專利名稱：一種小麥組織活性氧熒光標記方法
技術領域：
本發明屬于植物逆境脅迫與生理響應技術領域，涉及一種植物組織活性氧定位及相對含量檢測的熒光標記方法，特別涉及一種小麥生長發育過程中遭受生物逆境與非生物逆境脅迫下活性氧的產生、產生部位與相對含量的標記方法。
背景技術：
植物在生長發育過程中時時遭受各種逆境以及不可避免的衰老過程，從而造成植物細胞活性氧(reactive oxygen species)代謝失調，即植物體內活性氧如超氧物陰離子 (OH ·_)，過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(-0H)、單線態氧(1O2)等猝發；而活性氧的清除劑，如超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)、類胡蘿卜素、維生素E、維生素C等生物合成或活性水平下降，導致活性氧產生與清除動態平衡紊亂，活性氧積累。活性氧積累對植物產生傷害的一個重要機制是直接或間接啟動膜脂的過氧化作用，導致細胞膜、類囊體片層結構、線粒體膜、核膜等細胞膜系統損傷、降解，丙二醛(MDA)含量增加，葉綠素降解和光合作用酶活性下降，植物光合效率下降，植物不能維持正常的生長和發育，組織過早衰老死亡。小麥是兩年生作物，在整個生活史中要遭受冬季凍害、春季干旱、初夏熱害等自然逆境，以及病蟲害等生物逆境，同時花后灌漿過程又是一個不可避免的衰老過程。因此，檢測小麥組織活性氧產生部位與含量是衡量小麥抗逆性、高產穩產的一個關鍵指標，是育種學家篩選優良小麥品種的一個重要措施。以前的文獻中，對活性氧的標記一般用硝基四氮唑藍(NBT)標記超氧物陰離子(活性氧中的一種)，3，3’ - 二氨基聯苯胺(DAB)標記H2O2活性氧中的一種)。然而，植物組織中活性氧種類繁多，其產生量也相差很大，因此，難以用1-2 種活性氧含量的變化說明植物的抗逆性或衰老進程。更重要的是，目前對小麥組織、特別是較大體積的材料中活性氧綜合產生量還沒有科學的檢測方法。2’，7’ - 二氯氫化熒光素雙乙酸酯(DCFH-DA)可以通過細胞膜進入細胞內，被細胞內非特異性脂酶催化生成2’，7’ - 二氫二氯熒光黃(DCFH)，DCFH不能發出熒光。當細胞內有活性氧存在時，DCFH可以被氧化成2’，7’- 二氯熒光黃(DCF)，在488 nm波長激光激發下發出波長530 nm左右的綠色熒光。DCF形成量與細胞氧化產物水平呈正比。因此， DCF熒光強度間接反映細胞內活性氧的綜合水平(Schopfer et al.，2001)。DCFH-DA標記活性氧首先在動物細胞上應用，在植物上的應用還只限于如懸浮培養細胞、菌類、原生質體等單個細胞或體積很小的材料，如剝離的葉片表皮層細胞。本發明應用DCFH-DA熒光標記，首先在小麥葉片、莖桿等較大組織材料中標記活性氧的產生、定位及相對含量的檢測，最大限度保留細胞活性、對小麥植株內產生的活性氧進行精準標記。
發明內容
為了解決上述的技術問題，本發明提供了一種小麥生長發育過程中遭受生物逆境
3與非生物逆境脅迫下活性氧的產生、產生部位與相對含量的標記方法。本發明提供了一種活性氧熒光標方法，采用DCFH-DA對小麥不同組織材料中的活性氧進行綜合標記、定位及相對含量檢測。該方法包括下述的步驟
a.配制小麥組織樣品標記負載緩沖液，吸取樣品標記負載緩沖液5 ml置入容積 6-10ml的器皿中；
以上的標記負載緩沖液通過如下方法配制
配制10 mM Tris-HCl或磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 7. 2-7. 5);用DMS0、醇溶液配制 DCFH-DA母液(可凍存于 20°C- 80°C條件下)，濃度為3_5 mM ;用緩沖液配制熒光標記負載液，含最終濃度為30-50 μ M的DCFH-DA、終濃度為50 mM的KCl和終濃度為2. 2-2. 8% (體積百分比)的戊二醛。b.用鋒利刀片，如剃須刀片或手術刀片，將小麥莖桿、葉片等材料切割成長度為 O. 5 cm組織塊；
c.用樣品標記負載緩沖液漂洗步驟b制得組織塊，至少漂洗兩次，然后將組織塊置于步驟a中盛有標記負載緩沖液的器皿中，密封后抽氣，使植物組織塊全部沉到器皿底部，促使負載緩沖液快速進入材料內部；
d.在25°C下避光放置20-30分鐘；
e.將步驟d中的材料放置在顯微鏡載玻片上，用激光激發裝置激發，熒光顯微鏡下觀察、CXD圖像采集系統拍照，顯微鏡工作條件為激發波長為460-500 nm,發散波長為 510-560 nm。以上的醇溶液為乙醇或者是甲醇。本發明適用于O. 5 cm長、厚度小于I mm的各種植物組織材料,特別是在小麥材料上本發明已經成功使用。本發明的有益效果在于
(1)傳統的DAB、NBT等對活性氧種類的標記需要2-12小時，時間較長，而本發明對活性氧的標記只需要20-30分鐘，避免了樣品長時間標記負載期間活性氧含量及部位的失真；
