專利名稱：一種胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法。
背景技術：
大分子膠原蛋白是指膠原蛋白分子具有完整的三螺旋結構，分子量在30萬以上的膠原蛋白。以往研究膠原蛋白熱變性程度的方法主要有粘度法、DSC法、圓二色譜法(CD法)等。粘度法是根據加熱情況下，膠原蛋白分子解螺旋、斷裂導致溶液粘度下降的原理來測定的；DSC法基于三螺旋解體過程會伴隨熱吸收的過程；CD法測定基于膠原蛋白中存在的a螺旋，在特定的波長有正吸收或負吸收的原理。但不論哪種方法都要有相應的設備，特別是CD法、DSC法對于設備的要求較高，并且測定結果受較多因素影響。采用酶法(胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)評價膠原蛋白的熱變性程度不但采用的設備簡單，而且通過電泳圖既可以反映膠原中具有完整三螺旋結構的蛋白情況，又可以反映由膠原蛋白亞基構成的二聚體、單體以及亞基分解后的片段的情況，對蛋白質變性狀況的反映更加全面和直觀。
發明內容
本發明提供一種采用胃蛋白酶結合SDS-PAGE法評價膠原蛋白的熱變性程度，它具有但采用的設備簡單，而且通過電泳圖既可以反映膠原中具有完整三螺旋結構的蛋白情況，又可以反映由膠原蛋白亞基構成的二聚體、單體以及亞基分解后的片段的情況，對蛋白質變性狀況的反映更加全面和直觀的優點。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，步驟如下(I)原料選擇，選擇水產品加工的下腳料-魚皮為原料，也可以選擇其他富含膠原蛋白的動物組織如豬皮、牛皮、筋腱。(2)浸泡溶解在步驟(I)中原料加入0. 01-1. OmoI/L醋酸，獲得膠原蛋白溶液，膠原蛋白溶液的濃度為0. 1-20%。(3)加熱預處理將步驟(2)中獲得的膠原蛋白溶液加熱，加熱時間為10-200分鐘，加熱溫度為20°C _80°C，加熱過程中，每隔5分鐘晃動一次，加熱完成后迅速降溫冷卻。(4)酶解在步驟⑶中獲得的膠原蛋白液中加入胃蛋白酶，加入量為1_20%，反應溫度10-60°C，時間10-100分鐘，反應完成后加入苯甲基磺酰氟終止反應。(5)制作電泳樣品并電泳將終止反應的膠原蛋白溶液加入十二烷基磺酸鈉溶液制作電泳樣品并電泳。優選地，步驟(2)中加入的醋酸濃度為0.04-0. 8mol/L，膠原蛋白溶液的濃度為5-15%。 優選地，步驟(3)中加熱時間為20-180分鐘，加熱溫度為20°C _80°C。優選地，步驟(4)中，酶解時加入胃蛋白酶的量為5-15%。
優選地，步驟(4)中，加熱溫度為15_55°C，加熱時間為20-50分鐘。
優選地，步驟(5)中膠原蛋白的熱變性程度根據膠原蛋白中P鏈濃度的減少量來表示，P鏈濃度降低的越多說明膠原蛋白熱變性的程度越大。本發明的優點采用的設備簡單，而且通過電泳圖既可以反映膠原中具有完整三螺旋結構的蛋白情況，又可以反映由膠原蛋白亞基構成的二聚體、單體以及亞基分解后的片段的情況，對蛋白質變性狀況的反映更加全面和直觀。
圖I為本發明的流程圖。圖2為不同溫度酶解后的電泳圖譜，變性溫度酶解1/10 I 28°C,2 30°C,3 31. 5°C,4 33°C,5 35°C,6 40°C,7 :50°C。
