質細胞，為許多神經系統疾病如脊髓損傷、帕金森氏綜合癥、脊髓側束硬化癥等的治療提供了新方法。技術方案本發明的目的是按如下技術方案實現的。膠質細胞源生的神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:它按如下步序進行:(I)質粒轉化大腸桿菌，將質粒pSK/⑶NF和逆轉錄病毒表達載體pLNCX2分別加入感受態大腸桿菌，并抽提與純化質粒DNA。(2)限制性內切 酶消化，用限制性內切酶分別消化質粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收 DNA。(3)目的基因與載體的連接、轉化和克隆鑒定，將目的GDNF和載體pLNCX2大片段DNA在連接酶的作用下連接、轉化大腸桿菌，并進行克隆鑒定。(4)重組逆轉錄病毒的包裝，將質粒PLNCX2-GDNF轉染包裝細胞PT67，并篩選陽性克隆(暫時命名為PT67-GDNF)。(5) PCR鑒定重組逆轉錄病毒的包裝，陽性克隆pT67-GDNF細胞基因組DNA進行PCR擴增鑒定。(6)病毒滴度的測定，將PT67-GDNF細胞培養上清液收集，加入小鼠成纖維細胞培養液，并篩選抗性克隆。(7)大鼠胚胎神經干細胞的體外培養，取懷孕SD大鼠大腦皮質組織經Trypsin消化后，用DMEM-F12培養液培養傳代。(8)病毒感染胚胎神經干細胞及免疫組化鑒定，將PT67-GDNF細胞上清液感染NSCs,并篩選得陽性克隆。轉基因神經球以免疫組化染色鑒定。(9) Western印跡鑒定⑶NF_NSCs，抽取待鑒定的轉基因胚胎神經干細胞⑶NF-NSCs蛋白，行Western印跡并免疫組化鑒定。(10) ELISA測定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，將⑶NF-NSCs細胞上清液收集，以ELISA法測定⑶NF的含量。(11)轉基因干細胞⑶NF-NSCs生物活性檢測，取大鼠中腦多巴胺組織細胞培養后，加入NSCs-GDNF細胞培養上清液檢測⑶NF的生物活性。所述步序(I)采用的大腸桿菌是TGl，培養基是LB，質粒pSK/⑶NF和pLNCX2陽性克隆用的抗藥基因是Amp，37°C培養12-16小時后挑取陽性菌落常規進行質粒的抽提與純化。所述步序(2)采用的限制性內切酶分別是HindIII和Notl，總反應體積為200μ 1，反應溫度和時間分別是37°C水浴2小時，DNA回收用瓊脂糖凝膠電泳法和DNA純化試劑盒。所述步序⑶連接酶是T4 DNA ligase，連接溫度和時間是16°C、14小時，挑選陽性克隆的標準是:直徑2-3mm、光滑、濕潤、中央隆起的菌落；陽性克隆用質粒純化試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳法回收純化質粒DNA，鑒定用Hind III和Not I酶切看目的基因片段。目的基因⑶NF序列測定采用大鼠⑶NF基因的引物，上游:5’ -TGG GAT GTC GTG GCT GTC TG-3，;下游:5’-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3’。所述步序(4)包裝細胞pT67細胞培養用DMEM完全培養基并加15%的胎牛血清(FBS)，質粒pLNCX2-GDNF轉染用Lipof ectamineTM2000 (脂染明)和 4-8 μ g/ml poly-brene 介導，陽性克隆 pT67_GDNF 的篩選用 500 μ g/ml G418。所述步序(5)PCR采用的引物是Neo基因序列，上游為:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游為:5’ -CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3’，擴增產物用瓊脂糖凝膠(1.0%凝膠)鑒定。所述步序
