利用量子點檢測轉基因水稻中Bt蛋白的方法

專利名稱：利用量子點檢測轉基因水稻中Bt蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于作物轉基因成分的檢測技術領域，具體涉及利用量子點檢測轉基因水稻中Bt蛋白的方法，本發明與ELISA方法相關。
背景技術：
轉基因生物的安全評價是轉基因生物及其產品市場化和商品化的前提，在安全評價中轉基因成分的檢測是一項重要內容，建立轉基因生物快速、簡便、準確的檢測方法為安全評價和管理奠定基礎。我國對轉基因水稻的研究處于世界領先水平，其中，研發的一些抗病、抗蟲轉基因水稻品系已經申請生產種植用生物安全證書，但由于它們的轉基因生物安全問題等一些原因，至今尚未有品系批準商業化生產應用。鑒于轉基因水稻技術的成熟以及其產品市場化的趨勢，因此建立一種快速、簡便的檢測Bt蛋白的方法，具有必要性和緊迫性。目前對于轉基因成分的檢測可從外源基因的核酸和蛋白質兩個水平進行。核酸水平的檢測，主要針對轉入的外源基因的核苷酸序列并根據外源基因與內源基因的同源性設計檢測方法，主要采用的方法是PCR擴增，即依據轉入外源基因的啟動子、目的基因、終止子及表達(重組)載體信息，設計特異性引物，進行聚合酶鏈式反應，依據產物的有無或多少判斷是否為轉基因產品。PCR反應具有高靈敏度、高特異性、高效性的特點，是轉基因產品初篩階段的主要檢測方法。蛋白檢水平的檢測，主要是基于抗原和抗體相互作用的免疫學方法，針對轉基因植物及其產品中外源目的基因表達的特異性蛋白進行定性和定量檢測。1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚丙乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,簡稱 ELISA 方法)。1974 年 Voller 等人改用聚苯乙烯微量反應板作為固相免疫吸附載體，使ELISA方法得以推廣應用，使得用于抗原定位的酶標記抗體技術發展成為液體標本中微量物質的測定方法，并逐漸成為抗原抗體檢測中最為常用的一種方法。它將酶標記物同抗原抗體復合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合，既保持了酶催化反應的敏感性，又保持了抗原抗體反應的特異性，因而極大的提高了靈敏度。同時它又是一種非均相免疫分析方法，即在反應的每一步都有洗滌過程，從而除去了未反應物和干擾物質。由于ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測迅速和非放射性以及可以批量測定等諸多優點，使得ELISA方法得到了越來越廣泛的應用。但是隨著檢測靈敏度的要求越來越高，具有獨特熒光特性的量子點越來越受到人們的關注。量子點(quantumdots)是一種由II族 VI族或III族 V族元素組成的、穩定的、溶于水的、介于Inm IOOnm的、能夠接受激發光產生突光的半導體納米晶粒。當它的物理尺寸小于激子的玻爾半徑時，由于量子限制效應，使其具有獨特的光學和電子學性質。它的光學性質主要取決于它的半徑的大小，而與它的組成無關，通過改變量子點的大小就可以獲得從紫外到近紅外范圍內任意點的光譜。由于具有獨特的熒光特性，量子點與傳統的有機熒光染料相比具有以下優點:(I)具有寬的激發波長范圍和窄的發射波長范圍，即可以使用小于其發射波長IOnm的任意波長的激發光進行激發，這樣就可以使用同一種激發光同時激發多種量子點，發射出不同波長的熒光，因而可用于多種標記物的同時檢測。(2)量子點的發射峰窄而對稱，且連續分布，重疊小，這樣，在一個可檢測到的光譜范圍內可同時使用多個探針，而發射光譜不出現交疊，使生物分子的多組分分析檢測變得容易。而傳統的有機熒光染料的發射峰不僅寬，而且不對稱，拖尾嚴重，互相重疊嚴重，容易互相干擾，給分析檢測帶來難以解決的難題。(3)量子點的發射波長可通過控制它的大小和組成來調諧，可以任意合成所需波長的量子點，大小均勻的量子點譜峰為對稱高斯分布，而傳統的有機熒光染料的峰形則為對數正態分布。(4)量子點的熒光強度比最常用的有機熒光染料羅丹明6G染料高20倍，它的穩定性更是羅丹明6G染料的100倍以上，而且量子點抗光漂白能力強。(5)生物相容性好，尤其是經過各種化學修飾之后，可以進行特異性連接，細胞毒性低，對生物體危害小，可進行生物活體標記和檢測，而傳統的有機熒光染料一般毒性較大，生物相容性差。(6)熒光壽命長，典型的有機熒光染料的熒光壽命僅為幾納秒(ns)，這與很多生物樣本的自發熒光衰減的時間相當。而量子點的熒光壽命可持續長達數十納秒(20ns 50ns)，這使得當光激發數納秒以后，大多數的自發熒光背景已經衰減，而量子點熒光仍然存在，此時即可獲得無背景干擾的熒光信號。這些獨特的光學特性，使量子點成為了一種理想的熒光探針。