專利名稱：一種利用量子點共振散射定量檢測蛋白質的方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質檢測技術領域，具體說，涉及量子點共振散射方法檢測分析蛋白質含量的應用的方法。
背景技術：
蛋白質是一種由氨基酸組成的生物大分子，是生命活動的物質基礎，沒有蛋白質就沒有生命。蛋白質的定量測定對于生化分析和臨床醫學具有重要的意義。常用的蛋白質測定方法有分光光度法(凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍法)和熒光光度法，但這些方法大多靈敏度不高，穩定性較差。隨著蛋白質組學的發展，人們需要定量分析濃度更低的生物樣品或提純的蛋白質，因此尋找新的檢測方法提高蛋白質測定的靈敏度具有重要的意義。光散射是指一束光線通過介質時在入射光以外的方向上觀察的光現象，它是電磁輻射與物質相互作用的一種表現形式。光散射技術在物理化學、膠體化學、高分子化學研究中具有十分重要的地位。由于傳統的光散射技術不能滿足定量分析在準確度和精密度方面的要求，未能在分析化學中推廣應用。1993年I^sternack等用特殊的共振光散射技術研究了卟啉類化合物在核酸上的聚集，從而首次將該技術與化學過程聯系起來。黃承志等利用這種技術研究了生物大分子體系的散射光譜，建立了共振光散射技術定量測定生物大分子的新的高靈敏度分析方法。目前這種技術被廣泛應用于核酸、蛋白質、肝素、多糖等生物大分子的研究和測定。量子點有獨特的光學特性，量子點獨特的性質基于它自身的量子效應，當顆粒大小到達納米級時，尺寸限域將引起尺寸效應、量子限域效應、宏觀量子隧道效應和表面效應，從而派生出與常觀體系和微觀體系不同的低維物性的納米體系，展現出許多不同于宏觀體材料的物理化學性質。這些特性在非線性光學、磁介質、生物、醫藥及功能材料等方面具有極為廣闊的應用前景。對現有文獻的報道中，雖然分別有有機染料或金屬離子指示劑對生物大分子蛋白質和核酸結合的共振散射光譜分析，以及量子點共振散射特性的分析，但是至今尚未未有過利用量子點共振散射來定量檢測蛋白質的文獻報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用量子點定量檢測蛋白質的方法，能夠靈敏地檢測出蛋白質含量。量子點顆粒具有散射性質及光學特性，通過靜電引力和范德華力吸附不同濃度的蛋白質，在可見光波長范圍內能產生共振散射光，并有最大吸收波長。本發明利用上述特性和原理，在可見光波長范圍內進行同步熒光檢測，在一定的蛋白質濃度范圍內，最大吸收波長的散射強度變化存在相關性，能夠檢測出很低濃度的蛋白質。技術方案為，一種利用量子點定量檢測蛋白質的方法，包括如下步驟
將量子點懸浮分散于蛋白質溶液中，在456 466nm下進行同步熒光檢測，測定散射強度，并與標準曲線對比得到蛋白質濃度；量子點與蛋白質溶液的用量比為5 10X10_7mol/ml。優選的，量子點與蛋白質溶液的用量比為7 9X 10_7mol/ml。熒光檢測條件為發射和散射光柵為5nm，電壓為400V。所檢測的蛋白質為BSA或γ-球蛋白。所述量子點結構包括內核和表面包被的SiO2外殼；內核粒徑為3 lOnm，為SiS/ ZnO量子點異質結構。這種量子點的制備方法包括如下步驟(1)將S1(Ac)2和CH3CSNH2加入1，4_ 丁二醇中，超聲分散直至形成透明前驅體溶液；Zn (Ac)2與CH3CSNH2摩爾比為1 0. 25 0. 7 (Ac) 2與1，4-丁二醇用量比為0. 1 0.4mol/L ；(2)步驟(1)所得到的前驅體溶液轉移至水熱反應釜中，190 220°C下反應16 20h;冷卻至室溫后，加入蒸餾水混勻，離心分離取沉淀洗滌干燥即得SiS/ZnO量子點異質結構；(3)ZnS/ZnO量子點異質結構溶解于乙醇中，加入氨水，攪拌下加入正硅酸乙酯溶液，繼續反應10 15小時，取沉淀洗滌干燥；ZnS/ZnO量子點異質結構與乙醇、正硅酸乙酯用量比為 Immol 300 600ml 1 2ml。標準曲線的構建方法包括以下步驟將量子點加入蛋白質含量為0 0. 4μ M的溶液中分散均勻，檢測散射強度，以蛋白質濃度為橫坐標，散射強度變化為縱坐標繪制標準曲線。本發明利用量子點通過靜電作用吸附蛋白質，在可見光波長范圍內能產生共振散射光來檢測標準牛血清蛋白(BSA)和Y-球蛋白，以蛋白濃度(mol/L)為橫坐標，以散射波長最大強度變化為縱坐標繪制標準曲線，通過散射強度變化可以由回歸方程計算出蛋白質濃度。本發明還利用不同粒徑大小的量子點對BSA和Y-球蛋白等進行了檢測，發現蛋白質濃度與散射強度都存在較好的相關性，相關系數達到0. 95 0. 