(6)病毒滴度測定用的是小鼠成纖維細胞NIH 3T3細胞，培養基是DMEM完全培養基加10%的小牛血清培養； 收集24小時的pT67-GDNF細胞培養上清液感染NIH 3T3細胞，陽性克隆的篩選用400 μ g/ml G418。所述步序(7)消化用Trypsin的濃度是0.25%,NSCs的培養基是DMEM-F12液中含5-10μ g/ml肝素、1% N2和青/鏈霉素各100單位、10% EGF和10%FGF-2，NSCs凍存液是10% BSA加7.5% DMS0。所述步序⑶病毒液的收集用處于對數生長期(培養14-17小時)的pT67-GDNF細胞上清液，添加4_8 μ g/ml poly-brene,感染干細胞8小時，陽性克隆用100 μ g/ml G418篩選篩選。陽性克隆的免疫組織化學鑒定:神經球經固定冰凍切片后，免疫組化一抗是兔抗大鼠⑶NF與小鼠抗大鼠nestin，二抗是FITC標記的羊抗兔IgG與Rhodamine標記的羊抗小鼠二抗(1: 50),封片用Gel/mount+Hoechst,熒光顯微鏡觀察并拍照。所述步序(9)WeStern印跡用細胞蛋白抽提液由0.lmol/L NaCl,
0.01mol/L ρΗ7.6Tris-Cl，0.001mol/L pH8.0 EDTA,I μ g/ml Aprotinin,100 μ g/ml PMSF組成，免疫化學染色用的一抗是兔抗大鼠IgG(按1: 500稀釋)，二抗是羊抗兔IgG 二抗(稀釋于5% BSA),顯色用鄰苯二胺。所述步序(10)樣本和蛋白標準液用Block & SampleI XBuffer分別稀釋，蛋白標準液原濃度為2 μ g/ml，兩者分別稀釋成2，000、1，600、1，200、800和400pg/ml，實驗用量為100 μ 1，室溫振蕩(500rmp)時間是6小時，一抗是抗人⑶NF多克隆抗體的稀釋度是1: 500，二抗是HRP標記的抗雞IgY抗體，室溫2小時后顯色并計算GDNF的含量。所述步序(11)采用的是清潔級SD大鼠，中腦多巴胺組織塊用0.25%Trypsin 37°C消化，細胞培養蓋玻片用多聚賴氨酸(0.005 0.01%w/v)包被，培養液是神經干細胞基礎培養液加10%的FBS。實驗設三組:Dopa+NSCs-GDNF組、Dopa+NSCs組、Dopa組。轉基因干細胞、干細胞或N2培養液分別加入上述三組多巴胺細胞培養瓶，培養7天后進行免疫組化染色，一抗是小鼠抗大鼠TH單抗150 μ I，二抗是熒光標記的羊抗小鼠二抗(1: 50) 150 μ I,封片用Gel/mount+Hoechst,突光顯微鏡觀察、拍照。
圖1是重組逆轉錄病毒表達載體pLNCX2-GDNF的構建，圖2是重組質粒pLNCX2-GDNF酶切圖譜分析，圖3是pT67-GDNF細胞Neo基因PCR產物分析，圖4是PT67-GDNF上清液所含病毒滴度的測定，圖5是E14.5 SD大鼠大腦皮質NSCs體外培養5天(Pl)，神經球形成和Nestin表達，圖6是轉基因神經干細胞免疫組化染色鑒定，圖7 是 NSCs-GDNF 細胞抽提物 Western blot 分析，
圖8是ELISA法對轉基因神經干細胞分泌的⑶NF定量分析， 圖9是NSCs-GDNF上清液對E 14.5 SD大鼠中腦腹側多巴胺能神經元體外培養免疫熒光染色。
具體實施例方式通過本具體實施方式
說明本發明膠質細胞源生的神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建。按如下步序操作:(I)質粒轉化大腸桿菌，將TGl大腸桿菌接種于LB培養基，以制備感受態大腸桿菌。同時將含目的基因膠質細胞源生的神經營養因子基因(GDNF)的質粒pSK/GDNF和逆轉錄病毒載體質粒PLNCX2分別加入到感受態細胞懸液中，并轉移到含Amp.的100mm LB平板，倒置平皿于37°C培養12-16小時后可出現菌落。挑取陽性菌落進行質粒的抽提與純化。
(2)限制性內切酶消化質粒，在一次性200 μ I Eppendorf管內依次加入ddH20I μ 1、Buffer2 μ 1、DNA15 μ I (純化的 pSK/GDNF 質粒或 pLNCX2 質粒)、HindIII 和 NotI 各1μ 1，低速離心(使可能粘于管壁的酶進入溶液)后37°C水浴箱水浴2小時進行酶切反應，產物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳法回收DNA并純化。(3)目的基因與載體的連接和轉化及克隆鑒定，經過酶切且膠回收的目的⑶NF和載體PLNCX2大片段DNA，在T4 DNA Iigase連接酶的作用下經16°C反應14小時后，轉化大腸桿菌。