因此，使用量子點代替有機熒光染料，將在分子標記、信號傳導、細胞內分子的運動和遷移等研究中發揮重要的作用。利用量子點標記抗體已經成功的用于對雞肉中的磺胺二甲嘧啶殘留進行了熒光免疫檢測。因此，利用量子點作為生物熒光探針，在免疫生物學和食品檢測等研究中有廣闊的應用前景。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種適用于轉基因水稻中Bt的高靈敏度快速檢測方法。本發明的方法基于量子點雙抗夾心熒光免疫吸附測定法原理，建立定量檢測轉基因水稻中Bt蛋白含量的檢測方法，本發明能準確快速、簡單、高靈敏度檢測出轉基因水稻中Bt蛋白含量，不需要特殊設備，為基層檢測人員提供一種快速簡便的方法，本發明的方法同時也為轉基因生物及其產品安全評價和管理提供借鑒。本發明的技術方案如下:一種利用量子點檢測轉基因水稻中Bt蛋白的快速簡便方法，其步驟如下:(I)抗CrylAb單克隆抗體的制備以CrylAb蛋白為抗原獲得兔血清,通過純化得到抗CrylAb單克隆抗體作為一抗，分泌該單克隆抗體的抗CrylAb單克隆抗體雜交瘤細胞 HHX-001保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CTCC NO:C201214。(2) CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體即二抗的制備I)將500 μ L羊抗免IgG抗體溶液分裝成10等份的50 μ L小管子，保存于_20°C冰箱內，待用時取出一小管，置于4°C冰箱處,備用；2)取25 μ L CdSe/ZnS量子點母液，20 μ L 1-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)端二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液和10 μ LN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液，ρΗ7.0，混合反應5min，再加入0.2mg羊抗免IgG抗體溶液，加無菌水配成100 μ L的標記物溶液，在常溫下反應2_4h ;將上述標記物溶液置磁力攪拌器中混勻，反應結束后置于4°C冰箱內過夜，得到CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體粗品；3)將CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體粗品100 μ L用加樣槍放入含有超濾膜的樣品儲存管中，在另一個管子中放入等量的水作為平衡，在轉速為10，OOOrpm，離心時間為20min，離心溫度為4°C的離心機中離心；4)在步驟3)的離心結束后，加入PBS緩沖液，按步驟3)的條件重復離心一次；5)在步驟4)離心結束后，向樣品儲存管中加入100 μ L PBS緩沖液，然后將其倒扣在離心管上，在轉速為500rpm，時間為3min，溫度為4°C的離心機中離心并回收樣品，即為二抗；(3) CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心的制備以抗CrylAb單克隆抗體為一抗，將該一抗與包被緩沖液按體積比1: 1000稀釋，然后加入到酶標板孔中，20°C孵育過夜，次日用PBS緩沖液洗板3次，每次5min，拍干后加封閉緩沖液，每孔200 μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min ；將 CrylAb 蛋白溶液用 PBS 緩沖液稀釋至 6.0pg/ml、12.5pg/ml、25.0pg/ml、50.0pg/ml、100.0pg/ml,200.0pg/ml梯度濃度后加于包被孔中，每孔100 μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min ;將純化后的二抗用PBS緩沖液稀釋至10.00ug/mL,加入酶標板的包被孔內.每孔100 μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液快速洗滌，得到CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心；(4)繪制CrylAb蛋白的標準曲線將0.4 μ g/ml 的 CrylAb 蛋白標準溶液稀釋為 200pg/mL、100, pg/mL、50, pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL和6pg/mL梯度濃度,用CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心檢測水稻CrylAb蛋白的含量，以該梯度濃度稀釋的CrylAb蛋白溶液濃度為自變量，以對應的CrylAb蛋白相對熒光強度值減去空白對照相對熒光強度值為應變量，繪制標準曲線,公式如下:Υ = 0.0137X+0.02 R2 = 0.994，X為系列梯度稀釋的CrylAb蛋白溶液濃度為自變量，Y為對應CrylAb蛋白相對熒光強度；(5)用酶標儀檢測0D450的值，判定待檢測水稻中CrylAb蛋白的含量；其中:CdSe/ZnS量子點母液的組分及配制:稱取0.0127g (0.1mmoI) CdO和0.1140g硬脂酸放入50mL的三頸瓶中，在氬氣保護下，加熱至130°C，使CdO充分溶解于硬脂酸中；將溫度降至室溫后，稱取三辛基氧化磷(TOPO)和十六烷基胺(HDA)各1.5g放入三頸瓶中，攪拌加熱到230°C，另稱取0.032g(Immol)硫粉，在氬氣保護下，使之溶解于2mL三辛基磷(TOP)中，抽入5mL的針管中作為儲備液；當Cd前驅物溫度達到230°C時，將Se粉儲備液快速注入三頸瓶后，使溫度降至180°C,保持IOmin,收集CdSe樣品溶于氯仿中備用；稱取0.632g的硬脂酸鋅和0.032g的硫粉分別加入2mL的十八碳烯(ODE)中加熱至120°C充分溶解，分別得到硬脂酸鋅溶液和硫粉溶液，降溫至70°C，將硬脂酸鋅溶液和硫粉溶液混合后于70°C下保存備用；將分散于氯仿中的CdSe樣品加入瓶中，加熱至120°C保持30m in,蒸干氯仿,升溫至200°C ;抽取硬脂酸鋅和硫粉的十八碳烯溶液，以0.2mL/m in注入ZnS殼層，注入完成后，升溫至230°C保持lh，降溫至60°C，反應產物用甲醇沉化，離心清洗三次，得到CdSe/ZnS氯仿溶液；取CdSe/ZnS氯仿溶液、巰基丙酸和去離子水各ImL放入瓶中混合，強烈攪拌3h，(量子點即由最初的氯仿溶液中轉移進入水溶液中，這是一種化學現象，不可以寫在權利要求書中，只能寫在說明書中，帶有推理性質，權利要求不保護自然現象現象和規律、機理等理論成果)，抽取上層水溶液，加甲醇離心清洗三次，后分散于去ImL去離子水中即獲得CdSe/ZnS量子點母液；PBS緩沖液組分及配制:KH2P04 0.2g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na2HP04 2.9g, Tween-20 0.5mL，加蒸餾水定容至1L，調pH至7.4;包被緩沖液的組分及配制:Na2C03 1.59g, NaHC03 2.93g，加蒸餾水定容至 IOOOmL ；封閉緩沖液組分及及配制:將牛血清白蛋白0.1g溶于IOOmL PBS緩沖液中。將上述分泌CrylAb蛋白的單克隆抗體的抗CrylAb單克隆抗體雜交瘤細胞HHX-001，于2012年I月6日送交中國.武漢.武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為 CCTCC NO:C201214。本發明建立了運用量子點標記抗體的雙抗夾心熒光免疫吸附測定法定量檢測轉基因水稻中的CrylAb蛋白的新方法。該方法對標準蛋白的濃度最低可檢值為9pg/mL，線性檢測范圍為6 200pg/mL ;回收率在91.6 105.9 ;變異系數在3.0 12.6。并且用該方法對轉基因水稻和非轉基因水稻中Bt蛋白進行定量檢測，結果表明量子點標記抗體的雙抗夾心熒光免疫吸附測定法適合轉基因水稻的定量檢測。本發明所設計的轉基因水稻中Bt蛋白簡單實用的檢測方法。與其它傳統檢測方法相比該發明有以下優點:1.本發明經濟實用:反應是在恒溫的條件下進行，所以不需要昂貴的PCR儀，而且檢測周期比較短。2.本發明的靈敏度高:該方法對標準Bt蛋白的最低檢測濃度為9pg/mL，比常規ELISA法的檢測靈敏度高800-1000倍。3.本發明檢測簡單:該方法檢測轉基因水稻中Bt蛋白結果客觀、易判定，可對轉基因產品的含量進行定量分析。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》所述。


圖1:是本發明的量子點雙抗夾心熒光免疫吸附測定法機理示意圖。圖2:是本發明的技術流程圖。圖3:是CdTe量子點的TEM電鏡圖像。圖4:是CdTe量子點標記羊抗免IgG的發射光譜圖像。圖5:CdTe量子點標記羊抗免IgG的電泳6:量子點雙抗夾心熒光免疫吸附測定法檢測CrylAb蛋白的濃度標準曲線圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步說明，但不是限制本發明。