(2)采用本發明的方法可對較大的組織材料中活性氧綜合產生量進行更科學的檢測； 例如可以對厚度小于1_的植物葉片組織、壁厚小于1_的莖桿組織如小麥莖桿中的活性氧進行檢測；
(3)本發明所用樣品標記負載緩沖液含有終濃度為2.2-2. 8% (體積百分比)戊二醛，可在DCFH-DA對活性氧標記的同時，對材料進行固定，保證活性氧標記的精確性；同時，用注射器對密封后放置材料的器皿進行抽氣，使負載緩沖液快速進入材料內部，提高固定與負載效果；
(4)本發明能對較大體積的組織材料中活性氧綜合產生量進行檢測，更能精準反映植物的抗逆性或衰老進程；
(5)本發明對實驗材料的前處理以及所用的器材要求簡單，易于操作。
圖I為實施例I小麥葉片組織熒光激發后在熒光顯微鏡下觀察的結果；圖2為實施例2小麥葉片組織熒光激發后在熒光顯微鏡下觀察的結果；
圖3為實施例3小麥葉片組織熒光激發后在熒光顯微鏡下觀察的結果。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
來對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但并不以此限制本發明。實施例I
一種植物組織活性氧熒光標記方法，在營養脅迫(氮素缺乏)下小麥(濟麥22)莖桿組織中的應用，具體操作如下
a.配制小麥組織樣品標記負載緩沖液，吸取樣品標記負載緩沖液5 ml置入容積為10 ml的器皿中；
配制10 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7. 2);用DMSO配制DCFH-DA母液，濃度為5 mM ;用緩沖液配制熒光標記負載液，含最終濃度為50 11|1的00 ! ^、終濃度為50 mM的KCl和終濃度為2. 5% (體積百分比)的戊二醛。b.將小麥莖桿切成長度為O. 5 cm的組織塊，并沿縱軸平均切開，一分為二 ；
c.用樣品標記負載緩沖液漂洗步驟b制得組織塊兩次，然后置于步驟a中盛有標記負載緩沖液的器皿中，密封后抽氣，使植物組織塊全部沉到器皿底部；
d.在25°C下避光放置30分鐘；
e.將莖桿組織塊外側朝上放置在顯微鏡載玻片上，用熒光顯微鏡(LeicaDM 2500)觀察并用CXD圖像采集系統(Leica DFC 420)拍照，顯微鏡工作條件為激發波長為495 nm, 發散波長為518 nm。將最終制作的小麥莖桿組織材料用熒光激發裝置激發，在熒光顯微鏡下觀察，觀察結果如附圖I所示，圖中箭頭所指為性氧產生部位與相對含量，高亮度部位說明活性氧含量較高，低亮度部位活性氧含量相對較低，標尺=200 Mm)。
權利要求
1.小麥組織活性氧熒光標記方法，包括下述的步驟a.配制小麥組織樣品標記負載緩沖液，吸取小麥組織樣品標記負載緩沖液5ml置于器皿中；以上的樣品標記負載緩沖液通過如下方法配制配制10 mM Tris-HCl或磷酸鹽PBS緩沖液，其pH 7. 2-7. 5 ；用DMS0、醇溶液配制濃度為3-5 mM DCFH-DA的母液；用緩沖液配制的熒光標記負載液，含最終濃度為30-50 μ M的DCFH-DA、終濃度為50 mM的KCl和終濃度為2. 2-2. 8%的戊二醛，其中戊二醛的濃度為體積百分比；b.用刀片將小麥莖桿、葉片材料切成長度為O.4 - O. 6cm組織塊；c.用樣品標記負載緩沖液漂洗步驟b中的組織塊，然后置于步驟a中盛有樣品標記負載緩沖液的器皿中，密封后抽氣；d.在25°C下避光放置20-30分鐘；e.將步驟d中的材料放置在顯微鏡載玻片上，用激光激發裝置激發，在熒光顯微鏡下觀察CCD圖像采集系統拍照，顯微鏡工作條件為激發波長為460-500 nm,發散波長為 510-560 nm。
2.如權利要求I所述的小麥組織活性氧熒光標記方法，其特征在于，步驟b中所述的醇溶液為甲醇或者是乙醇中的任一種。
全文摘要
本發明屬于植物逆境脅迫與生理響應技術領域，特別涉及一種小麥生長發育過程中遭受生物逆境與非生物逆境脅迫下活性氧的產生、產生部位與相對含量的標記方法。該標記方法的步驟是配制標記負載緩沖液、準備材料組織塊、負載緩沖液漂洗組織塊、在25℃下避光放置、用激光激發裝置激發，觀察并拍照。本發明的方法相對于傳統的DAB、NBT等對活性氧種類的標記方法節省了時間，避免了樣品長時間標記負載期間活性氧含量及部位的失真；可在DCFH-DA對活性氧標記的同時，對材料進行固定，保證活性氧標記的精確性；所用的器材要求簡單，易于操作。
文檔編號G01N1/28GK102589942SQ201210015479
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者馮波, 司紀升, 孔令安, 張賓, 李升東, 王法宏 申請人:山東省農業科學院作物研究所