挑選轉化體(要求直徑2-3mm、光滑、濕潤、中央隆起)進行克隆鑒定:即用HindIII和Not I酶切純化的質粒，瓊脂糖凝膠電泳觀察并將位于目的基因處的膠塊割下回收，命名為pLNCX2-GDNF質粒(見圖1)。重組質粒經酶切得到的產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，上述所得GDNF片段約為720bp，與核酸標準分子量564bp條帶相比，該條帶位置正確(見圖2)。⑶NF基因全長序列的測定:大鼠⑶NF基因的引物設計根據Genebank大鼠⑶NF基因全長序列(為700bp)，應用引物設計軟件primer 5版本得到一對引物，上游:5’-TGG GAT GTCGTG GCT GTC TG-3’；下游:5’_CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3’。測序結果與大鼠⑶NF基因序列完全一致。(4)重組逆轉錄病毒的包裝，成纖維細胞PT67細胞培養用DMEM完全培養基并加15%的胎牛血清(FBS)，置37°〇、5%0)2細胞培養箱培養(以下細胞培養均同)，3-4天換液一次。一周左右，細胞匯合度達80%時傳代，按LipOfectamineTM2000(脂染明)說明書操作將質粒 PLNCX2-GDNF 轉染包裝細胞，并補充 4-8 μ g/ml poly-brene，用 500 μ g/ml G418篩選陽性克隆(暫時命名為PT67-GDNF)。(5) PCR鑒定重組逆轉錄病毒的包裝，抽提與純化pT67-GDNF細胞基因組DNA，設計Neo基因序列引物，上游為:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游為:
5’ -CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3 ’。PCR擴增產物行瓊脂糖凝膠(1.0%凝膠)電泳觀察、拍照。圖3表明:pT67-GDNF細胞基因組抽提物PCR產物在800bp處有一致密的DNA條帶，對照組(pT67細胞)無條帶出現。(6)病毒滴度的測定，用于病毒滴度測定的小鼠成纖維細胞NIH 3Τ3細胞用DMEM完全培養基加10%的小牛血清培養，同時pT67-GDNF細胞培養上清液收集用于病毒滴度的測定之用。收集24小時pT67-GDNF細胞培養上清液，作O、10、100、1000、10000倍等不同濃度的稀釋，加于NIH 3Τ3細胞培養六孔板，并加入10% FCS和poly-brene培養12小時。撤去病毒液并加條件培養基繼續培養，400 μ g/ml G418篩選抗性克隆。當對照(一組是4-8 μ g/ml poly-brene作用的NIH 3T3細胞，另一組為正常培養組)細胞全部死亡，計數重組病毒感染組陽性細胞克隆數。圖4顯示:G 418篩選兩周后獲得一病毒滴度為1.2X105TU (轉導單位)/ml陽性克隆N0.7。(7)胚胎神經干細胞的體外培養，取懷孕14天的SD大鼠大腦皮質組織塊，修理成約Imm3大小并用0.25% Tr ypsin消化,加D_Hank’s液吹打組織使成單個細胞。加入IOmg/L Dnase I室溫約3_5分鐘，離心棄去上清液，細胞沉淀用DMEM-F12基礎培養液重懸并培養(DMEM/F12基礎培養液配制:在DMEM-F12液中加入5_10 μ g/ml肝素、I % N2和青/鏈霉素各100單位，10% EGF和10% FGF-2用時再加)傳代。神經干細胞的凍存用10% BSA和7.5% DMSO為凍存液。圖5顯示:E14 SD大鼠大腦皮質NSCs體外培養5天(Pl)，神經球形成和Nestin表達，A，自由漂浮的神經球；B、C和D分別是神經球經冰凍切片后進行的Hoechst 33342核標記、抗Nestin免疫突光染色和Hoechst 33342+Nestin雙染色結果。(8)病毒感染胚胎神經干細胞及轉基因干細胞鑒定，將處于對數生長期的PT67-GDNF細胞上清液換成DMEM/F12基礎培養液，37°C、5 % CO2培養箱培養14-17小時并收集上清液。