實施例1從蘇云金芽胞桿菌基因組中分離得到CrylAb蛋白CrylAb蛋白的制備委托上海麗臣生物科技有限公司完成，具體步驟如下:將儲存于_70°C冰箱中的蘇云金芽胞桿菌菌株(kurstaki HD-1，一種公開報道的菌株，參見文獻:Linda Thorne， Fermin Garduno, Ted Thompson， Debra Decker， Maryann Zounes， MarthaWild, Alan m.Walfield, And Thomas J.Pollock*，Structural Similarity between theLepidoptera-and Diptera-Specific Insecticidal Endotoxin Genes of Bacillusthuringiensis subsp〃 kurstaki!f and 〃 israelensis〃 , Journal of Bacteriology,June 1986，p.801-811)，劃線到LB平板上30°C生長過夜，挑單菌落到IOmL的LB培養基于30°C振蕩培養過夜。再將過夜培養的菌液加入200mL的PGSM培養基中于30°C振蕩培養3-4天后，在顯微鏡下觀察細胞可以看到裂解的細胞。然后4°C，4000rpm離心15min收集培養物，用冰冷的0.lmol/L NaCl洗滌沉淀一次，4°C，4000rpm離心15min收集培養物，再用冰冷的雙蒸水洗滌沉淀一 次，在4°C，4000rpm離心15min收集培養物，將沉淀懸浮于15mL冰冷的純水中。再將溶液于4°C，4000rpm離心15min收集沉淀，該沉淀即為CrylAb蛋白。將沉淀懸浮于0.1mol/LNaOH中15min使CrylAb蛋白完全溶解,馬上用lmol/LTris緩沖溶液調節溶液的pH至7.0，于12000rpm離心IOmin后，取上清液用100倍體積的PBS溶液透析三次。采用Bradford法測定其濃度；其中:所述的試劑組分及其配比如下:LB 培養基:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 10g/L，NaOH調節該培養基的pH，使其達到7.4 ；PGSM培養基:細菌蛋白胨7.5g，葡萄糖lg，KH2P04 3.4g，K2HP04 4.35g，加蒸餾水定容至1L，調pH至7.2，121°C高溫蒸汽下滅菌30min ；PBS 緩沖液:KH2P04 0.2g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na2HP04 2.9g, Tween-200.5mL,加蒸懼水定容至1L,調pH至7.4 ;Tris緩沖溶液:50ml 0.lmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液用0.lmol/L鹽酸調節pH至7.0,加水稀釋至100ml。實施例2抗CrylAb單克隆抗體(一抗)的制備(I)抗CrylAb單克隆抗體的制備本實施例參照薛慶善《體外培養的原理與技術》科學出版社2001年版中報道的方法進行。具體方法如下:采用背部多點注射的方法免疫家兔，用實施例1中得到的CrylAb蛋白于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，每點注射0.lmL，間隔兩周后再于上述部位選不同點注射。每次免疫的CrylAb蛋白量約100 μ g。免疫次數在四五次即可，抗原用量大可以減少次數。兔子購回飼養一周左右，進行第一次免疫，第一次免疫2-4周后進行第二次免疫，之后每隔7-10天免疫一次。免疫一周后，可于耳動脈取血既得抗CrylAb單克隆抗體粗品。(2)抗CrylAb單克隆抗體的純化利用固定在NC膜上的抗原親和純化特異性對抗CrylAb單克隆抗體進行純化。具體方法如下:I)在ImL兔血清中加0.1mL的質量分數為10%十二烷基硫酸鈉水溶液(即SDS)，0.0lmL的β -巰基乙醇，于10CTC下水浴5min ；2)加IOOuL 10 X SDS-PAGE緩沖液(購于上海寶曼生物科技有限公司)，混勻；3)灌膠，上層質量分數為5 %，下層質量分數為8%的SDS-PAGE膠；4)根據膠孔大小決定蛋白上樣量(一般蛋白上樣量為20或40uL)，并點預染蛋白marker ；5)電泳，濃縮膠(電泳儀的電壓為80V)，分離膠(電泳儀的電壓為120V)；6)轉膜前，先切去SDS-PAGE膠的多余部分，將膠置于轉移緩沖液(購于上海寶曼生物科技有限公司)中15min。剪與膠等大的濾紙8張，NC膜I張以及海綿浸于轉移緩沖液中15min。7)打開膜轉移夾；①依次放入(每層排除氣泡):兩層海綿，四層濾紙，NC膜，再放四層濾紙，兩層海綿。剪去多余的NC膜和濾紙；②將轉移夾合上并固定，膠對著負極，置于電泳槽中；③加上轉移緩沖液(電泳儀的電壓為5V)轉膜過夜；8)用麗春紅染液染色；①取出膜置于培養皿中，加麗春紅染液染色5-10min ；②倒去麗春紅染料，用去離子水洗兩遍，直至條帶顯色。