專利名稱：一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法。
背景技術：
免疫層析是出現于80年代初期的一種獨特的免疫分析方式，它往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過酶反應或直接運用可目測的標記物(如膠體金)而得到直觀的實驗現象(如顯色)。而游離標記物則越過檢測帶， 達到與結合標記物自動分離之目的。免疫層析技術目前已廣泛應用于臨床醫療檢測中。國內外現有的商品供應及文獻報道的檢測項目主要包括以下方面違禁藥物檢測(苯丙胺、可卡因、大麻、嗎啡、海洛因等)、傳染病病原檢測(梅毒螺旋體、淋球菌、沙眼衣原體、幽門螺桿菌等)、激素檢測、寄生蟲、腫瘤標記物、心血管病檢測標志物等。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。由于正常情況下血清IgE抗體僅在ng/ml水平，用常規測定IgG或IgM的凝膠擴散法檢測不出IgE，因而目前常采用免疫層析法來進行檢測。然而，現有的進行血清IgE抗體檢測的免疫層析法將特異性過敏原直接連接到標記物乳膠微球上形成過敏原-乳膠微球復合物，相當于一比一的連接關系，靈敏度低，用于檢測ng/ml水平的特異性IgE抗體時， 檢測結果顏色暗淡，不容易觀察。生物素-親合素系統(Biotin-Avidin-System，BAS)是70年代末發展起來的一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫學各領域。近年大量研究證實，生物素-親合素系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。生物素-親合素與標記試劑高親合力的牢固結合及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種改進的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法。為解決以上技術問題，本發明采取如下技術方案
一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結合墊、包被有檢測線和質控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進行檢測，其特征在于所述結合墊上結合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，所述方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合形成結合物，以及所形成的結合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現色帶來實現對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。根據本發明的進一步實施方案所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球通過如下方法制備首先將過敏原與生物素連接形成過敏原-生物素，將親合素與乳膠微球連接形成親合素-乳膠微球，然后再將所形成的過敏原-生物素與所形成的親合素-乳膠微球連接，即得。根據本發明的一個具體方面，過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的具體制備過程如下
①將過敏原溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，將生物素溶于去離子水中，然后將生物素的水溶液滴加至過敏原的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下攪拌，得到含有過敏原-生物素的溶液；
②將親合素溶液溶于脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液(MES)中，將乳膠微球儲存液劇烈震蕩， 取出微球于離心管中，離心，除去上清，加入脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液，劇烈震蕩，加入溶有親合素的脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液和新鮮配制的碳二亞胺溶液(EDC)，劇烈震蕩，使混合均勻，在室溫暗室孵育20 40分鐘，加入吐溫-20，離心，除去上清，加入十二烷基硫酸鈉水溶液(SDS)溶解微球，劇烈震蕩，離心，除去上清，加入磷酸鹽緩沖液溶解微球，劇烈震蕩，得含有親合素-乳膠微球的溶液；
③將步驟①制得的含有過敏原-生物素的溶液加入步驟②制得的含有親合素-乳膠微球的溶液中，輕輕攪拌直至微球全部懸浮起來，然后在室溫下持續攪拌10 15小時，即得含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液。根據本發明，通過噴涂所述含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液使過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合到結合墊上。優選地，在樣品墊上包被有抗紅細胞抗體。層析膜上的檢測線通過包被鼠抗人IgE 單克隆抗體形成。質控線通過包被羊抗人IgE的多克隆抗體形成。層析膜優選為硝基纖維素膜(NC膜)。優選地，所述的乳膠微球為聚苯乙烯微球。本發明還涉及生物素-親合素放大系統在免疫層析法中的應用。由于以上技術方案的實施，本發明與現有技術相比具有如下優點