傳代的NSCs (Pl)形成一定大小的小球時用，上述病毒液重懸并增補10%EGF、10% FGF-2和4-8 μ g/ml poly-brene, 37°C>5% CO2培養箱培養8小時后撤去病毒液，換成NSCs條件與新鮮基礎培養液(比例為1:1)的混合液。培養并用100 μ g/ml G418篩選，獲得陽性克隆⑶NF-NSCs。免疫組織化學鑒定:神經球經4%多聚甲醛/PBS液4°C固定過夜、30%的多糖4°C過夜，加OCT組織包埋劑包埋后作15 μ m的冰凍切片。免疫組化一抗是兔抗大鼠⑶NF與小鼠抗大鼠nestin, 二抗是FITC標記的羊抗兔IgG與Rhodamine標記的羊抗小鼠二抗(1: 50),封片用Gel/mount+Hoechst,突光顯微鏡觀察并拍照。從圖6可以看出:經nestin和⑶NF染色并用Hoechst作核標記發現，轉基因神經球顯示⑶NF強陽性，而野生型神經干細胞呈極其微弱的陽性。(9) Western印跡鑒定⑶NF-NSCs,將待鑒定的轉基因胚胎神經干細胞⑶NF-NSCs加細胞蛋白抽提液(0.lmol/L NaCl,0.01mol/L ρΗ7.6 Tris-Cl，0.001mol/L pH8.0 EDTA,I μ g/mlAprotinin, 100 μ g/ml PMSF) 100-150 μ 1，吹打使神經球裂解并抽取蛋白，行Western印跡并進行免疫化學染色。后者采用的一抗是兔抗大鼠IgG(按1: 500稀釋)，二抗是羊抗兔IgG 二抗(稀釋于5% BSA)，顯色用鄰苯二胺(DAB，稀釋液按1: 50)，以此稀釋液再按1: 50稀釋DAB。圖7顯示=NSC-GDNF的免疫反應性明顯較野生型NSCs強。(10) ELISA測定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，常規方法進行酶標板的包被，用Block &Samplel XBufTer分別稀釋樣本和蛋白標準液。后者原濃度為2 μ g/ml，分別稀釋成2，000、1，600、1，200、800和400 8/1111。用多孔加樣器加100 μ I的樣品和蛋白標準液于酶標板，室溫振蕩(500rmp)6小時后加入用Block & Sample I XBuffer稀釋抗人⑶NF多克隆抗體(I: 500)，混勻，避免產生氣泡，4°C過夜。HRP標記的抗雞IgY抗體加入，室溫2小時后顯色(加100 μ I TMB One Solution,室溫15分鐘)并計算⑶NF的含量。從圖8可以看出:NSCs-GDNF每日所分泌的⑶NF量為51ng/ml每百萬個細胞，而野生型NSCs分泌量小于Ing/ml。這些結果表明工程細胞NSCs-GDNF能夠表達高劑量的外源性⑶NF。(11)轉基因干細胞⑶NF-NSCs生物活性檢測，取清潔級SD大鼠中腦多巴胺組織塊，把組織塊剪碎成約Imm3的方形塊，用0.25% Trypsin 37°C消化、離心、棄去上清液，細胞沉淀用DMEM-F12重懸并接種于已經加入經多聚賴氨酸(0.005 0.01% w/v)包被的細胞培養蓋玻片的六孔板或十二孔板，加2ml或Iml神經干細胞基礎培養液，并加10%的FBS培養鑒定為多巴胺神經細胞，并分為三組:Dopa+NSCs-GDNF組、Dopa+NSCs組、Dopa組。這三組的細胞培養液分別是NSCs-GDNF細胞(P1，經G418篩選的陽性克隆神經球當代為PO)培養上清、(P2) NSCs培養上清液、N2培養液，各組多巴胺神經元培養7天后進行免疫組化染色。一抗是小鼠抗大鼠TH單抗150 μ I，置濕盒內4°C過夜，洗滌后加熒光標記的羊抗小鼠二抗(I: 50) 150μ 1，置濕盒內37°C避光孵育I小時。在載玻片上滴加Gel/mount (Biomeda)一滴，將coverslip反蓋在載玻片上(細胞面朝下且注意不要產生氣泡)，用熒光鏡觀察并拍照。圖9表明:NSCs-GDNF 條件培養液組有大量TH-陽性神經元生長并有較長的突起形成；野生型NSCs條件培養液組TH-陽性神經元較少；原代多巴胺能神經元單獨培養，3天后神經元開始死亡至7天，TH-陽性神經元已很少。
權利要求
1.膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:它按如下步序進行: (1)質粒轉化大腸桿菌，將質粒pSK/GDNF和逆轉錄病毒表達載體PLNCX2分別加入感受態大腸桿菌，并抽提與純化質粒DNA。