9)抗體結合①剪刀剪下目的條帶，置于培養皿中，加IXPBS緩沖液(配方如后所述)，脫色約IOmin ；②棄去PBS緩沖液，加質量分數為3%牛血清白蛋白(BSA，用IXPBS緩沖液現配)，置于搖床上輕搖，封閉Ih;③棄去BSA，加入新鮮的質量分數為3%的BSA(用I XPBS緩沖液現配)，再加入0.5mll中得到的抗CrylAb單克隆抗體。于4°C搖16h或者16°C搖5h ；④棄去牛血清白蛋白，用IXPBS緩沖液洗5次，每次5min ；10)抗體回收將NC膜剪成0.5cm2大小的碎片，放入EP管中，加入500uL洗脫緩沖液(0.2mol/L甘氨酸)，靜置20min ;轉移至新的EP管中，加入50 μ L lmol/L三羥甲基氨基甲烷以及60uL10XPBS緩沖液混勻，4°C保存。取200uL檢測抗CrylAb單克隆抗體效價。
(3)抗CrylAb單克隆抗體的保存將上述制備成功的抗CrylAb單克隆抗體與雜交瘤細融合(具體操作方法參考:薛慶善，《體外培養的原理與技術》科學出版社2001年版中報道的方法)，篩選分泌抗CrylAb單克隆抗體雜交瘤細胞HHX-001 (該雜交瘤細胞保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CTCC NO:C201214)。(4)運用間接ELISA法測定抗CrylAb單克隆抗體效價I)抗原包被將所制備的CrylAb蛋白用0.05mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液(配方如后所述)以體積比1: 500稀釋，包被96孔聚苯乙烯反應板，IOOuL/孔，置4°C過夜；次日用PBS質量分數為洗液洗滌3次，每次間隔lOmin，拍干后加入質量分數為10% BSA的PBS緩沖液進行封閉，200uL/孔，37°C濕盒封閉Ih后，用PBS緩沖液洗滌3次，每次lOmin，
拍干。置4°C冰箱保存備用。2)加待檢抗體用PBS緩沖液稀釋牛血清白蛋白配成含牛血清白蛋質量分數為0.1%牛血清白蛋白溶液(牛血清白蛋白取自免疫后的兔耳動脈血清)，加入包被好的反應板中，同時設立陰性對照和空白對照，IOOuL/孔，在37°C下作用lh，用PBS緩沖液洗滌3次，每次IOmin拍干。3)加酶標二抗將商購堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗兔IgG(購于上海麗臣生物科技有限公司)按推薦濃度1: 1000(體積比)倍稀釋，IOOuL/孔，于37°C下反應lh，用PBS緩沖液洗滌3次，每次IOmin拍干。4)顯色于各反應孔中加入臨時配制的NPP溶液，75uL/孔，于37°C或室溫下避光顯色 30_60min。5)終止反應于各反應孔中加入25uL 0.5mol/L NaOH終止反應。6)結果判定在酶標儀于OD45tl處讀數，將空白對照孔調零后，測各孔值。其中:所述的試劑組分及其配比如下:碳酸鹽緩沖液:Na2C03 1.59g，NaHC03 2.93g，加蒸餾水定容至lOOOmL，調pH9.6 ；PBS 緩沖液=KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na2HDO4 2.9g, Tween-20 0.5mL,加蒸餾水定容至1L，調pH至7.4 ;NPP 溶液:5ml lmmol/L MgCl2, 2.5ml lmmol/L ZnCl2,1.5ml 0.lmol/L 甘氛酸,用0.lmol/L NaOH 調節 pH 至 10.4。實施例3水溶性CdSe/ZnS量子點的制備水溶性CdSe/ZnS量子點的制備參照文獻報道的方法(Xie HY, Liang JG, Liu Y，Zhang ZL, Pang Dff, He ZK, et al.Preparation and characterization of overcoatedI1-VI quantum dots.J Nanosci Nanotechnol 2005 ；5:880e6),具體步驟是:稱取0.0127g(0.1mmoI)CdO和0.1140g硬脂酸放入50mL的三頸瓶中，在氬氣保護下，加熱至130°C，使CdO充分溶解于硬脂酸中。將溫度降至室溫后，稱取三辛基氧化磷(Τ0Ρ0)和十六烷基胺(HDA)各1.5g放入三頸瓶中，攪拌加熱到230°C，另稱取0.032g(Immol) S粉，在氬氣保護下，使之溶解于2mL三辛基磷(TOP)中，抽入5mL的針管中作為儲備液。當Cd前驅物溫度達到230°C時，將Se粉儲備液快速注入三頸瓶后，溫度降至180°C，保持lOmin，收集CdSe樣品溶于氯仿中備用。稱取0.632g的硬脂酸鋅和0.032g的硫粉分別加入2mL的十八碳烯(ODE)中加熱到120°C充分溶解，降溫到70°C，得到硬脂酸鋅溶液和硫粉溶液，將上述兩種溶液混合在一起于70°C下保存備用。將分散于氯仿中的CdSe樣品加入瓶中，加熱至120°C，保持30min，蒸干氯仿，升溫至200°C。