本發明將生物素-親合素系統應用于連接過敏原和乳膠微球，能夠實現在一個過敏原上連接多個乳膠微球，從而使檢測特異性IgE抗體的靈敏度提高，檢測結果明顯，容易觀察。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步詳細的說明。實施例1
本實施例提供一種血清IgE抗體的免疫層析法，包括如下步驟 (1 )、制備過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，具體過程如下 ①過敏原連接生物素將過敏原溶于IOOmM的PBS (pH 8. 0)中，獲得lmg/ml的過敏原溶液。將生物素溶于去離子水中，制得ang/ml的生物素溶液，將該生物素溶液緩慢滴加到過敏原溶液中，同時攪拌溶液，并使容器置于25°C水浴中。滴加完畢，密封容器，在25°C水浴中持續攪拌60士5分鐘，得含有過敏原-生物素的溶液。②親合素連接乳膠微球將親合素溶于Iml的IOOmM MES (pH 4. 5)溶液中，獲得 lmg/ml的親合素溶液。將微球儲存液劇烈震蕩20s，取出5. OX IO6的微球于Eppendorf離心管中，以8000g-10，OOOg的轉速離心l-2min,除去上清后加0. 5ml的100M MES (pH 4. 5)， 劇烈震蕩20s，加入Iml親合素溶液，加入25 μ 1新鮮配制的10mg/ml的EDC，劇烈震蕩，使其混合均勻，室溫暗室孵育30min,加入1. Oml 0. 02%吐溫-20，以8000g-10, OOOg的轉速離心Ι-aiiin，除去上清，獲得偶聯的微球，將偶聯的微球溶于1.0ml 0. 1%SDS，劇烈震蕩，以 8000g-10, OOOg的轉速離心l-2min，除去上清，使微球溶于IOOmM的PBS (pH 8. 0)，劇烈震蕩 20s，計數后置于4°C冰箱保存。③過敏原-生物素和親合素-乳膠微球的連接將Iml過敏原-生物素溶液，加入放置有等體積的親合素-乳膠微球的容器中；用玻璃棒輕輕攪拌直到微球全部懸浮起來； 將容器密封放置到混合器上，室溫持續攪拌溶液10-15小時。(2)、將制備好的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球噴涂在結合墊上。(3)、進行層析膜的包被層析膜為NC膜，在層析膜上包被鼠抗人IgE單克隆抗體形成檢測線(T線)；以及包被羊抗人IgE的多克隆抗體形成質控線(C線)，T線與C線之間的距離為5-10mm。(4)、在樣品墊上包被抗紅細胞抗體。(5)、免疫層析試紙條的組裝將樣品墊、結合了過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的結合墊、層析膜、吸水墊(濾紙)依次相互交錯粘貼在底板上，裁切成長度100-120mm，寬度8-12mm的試紙條，試紙條的厚度為0. I-Imm,
(6)、樣品的檢測在試紙條的樣品墊上滴加30μ 1陽性血清(含IgE的標準品)，等待 15min，判斷結果。陽性結果在檢測線(T線)所在的檢測區和質控線(C線)所在的質控區各出現一條紅色條帶；陰性結果僅在質控區出現一條紫紅色帶。若檢測區無色帶且質控區未出現紫紅色帶，表明不正確的操作或試劑無效，需重新進行檢測試驗。對比例1
本對比例提供一種血清IgE抗體的免疫層析法，基本同實施例1，不同的是，其采用的免疫層析試紙條的結合墊結合的不是過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，而是結合了過敏原-乳膠微球。該過敏原-乳膠微球的制備過程如下
將過敏原溶于IOOmM MES (pH 4. 5)中，得濃度達到lmg/ml的過敏原溶液。將微球儲存液劇烈震蕩20s，取出5. OX IO6的微球于Eppendorf離心管中，以8000g_10，OOOg的轉速離心Ι-anin，除去上清，加入50ul IOOmM MES (pH 4. 5)，劇烈震蕩20s，加入2ul過敏原溶液， 加入2. 5ul新鮮配制的10mg/ml的EDC，劇烈震蕩，使其混合均勻。室溫暗室孵育30min，加 Λ 1. Oml 0. 02%吐溫-20，以8000g-10, OOOg的轉速離心l_2min，除去上清，得偶聯的微球。 將偶聯的微球溶于1. Oml 0. 1%SDS中，劇烈震蕩，以8000g_10，OOOg的轉速離心l-anin，除去上清，使其溶于IOOmM的PBS (pH 8. 0)，劇烈震蕩20s。對比上述的實施例1和對比例1的檢測結果可知，對比例1的檢測結果顏色非常暗淡，不容易觀察，表明該方法靈敏度低；而實施例1的檢測結果明顯，容易觀察，表明靈敏度尚。上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結合墊、包被有檢測線和質控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進行檢測，其特征在于所述結合墊上結合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，所述方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合形成結合物，以及所形成的結合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現色帶來實現對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。