具體實施例方式(I)原料選擇，選擇水產品加工的下腳料-魚皮為原料，也可以選擇其他富含膠原蛋白的動物組織如豬皮、牛皮、筋腱。(2)浸泡溶解在步驟⑴中原料加入0. 01-1. OmoI/L醋酸，獲得膠原蛋白溶液，膠原蛋白溶液的濃度為0. 1-20%。(3)加熱預處理將步驟(2)中獲得的膠原蛋白溶液加熱，加熱時間為10-200分鐘，加熱溫度為20°C _80°C，加熱過程中，每隔5分鐘晃動一次，加熱完成后迅速降溫冷卻。(4)酶解在步驟(3)中獲得的膠原蛋白液中加入胃蛋白酶，加入量為1_20%，反應溫度10-60°C，時間10-100分鐘，反應完成后加入苯甲基磺酰氟終止反應。(5)制作電泳樣品并電泳將終止反應的膠原蛋白溶液加入十二烷基磺酸鈉溶液制作電泳樣品并電泳。實施例如圖2所示，取牛皮、鯉魚皮、鱈魚皮膠原蛋白樣品，配制成0. 5%的0. 5M醋酸溶液，并于 I :28°C、2 :30°C、3 31. 5°C、4 :33°C、5 :35°C、6 :40°C、7 :50°C溫度下加熱 30 分鐘后，加入I/10胃蛋白酶，在20 C反應3小時后，電泳并分析電泳圖譜。以上所述，僅為本發明的具體實施方式
，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。
權利要求
1.一種胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于，步驟如下 (1)原料選擇，選擇水產品加工的下腳料-魚皮為原料，也可以選擇其他富含膠原蛋白的動物組織如豬皮、牛皮、筋腱。
(2)浸泡溶解在步驟(I)中原料加入O.01-1. Omol/L醋酸，獲得膠原蛋白溶液，膠原蛋白溶液的濃度為O. 1-20%。
(3)加熱預處理將步驟(2)中獲得的膠原蛋白溶液加熱，加熱時間為10-200分鐘，力口熱溫度為20°C -80°C，加熱過程中，每隔5分鐘晃動一次，加熱完成后迅速降溫冷卻。
(4)酶解在步驟(3)中獲得的膠原蛋白液中加入胃蛋白酶，加入量為1_20%，反應溫度10-60°C，時間10-100分鐘，反應完成后加入苯甲基磺酰氟終止反應。
(5)制作電泳樣品并電泳將終止反應的膠原蛋白溶液加入十二烷基磺酸鈉溶液制作電泳樣品并電泳。
2.根據權利要求I所述的胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于步驟(2)中加入的醋酸濃度為O. 04-0. 8mol/L，膠原蛋白溶液的濃度為5-15%。
3.根據權利要求I所述的胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于步驟(3)中加熱時間為20-180分鐘，加熱溫度為20°C -80°C。
4.根據權利要求I所述的胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于步驟(4)中，酶解時加入胃蛋白酶的量為5-15%。
5.根據權利要求I所述的胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于步驟(4)中，加熱溫度為15-55°C，加熱時間為20-50分鐘。
6.根據權利要求I所述的胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于步驟(5)中通過膠原蛋白β鏈的變化來判斷膠原蛋白的變性程度。
全文摘要
本發明公開了一種胃蛋白酶法大分子膠原蛋白熱變性程度的評價方法，其特征在于，步驟如下(1)原料選擇，選擇水產品加工的下腳料-魚皮為原料；(2)浸泡溶解在原料加入0.01-1.0mol/L醋酸，獲得膠原蛋白溶液；(3)加熱預處理將膠原蛋白溶液加熱，加熱過程中，每隔5分鐘晃動一次，加熱完成后迅速降溫冷卻；(4)酶解在膠原蛋白液中加入胃蛋白酶，加熱反應，反應完成后加入苯甲基磺酰氟終止反應；(5)制作電泳樣品并電泳；本發明的優點是采用的設備簡單；對蛋白質變性狀況的反映更加全面和直觀。
文檔編號G01N1/44GK102621213SQ20121000968
公開日2012年8月1日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者張俊杰, 段蕊, 秦松 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所, 淮海工學院