抽取硬脂酸鋅和硫粉的十八碳烯溶液，以0.2mL/min的流速注入ZnS殼層，注射完成后，升溫至230°C，保持Ih，再降溫至60°C，反應產物用甲醇沉化，離心清洗三次，得到CdSe/ZnS氯仿溶液。取CdSe/ZnS氯仿溶液、巰基丙酸和去離子水各ImL放入瓶中混合，強烈攪拌3h，量子點即由最初的氯仿溶液中轉移進入水溶液中，抽取上層水溶液，加甲醇離心清洗三次，后分散于去ImL去離子水中既得CdSe/ZnS量子點母液。然后，對了其進行透射電子顯微鏡、熒光光譜表征(見圖3、圖4所示)。實施例4CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體即二抗的制備I)將500 μ L羊抗免IgG抗體溶液(購于上海麗臣生物科技有限公司)分裝成10等份的50 μ L小管子，保存于-20°C冰箱處，待用時取出一小管，置于4°C冰箱處，備用；2)取25 μ L實施例3得到的CdSe/ZnS量子點母液，20 μ L 1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)端二亞胺鹽酸鹽溶液(EDC溶液)和10 μ LN-羥基琥珀酰亞胺溶液(NHS溶液，ρΗ7.0)混合反應5min,再加入0.2mg羊抗免IgG抗體溶液,加無菌水配成100 μ L的標記物溶液，在常溫下反應2-4h ;將所述的標記物溶液置磁力攪拌器中混勻，使其反應均勻，反應結束后置于4 °C冰箱內過夜,得到CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體粗品；3)將步驟I制備CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體粗品IOOyL用加樣槍放入含有超濾膜的樣品儲存管中，在另一個管子中放入等量的水作為平衡，在轉速為10，OOOrpm，離心時間為20min，離心溫度為4°C的離心機中離心；4)在步驟3)的離心結束后，加入PBS緩沖液，按步驟3)的條件重復離心一次；5)在步驟4)離心結束后，向樣品儲存管中加入100 μ L PBS緩沖液，然后將其倒扣在離心管上，在轉速為500rpm，時間為3min，溫度為4°C的離心機中離心并回收樣品，即為二抗；實施例5CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心的制備以CrylAb單克隆抗體為一抗，在酶標板孔中加入由包被緩沖液稀釋(CrylAb單克隆抗體與包被緩沖液體積比1: 1000)的CrylAb單克隆抗體，于20°C孵育過夜，次日用PBS緩沖液洗板3次，每次5min，拍干后加封閉緩沖液，每孔200 μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min ;將CrylAb蛋白溶液用PBS緩沖液稀釋至6.0pg/ml、12.5pg/ml、25.0pg/ml、50.0pg/ml> 100.0pg/ml、200.0pg/ml 梯度濃度后加于包被孔中，每孔100μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min ;將純化后的二抗經PBS 緩沖液稀釋至 1.25ug/mL、2.50ug/mL、5.00ug/mLU0.00ug/mL、20.0Oug/mL 分別作為二抗的工作濃度，加于包被孔內.每孔100μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液快速洗漆，得到CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心。其中:所述的包被緩沖液的組分及配比如下:Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g，加蒸餾水定容至 IOOOmL ；
所述的封閉緩沖液組分及配比如下:將牛血清白蛋白0.1g溶于IOOmLPBS緩沖液中。實施例6CrylAb蛋白的濃度標準曲線建立將CrylAb蛋白標準溶液(購于上海麗臣生物科技有限公司，0.4 ii g/ml)精確稀釋為6個梯度濃度，分別為200，100，50，25，12.5，6pg/mL，用量子點雙抗夾心法來檢測水稻Bt蛋白，以上述梯度稀釋的CrylAb蛋白標準溶液濃度為自變量，以對應的CrylAb蛋白相對熒光強度值減去空白對照相對熒光強度值為應變量，繪制標準曲線，得到如圖6所示的CrylAb蛋白的濃度標準曲線計算公式，該公式如下所示:Y = 0.0137X+0.02 R2 = 0.994。X為系列梯度稀釋的CrylAb蛋白溶液濃度為自變量；Y為對應CrylAb蛋白相對熒光強度。