99，斜率都達到107，靈敏度較高，且穩定性好，檢測時間對結果影響不大，為定量檢測生物大分子蛋白質的濃度開創了一種實用的新方法。在可見光范圍內先測定不同空量子點的同步散射，再配制較低濃度的標準蛋白溶液，加入到不同量子點溶液中并吸附在量子點顆粒表面進行測定。以蛋白質濃度為橫坐標， 以最大散射強度變化為縱坐標繪制標準曲線，進而通過回歸方程可以用計算蛋白質的濃度，從而為蛋白質檢測提供了靈敏的檢測方法。本發明的有益效果是，結合量子點的熒光特性以及生物學技術原理，利用熒光檢測蛋白質的方法，具有靈敏度高、穩定性好、經濟實用等特點，能夠廣泛應用于生物學蛋白質微量定量檢測領域，為農業質量檢測、食品營養標準檢測、轉基因檢測領域中蛋白質含量的檢測提供了很好的方法，能夠快速而準確地得到結果。
圖1為1號量子點檢測BSA的共振散射譜
圖2為1號量子點檢測BSA的標準曲線
圖3為2號量子點檢測BSA的共振散射譜
圖4為2號量子點檢測BSA的標準曲線圖5為3號量子點檢測BSA的共振散射譜圖6為3號量子點檢測BSA的標準曲線圖7為4號量子點檢測BSA的共振散射譜圖8為4號量子點檢測BSA的標準曲線圖9為1號量子點檢測Y-球蛋白的共振散射譜圖10為1號量子點檢測Y-球蛋白的標準曲線圖11為2號量子點檢測Y-球蛋白的共振散射譜圖12為2號量子點檢測Y-球蛋白的標準曲線圖13為3號量子點檢測Y-球蛋白的共振散射譜圖14為3號量子點檢測Y-球蛋白的標準曲線圖15為4號量子點檢測Y-球蛋白的共振散射譜圖16為4號量子點檢測Y-球蛋白的標準曲線
具體實施例方式實施例1l)ZnS/ZnO量子點異質結構制備首先將2mmol Si(Ac)2和1. 4mmoICH3CSNH2加入 20ml 1，4-丁二醇中，超聲分散直至形成透明前驅體溶液；然后將得到的溶液轉移至30mL 水熱反應釜(內襯聚四氟乙烯)中，200°C下反應18h;待水熱反應釜自然冷卻至室溫后，在所得產物中加入10 20ml蒸餾水混勻，SOOOrpm離心分離，所得沉淀用乙醇清洗三次除去雜質，60°C干燥證即得SiS/ZnO量子點異質結構，粒徑為3 4nm。2)包硅步驟將0. Immol ZnS/ZnO量子點溶于40mL乙醇中，加入0. 5mL28wt%氨水混勻，然后在持續攪拌狀態下緩慢加入0. ImL TE0S，繼續攪拌反應12h。離心分離得沉淀， 蒸餾水清洗兩次即得SW2包裹的SiS/ZnO量子點異質結構，粒徑基本不變。所得到的SW2包裹的SiS/ZnO量子點用1號量子點表示。步驟1)中加入的2mM Si(Ac)2和分別為4、6、8mmol，其余條件不變，得到的SiS/ ZnO量子點異質結構粒徑分別為5 6、7 8和9 IOnm ；包硅的方法同步驟2)，所得到的SW2包裹的SiS/ZnO量子點分別用2、3、和4號量子點表示。實施例2以牛血清蛋白(BSA)的檢測為例(一 )量子點溶液和蛋白質溶液的配制1 4號量子點原濃度均為為5 X 10_5mOl/L，用雙蒸水進行60倍稀釋，使用前進行 15min的超聲使其均勻懸浮。BSA配成濃度為10_4mol/L，備用。BSA購自北京索萊寶生物科技公司。( 二 )檢測與繪制標準曲線待儀器預熱平穩后，取3mL其中一種粒徑的純量子點于比色皿中，在250-750nm處進行熒光同步檢測，發射光柵和散射光柵都為5nm，電壓為400V，散射強度為F。。然后再分別加10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100 μ L 濃度為 l(T4mol/L 的 BSA 溶液；每一步都進行歸零的檢測，散射強度為Fn。發現這種ais和aio量子點的最大散射波長大約都在461 士5nm左右，以蛋白質濃度為橫坐標，取最強散射處波長的散射強度變化Fn-F0為縱坐標繪制標準曲線。依次對不同粒徑的量子點進行檢測比較。1 4號量子點檢測BSA的共振散射圖譜及標準曲線圖如圖1 8所示。1 4號量子點檢測BSA的共振散射圖譜如圖1、3、5、7所示，曲線自下而上分別為BSA濃度為0及加入上述不同量BSA溶液的圖譜。1 4號量子點檢測BSA的標準曲線圖如圖2、4、6、8所
7J\ ο實施例3檢測Y -球蛋白(一 )量子點溶液和蛋白質溶液的配制1 4號量子點原濃度均為為5X 10_5mol/L，用雙蒸水進行60倍稀釋，用前進行 15min的超聲使其均勻懸浮。Y-球蛋白配成濃度為10_4mol/L，備用。Y -球蛋白購自北京索萊寶生物科技公