(2)限制性內切酶消化，用限制性內切酶分別消化質粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。
(3)目的基因與載體的連接、轉化和克隆鑒定，將目的GDNF和載體pLNCX2大片段DNA在連接酶的作用下連接、轉化大腸桿菌，并進行克隆鑒定。
(4)重組逆轉錄病毒的包裝，將質粒PLNCX2-GDNF轉染包裝細胞pT67，并篩選陽性克隆(暫時命名為pT67-GDNF)。
(5)PCR鑒定重組逆轉錄病毒的包裝，陽性克隆pT67-GDNF細胞基因組DNA進行PCR擴增鑒定。
(6)病毒滴度的測定，將PT67-GDNF細胞培養上清液收集，加入小鼠成纖維細胞培養液，并師選抗性克隆。
(7)大鼠胚胎神經干細胞的體外培養，取懷孕SD大鼠大腦皮質組織經Trypsin消化后，用DMEM-F12培養液培養傳代。
(8)病毒感染胚胎神經干細胞及免疫組化鑒定，將PT67-GDNF細胞上清液感染NSCs，并篩選得陽性克隆。轉基因神經球以免疫組化染色鑒定。
(9)Western印跡鑒 定⑶NF-NSCs,抽取待鑒定的轉基因胚胎神經干細胞⑶NF-NSCs蛋白，行Western印跡并免疫組化鑒定。
(10)ELISA測定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，將⑶NF-NSCs細胞上清液收集，以ELISA法測定⑶NF的含量。
(11)轉基因干細胞⑶NF-NSCs生物活性檢測，取大鼠中腦多巴胺組織細胞培養后，加入NSCs-GDNF細胞培養上清液檢測⑶NF的生物活性。
2.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(I)質粒轉化大腸桿菌，將TGl大腸桿菌接種于LB液體培養基，以制備感受態大腸桿菌。同時將含GDNF的質粒pSK/GDNF和質粒pLNCX2分別加入到感受態細胞懸液中，轉至LB平板培養并挑取陽性菌落進行質粒的抽提與純化。
3.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(2)限制性內切酶消化質粒，使用HindIII和NotI分別消化純化的pSK/⑶NF質粒和pLNCX2質粒，瓊脂糖凝膠電泳法進行DNA回收。
4.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(3)目的基因與載體的連接、轉化及克隆鑒定，經過酶切且膠回收的目的⑶NF和載體pLNCX2大片段DNA在T4 DNA Iigase連接酶的作用下，經16°C反應14小時后，轉化大腸桿菌。陽性克隆用Hind III和Not I酶切純化的質粒，命名為pLNCX2-GDNF質粒。其鑒定采用⑶NF基因全長序列的測定法，使用的一對引物上游:5’ -TGG GAT GTCGTGGCT GTC TG-3，:下游:5，-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3，。
5.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序⑷重組逆轉錄病毒的包裝，成纖維細胞PT67細胞培養用DMEM完全培養基并加15%的胎牛血清(FBS)培養，細胞匯合度達80 %時用Lipofectamine 2000 (脂染明)將質粒pLNCX2_GDNF轉染包裝細胞pT67，G418篩選陽性克隆并定名為PT67-GDNF。
6.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(5) 0 鑒定重組逆轉錄病毒的包裝，？了67-60即細胞基因組0嫩的抽提與純化，設計Neo基因序列設計的一對引物，上游為:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游為:5’-CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3’。進行PCR擴增并行瓊脂糖凝膠(1.0%凝膠)電泳觀察、拍照。。