以上述CrylAb蛋白的濃度標準曲線作為判斷待檢測水稻中CrylAb蛋白含量的標準。實施例7CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心ELISA檢測方法的靈敏度驗證確定抗原包被濃度和抗體最佳工作濃度。具體步驟是:將純化的CrylAb蛋白質用 pH9.6 的包被緩沖液按 1: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I: 1600、I: 3200 (相當于每 IOOii L 中 CrylAb 蛋白質含量分別為 2.0 u g,l.0 u g,0.5 u g,0.25y g、0.125 u g, 0.0625 ii g，依次加入酶標板的各孔中(lOOii L/孔)，每個稀釋度為兩列，于4°C過夜。次日用PBS緩沖液洗滌3次，每次間隔lOmin，用10% BSA封閉后(200 y L/孔)，于37°C保存Ih后，再用PBS緩沖液洗滌3次，每次lOmin，拍干，再分別將免疫后的兔耳動脈血清和未免疫的兔耳動脈血清作 1: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I: 1600、I: 3200、I: 6400 的倍比稀釋。用方陣實驗進行測定。每塊板中均留4孔，其中兩孔加入未免疫的兔耳動脈血清作為陰性對照，另外兩孔加入100 u L PBST作為空白對照。(I)建立間接ELISA方法判定標準用酶標儀檢測OD450的值。以空白對照調零，P為各檢測孔的值，N為陰性對照的平均值，即P/N ^ 2.0，并且0D450值接近于I的免疫后的兔耳動脈血清的稀釋度作為最佳工作濃度。(2)間接ELISA實驗方陣結果經過方陣實驗確定，從表I中可以看出，免疫后的兔耳動脈血清在以0.5 ii g/孔的抗原量包被酶標板，免疫后的兔耳動脈血清最佳稀釋度為1: 1600稀釋時，P = 1.015，N=0.186，P/N = 5.46，遠高于2.0，因此將該數值處的CrylAb蛋白質、免疫后的兔耳動脈血清稀釋度作為間接ELISA篩選方法的最佳工作濃度。表I本發明的量子點ELISA法檢測CrylAb蛋白質的精密度和準確度比較

權利要求
1.一種檢測轉基因水稻中CrylAb蛋白的快速簡便方法，其特在于如下步驟: (1)抗CrylAb單克隆抗體的制備 以CrylAb蛋白為抗原獲得兔血清,通過純化得到抗CrylAb單克隆抗體作為一抗,分泌該單克隆抗體的抗CrylAb單克隆抗體雜交瘤細胞HHX-OOl保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為 CTCC NO:C201214o (2)CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體(即二抗)的制備 1)將500μ L羊抗免IgG抗體溶液分裝成10等份的50 μ L小管子，保存于_20°C冰箱內，待用時取出一小管，置于4°C冰箱處,備用； 2)取25μ L 0(^6/21^量子點母液，2(^1^ 1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)端二亞胺鹽酸鹽溶液和10 μ LN-羥基琥珀酰亞胺溶液，ρΗ7.0,混合反應5min，再加入0.2mg羊抗免IgG抗體溶液，加無菌水配成100 μ L的標記物溶液，在常溫下反應2_4h ;將上述標記物溶液置磁力攪拌器中混勻，反應結束后置于4°C冰箱內過夜，得到CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體粗品； 3)將CdSe/ZnS量子點標記的羊抗免IgG抗體粗品100μ L用加樣槍放入含有超濾膜的樣品儲存管中，在另一個管子中放入等量的水作為平衡，在轉速為10，OOOrpm，離心時間為20min，離心溫度為4°C的離心機中離心； 4)在步驟3)離心結束后，加入PBS緩沖液，按步驟3)的條件重復離心一次； 5)在步驟4)離心結束后，向樣品儲存管中加入100μ L PBS緩沖液，然后將其倒扣在離心管上，在轉速為500rpm，時間為3min，溫度為4°C的離心機中離心并回收樣品，即為二抗； (3)CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心的制備 以抗CrylAb單克隆抗體為一抗，將該一抗與包被緩沖液按體積比1: 1000稀釋，然后加入到酶標板孔中，20°C孵育過夜，次日用PBS緩沖液洗板3次，每次5min，拍干后加封閉緩沖液，每孔200 μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min ;將CrylAb蛋白溶液用 PBS 緩沖液稀釋至 6.0pg/ml、12.5pg/ml、25.0pg/ml、50.0pg/ml、100.0pg/ml、·200.0pg/ml梯度濃度后加于包被孔中，每孔100μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5min ;將純化后的二抗用PBS緩沖液稀釋至10.00ug/mL,加入酶標板的包被孔內.