司ο( 二)檢測與繪制標準曲線待儀器預熱平穩后，取3mL其中一種粒徑的純量子點于比色皿中，在250-750nm處進行熒光同步檢測，發射光柵和散射光柵都為5nm，電壓為400V，散射強度為&。然后再加分別10、20、30、40、50、60、70和8(^1^農度為KTW/L的Y -球蛋白，每一步都進行歸零的檢測，散射強度為Fn。發現這種SiS/ZnO量子點的最大散射波長大約都在461nm左右，以蛋白質濃度為橫坐標，取最強散射處波長的散射強度變KFn-Ftl為縱坐標繪制標準曲線。依次對不同粒徑的量子點進行檢測比較。1 4號量子點檢測Y-球蛋白的共振散射圖譜及標準曲線圖如圖9 16所示。1 4號量子點檢測Y-球蛋白的共振散射圖譜如圖9、11、13和15所示，曲線自下而上分別為Y-球蛋白為O及加入上述不同量γ-球蛋白溶液的圖譜。1 4號量子點檢測Y-球蛋白的標準曲線圖如圖10、12、14和16所示。通過檢測與繪制標準曲線可以看出，在蛋白質含量一定范圍內，共振散射強度變化與蛋白質濃度有較好的相關性，蛋白質濃度越大，散射強度變化就越明顯。根據樣品中散射強度的變化可以在標準曲線上查出蛋白質的含量。檢測分析時，可以檢測到很微量的蛋白質，達到10_8mol/L的數量級，對于一些蛋白質含量比較低的樣品能夠快速地檢測出來，通過量子點共振散射來定量檢測蛋白質，具有靈敏度高、穩定性好、經濟實用等優點為為農業質量檢測、食品營養標準檢測、轉基因檢測領域中蛋白質含量的檢測提供了很好的方法。
權利要求
1.一種利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，包括如下步驟將量子點懸浮分散于蛋白質溶液中，在456 466nm下進行同步熒光檢測，測定散射強度，并與標準曲線對比得到蛋白質濃度；量子點與蛋白質溶液的用量比為5 IOX 10_7mol/ ml ο
2.權利要求1所述利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述量子點結構包括內核和表面包被的SiA外殼；內核粒徑為3 lOnm，為SiS/ZnO量子點異質結構。
3.權利要求1或2所述利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述量子點的制備方法包括如下步驟(1)將Si(Ac)2和CH3CSNH2加入1，4_丁二醇中，超聲分散直至形成透明前驅體溶液； Zn (Ac) 2 與 CH3CSNH2 摩爾比為 1 0. 25 0. 7 ；(2)步驟(1)所得到的前驅體溶液轉移至水熱反應釜中，190 220°C下反應16 20h； 冷卻至室溫后，加入蒸餾水混勻，離心分離取沉淀洗滌干燥即得SiS/ZnO量子點異質結構；(3)ZnS/Zn0量子點異質結構溶解于乙醇中，加入氨水，攪拌下加入正硅酸乙酯，繼續攪拌反應10 15小時，取沉淀洗滌干燥；ZnS/ZnO量子點異質結構與乙醇、正硅酸乙酯用量比為 Imol 300 600ml 1 2ml。
4.權利要求3所述利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述ai(Ac) 2與1， 4- 丁二醇用量比為0. 1 0. 4mol/L。
5.權利要求1所述利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述蛋白質為BSA 或Y-球蛋白。
6.權利要求1所述利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述步驟(1)中， 熒光檢測條件為發射和散射光柵為5nm，電壓為400V。
7.權利要求1所述利用量子點定量檢測蛋白質的方法，其特征在于，所述標準曲線的構建方法包括以下步驟將量子點加入蛋白質含量為0 0. 4μ M的溶液中分散均勻，檢測散射強度，以蛋白質濃度為橫坐標，散射強度變化為縱坐標繪制標準曲線。
全文摘要
本發明公開了一種利用量子點共振散射定量檢測蛋白質的方法，是對蛋白質檢測方法的補充。本發明利用量子點通過靜電作用吸附蛋白質，在可見光波長范圍內能產生共振散射光來檢測標準牛血清蛋白(BSA)和γ-球蛋白，以蛋白濃度(mol/L)為橫坐標，以散射波長最大強度變化為縱坐標繪制標準曲線，通過散射強度變化可以由回歸方程計算出蛋白質濃度。本發明還利用不同粒徑大小的量子點對BSA和γ-球蛋白等進行了檢測，發現蛋白質濃度與散射強度都存在較好的相關性，相關系數達到0.95-0.99，斜率都達到107，靈敏度較高，且穩定性好，檢測時間對結果影響不大，為定量檢測生物大分子蛋白質的濃度開創了一種實用的新方法。
文檔編號G01N21/64GK102565020SQ20121001031
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者余錫賓, 劉聰, 開國銀, 羅秀芹, 肖建波, 鞠冠華 申請人:上海師范大學