7.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(6)病毒滴度的測定，收集24小時pT67-GDNF細胞培養上清液，作O、10、100、1000、10000倍等不同濃度的稀釋，加于NIH 3T3細胞培養六孔板，并加入10 %FCS和poly-brene培養12小時。撤去病毒液并加條件培養基繼續培養，G418篩選抗性克隆。
8.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(7)胚胎神經干細胞的體外培養，取懷孕14.5天的SD大鼠大腦皮質組織塊，0.25% Trypsin消化成單個細胞，用DMEM/F12培養液(DMEM-F12液中加入5-10 μ g/ml肝素、1% N2和青/鏈霉素各100單位，10% EGF和10% FGF-2用時再加)培養、傳代，用10% BSA和7.5% DMSO為凍存液凍存干細胞。
9.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(8)病毒感染胚胎神經干細胞及免疫組化鑒定，收集對數生長期的 丁67-60即細胞上清液，加入吧08( 1)細胞培養液中，以4-8 μ g/ml poly-brene促進感染，陽性克隆用100 μ g/ml G418篩選。免疫組織化學鑒定:神經球經固定后作冰凍切片，免疫組化染色一抗是兔抗大鼠⑶NF與小鼠抗大鼠nestin，二抗是FITC標記的羊抗兔IgG與Rhodamine標記的羊抗小鼠二抗(1: 50),封片用Gel/mount+Hoechst,突光顯微鏡觀察并拍照。
10.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(9)western印跡鑒定⑶NF-NSCs,用細胞蛋白抽提液(0.lmol/LNaCl,0.01mol/L ρΗ7.6 Tris-Cl,0.0Olmol/L pH8.0 EDTA,I μ g/ml Aprotinin,100 μ g/mlPMSF)抽提GDNF-NSCs細胞蛋白，行SDS-PAGE膠蛋白電泳并進行免疫化學染色，一抗是兔抗大鼠IgG (按1: 500稀釋)，二抗是羊抗兔IgG 二抗(稀釋于5% BSA)，用鄰苯二胺(DAB)顯色。
11.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(10)ELISA測定⑶NF-NSCs上清液中⑶NF含量，樣本和蛋白標準液分別稀釋成2，000、1，600、1，200、800和400pg/ml，分別加100 μ I的樣品和蛋白標準液于酶標板，一抗是抗人⑶NF多克隆抗體(I: 500)，二抗是HRP標記的抗雞IgY抗體加入，用TMB One Solution顯色并計算GDNF的含量。
12.根據權利要求1所述的膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建，其特征是:所述步序(11)⑶NF-NSCs生物活性檢測，實驗分三組:Dopa+NSCs-GDNF組、Dopa+NSCs組、Dopa組，培養液分別為NSCs-GDNF和NSCs培養上清液，以及N2培養液。多巴胺神經元(Dopa)取自清潔級14.5天SD大鼠中腦組織塊。各組細胞培養7天后進行免疫組化染色， 一抗是小鼠抗大鼠TH單抗，二抗是熒光標記的羊抗小鼠二抗。
全文摘要
本發明涉及一種生物技術，具體是膠質細胞源生神經營養因子基因修飾的胚胎神經干細胞構建。它是按如下步序操作(1)質粒的轉化；(2)質粒的消化純化；(3)目的基因和載體的克隆；(4)重組質粒的包裝；(5)重組質粒的鑒定；(6)病毒滴度測定；(7)干細胞培養；(8)病毒感染干細胞；(9)轉基因干細胞鑒定；(10)轉基因干細胞的目的蛋白含量測定；(11)轉基因干細胞生物活性檢測。本發明構建的轉基因胚胎神經干細胞不僅對多巴胺能神經元具有很強的促存活作用，而且還保留了原來的神經干細胞的特性。本發明不僅對運動神經元損傷性疾病，也對神經元變性性疾病的具有很好的治療作用。
文檔編號G01N33/68GK103215225SQ20121001628
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者孫勇 申請人:孫勇