每孔100 μ L，于37°C下靜置lh，之后用PBS緩沖液快速洗滌，得到CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心； (4)繪制CrylAb蛋白的標準曲線將 0.4 μ g/ml 的 CrylAb 蛋白標準溶液稀釋為 200pg/mL、100, pg/mL、50, pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL和6pg/mL梯度濃度,用CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心檢測水稻CrylAb蛋白的含量，以該梯度濃度稀釋的CrylAb蛋白溶液濃度為自變量，以對應的CrylAb蛋白相對熒光強度值減去空白對照相對熒光強度值為應變量，繪制標準曲線，公式如下:Υ = 0.0137X+0.02 R2 = 0.994， X為系列梯度稀釋的CrylAb蛋白溶液濃度為自變量， Y為對應CrylAb蛋白相對熒光強度； (5)用酶標儀檢測OD45tl的值，判定待檢測水稻中CrylAb蛋白的含量； 其中:所述的CdSe/ZnS量子點母液的組分及配制: 稱取0.0127g，0.1mmol的CdO和0.1lg的硬脂酸放入50mL的三頸瓶中，在氬氣保護下，加熱至130°C，使CdO充分溶解于硬脂酸中；將溫度降至室溫后，稱取三辛基氧化磷和十六烷基胺各1.5g放入三頸瓶中，攪拌加熱到230°C，另稱取0.032g, Immol的硫粉，在氬氣保護下，使之溶解于2mL三辛基磷中，抽入5mL的針管中作為儲備液；當Cd前驅物溫度達到230°C時，將Se粉儲備液快速注入三頸瓶后，使溫度降至180°C，保持lOmin，收集CdSe樣品溶于氯仿中備用； 稱取0.632g的硬脂酸鋅和0.032g的硫粉分別加入2mL的十八碳烯中加熱至120°C充分溶解，分別得到硬脂酸鋅溶液和硫粉溶液，降溫至70°C，將硬脂酸鋅溶液和硫粉溶液混合后于70°C下保存備用；將分散于氯仿中的CdSe樣品加入瓶中，加熱至120°C保持30min，蒸干氯仿，升溫至200°C ;抽取硬脂酸鋅和硫粉的十八碳烯溶液，以0.2mL/min注入ZnS殼層，注入完成后，升溫至230°C保持lh，降溫至60°C，反應產物用甲醇沉化，離心清洗三次，得到CdSe/ZnS氯仿溶液；取CdSe/ZnS氯仿溶液、巰基丙酸和去離子水各ImL放入瓶中混合，強烈攪拌3h，抽取上層水溶液，加甲醇離心清洗三次，后分散于ImL去離子水中即獲得CdSe/ZnS量子點母液； 其中: PBS緩沖液組分 及配制:KH2PO4 0.2g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na2HPO4 2.9g, Tween-20 0.5mL，加蒸餾水定容至1L，調 pH 至 7.4 ; 包被緩沖液組分及配制: Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加蒸餾水定容至 IL ； 封閉緩沖液組分及配制: 將牛血清白蛋白0.1g溶于IOOmL PBS緩沖液中。
2.—種分泌CrylAb蛋白的單克隆抗體的抗CrylAb單克隆抗體雜交瘤細胞HHX-OOl,保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:C201214。
3.權利要求2所述的雜交瘤細胞HHX-OOl分泌的單克隆抗體在檢測轉Bt基因水稻中的應用。
全文摘要
本發明屬于轉基因成分的檢測技術領域，具體涉及一種利用量子點檢測轉基因水稻中轉Bt蛋白的快速簡便檢測方法。該方法包括以抗CrylAb單克隆抗體為一抗，量子點(QDs)標記羊抗兔IgG為二抗，制備得到CdSe/ZnS量子點標記的抗CrylAb蛋白雙抗體夾心，建立了檢測水稻Bt蛋白的雙抗夾心熒光免疫吸附測定法，該方法對CrylAb標準蛋白的濃度最低可檢值為9pg/mL，線性檢測范圍為6～200pg/mL，回收率在91.6～105.9，變異系數在3.0～12.6。本發明的量子點雙抗夾心熒光免疫吸附測定法適合轉基因水稻的定量檢測，其特點是快速、簡單和高靈敏度高。
文檔編號G01N33/531GK103197075SQ20121001355
公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者劉軍安, 韓宇, 華紅霞, 鄒鉛, 高美虹, 陳長水 申請人:華中農業大學