2.根據權利要求1所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球通過如下方法制備首先將過敏原與生物素連接形成過敏原-生物素，將親合素與乳膠微球連接形成親合素-乳膠微球，然后再將所形成的過敏原-生物素與所形成的親合素-乳膠微球連接，即得所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球。
3.根據權利要求2所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的具體制備過程如下①將過敏原溶于磷酸鹽緩沖液中，將生物素溶于去離子水中，然后將生物素的水溶液滴加至過敏原的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下攪拌，得到含有過敏原-生物素的溶液；②將親合素溶液溶于脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液中，將乳膠微球儲存液劇烈震蕩，取出微球于離心管中，離心，除去上清，加入脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液，劇烈震蕩，加入溶有親合素的脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液和新鮮配制的碳二亞胺溶液，劇烈震蕩，使混合均勻，在室溫暗室孵育20 40分鐘，加入吐溫-20，離心，除去上清，加入十二烷基硫酸鈉水溶液溶解微球，劇烈震蕩，離心，除去上清，加入磷酸鹽緩沖液溶解微球，劇烈震蕩，得含有親合素-乳膠微球的溶液；③將步驟①制得的含有過敏原-生物素的溶液加入步驟②制得的含有親合素-乳膠微球的溶液中，輕輕攪拌直至微球全部懸浮起來，然后在室溫下持續攪拌10 15小時，即得含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液。
4.根據權利要求4所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其特征在于通過噴涂所述含有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球的溶液使過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合到結合墊上。
5.根據權利要求1至4中任一項權利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的樣品墊上包被有抗紅細胞抗體。
6.根據權利要求1至4中任一項權利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的檢測線通過包被鼠抗人IgE單克隆抗體形成。
7.根據權利要求1至4中任一項權利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的質控線通過包被羊抗人IgE的多克隆抗體形成。
8.根據權利要求1至4中任一項權利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的層析膜為硝基纖維素膜。
9.根據權利要求1至4中任一項權利要求所述的檢測血液樣本中過敏原特異性IgE 抗體的免疫層析方法，其特征在于所述的乳膠微球為聚苯乙烯微球。
10.生物素-親合素放大系統在免疫層析法中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種檢測血液樣本中過敏原特異性IgE抗體的免疫層析方法，其首先將樣品墊、結合墊、包被有檢測線和質控線的層析膜、吸水墊依次相互交錯粘貼在底板上，構成免疫層析試紙條，然后向樣品墊中滴加血液樣本進行檢測，所述結合墊上結合有過敏原-生物素-親合素-乳膠微球，該方法利用血液樣本中的過敏原特異性IgE抗體能夠與過敏原-生物素-親合素-乳膠微球結合形成結合物，以及所形成的結合物能夠在檢測線處被捕獲而呈現色帶來實現對過敏原特異性IgE抗體的定性檢測。本發明將生物素-親合素系統應用于連接過敏原和乳膠微球，能夠實現在一個過敏原上連接多個乳膠微球，從而使檢測特異性IgE抗體的靈敏度提高，檢測結果明顯，容易觀察。
文檔編號G01N33/531GK102565382SQ20121000262
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者張逸南, 李冬冬, 趙文姬 申請人:蘇州浩歐博生物醫藥有限公司