一種定向發射熒光成像檢測裝置的制作方法

專利名稱：一種定向發射熒光成像檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種熒光成像檢測裝置，尤其是涉及一種棱鏡型表面等離子體耦合定向發射熒光成像檢測裝置。
背景技術：
由于熒光分析技術在免疫分析、基因表達、藥物篩選、生物傳感、細胞成像等生命科學領域的應用日益增加，因此新型熒光技術及儀器的研究具有重大的意義和廣闊的發展前景。表面等離子體耦合定向發射熒光法(Surface Plasmon Coupled Directional Emission, SP⑶Ε)是近來所提出的新型熒光分析方法，其原理為在光滑的納米金屬表面 200nm范圍內，激發態的熒光團與納米金屬表面自由電子產生的表面等離子體子耦合作用后，以熒光發射波長對應的SPCDE角(即esrcDE)進入棱鏡基體輻射。作為一種新型熒光技術，SPCDE除具有提高熒光強度、量子產率和光穩定性等金屬表面熒光所具備的優點外，還展現出高度的角度定向發射、熒光發射P偏振、波長可分辨性以及有效的背景信號抑制等獨特的優點。
根據激發方式的不同，SP⑶E可分為Kretschmarm模式(KR模式，如圖1所示)與反Kretschmarm模式(RK模式，如圖2所示)。在KR模式中，激發光源1通過棱鏡2以表面等離子體共振角θ SPK入射到金屬膜3表面，引發表面等離子體，產生瞬逝場，從而激發瞬逝場深度內(約金屬表面幾百納米左右)的熒光團樣品膜4，激發態的熒光團與金屬表面的等離子體發生近場作用后，以一定的角度定向輻射。而在RK模式中，激發光源1直接照射到熒光團樣品膜4，激發表面的熒光團。近表面的激發態熒光分子和金屬3表面的等離子體發生近場作用，從而通過棱鏡2定向輻射。其中，以物鏡替換棱鏡，也可實現上述兩種模式的SP⑶E檢測。近來，有相關文獻報道物鏡型SP⑶E成像技術研究。該類工作是在商品化或自制的全內反射顯微鏡裝置上，通過蒸鍍或溉射金屬層的載玻片實現。上述基于物鏡型的SPCDE成像系統，主要有以下不足之處1、裝置價格昂貴或結構復雜。商品化的全內反射顯微鏡價格極其昂貴，在自制的裝置中，需要使用高數值孔徑的物鏡或者是代替物鏡的拋物面狀元件，其中，高數值孔徑的物鏡價格不菲，而代替物鏡的拋物面狀元件采用注塑法制備，模具設計與加工困難且精密度要求高，并且不同發射波長的染料對應不同形狀結構的模具，制備及操作上相當復雜。2、基于物鏡型的成像系統，通過物鏡收集發射信號，所得到的光斑面積小，只能對待檢測樣品的較小區域成像，無法對感興趣區域實現快速定位。3、物鏡型成像系統基本采用KR模式，由于瞬逝場激發作用的參與增強了激發熒光團的能量，強激發容易造成熒光團漂白或樣品的損傷。此外，采用KR模式時，只有以表面等離子體共振角入射的激發光才能引發表面等離子體產生瞬逝場，因此需調整入射光的角度；同時，激發光及其反射光與發射光的角度差較小，需要采用高性能的濾光片去除激發光或其反射光的干擾。因此基于物鏡型的SPCDE成像裝置在普通實驗室中較難以實現和推廣，限制了該成像技術的推廣與應用。
中國專利CN101949847A公開一種無透鏡熒光成像檢測裝置，由左右激發光源、加熱板、微芯片、濾光片、CCD芯片和其外圍驅動電路組成。無透鏡熒光成像檢測裝置充分利用CCD芯片象素小、集成度高的特點，通過減少CCD芯片與反應物質的距離，建立了微芯片中檢測單元與CCD芯片各象素的對應關系，不經透鏡即可直接成像，大大減少了檢測裝置的體積和復雜程度。發明內容
本發明的目的旨在克服上述現有的檢測裝置的不足，提供一種結構簡單、成本低廉、操作簡便、常規實驗室容易實現的定向發射熒光成像檢測裝置。
本發明設有激光擴束系統、樣品系統和檢測系統；
所述激光擴束系統設有激光光源、顯微物鏡、針孔、平凸透鏡、衰減器和矩形光欄; 所述激光光源發出的激發光依次經顯微物鏡、針孔和平凸透鏡擴束準直后，成為平行光束， 所述平行光束依次通過衰減器和矩形光欄，得到矩形光斑；
所述樣品系統設有旋轉臺、樣品架、棱鏡和光學石英基底，所述棱鏡置于樣品架上并固定在旋轉臺中心，所述光學石英基底表面設有納米級金屬薄膜，所述納米級金屬薄膜表面設有熒光傳感膜；所述光學石英基底與棱鏡之間涂有光學常數與兩者匹配的溶液；
所述檢測系統設有CCD旋轉臂、CCD接收器和濾光片，所述CCD旋轉臂固定在旋轉臺臺面，CCD旋轉臂可隨旋轉臺臺面360度自由旋轉，CCD旋轉臂連接在旋轉臺臺面，用于采集圖像的CCD接收器和濾光片設在CCD旋轉臂上。
所述激光光源可采用固定激光器，所述固體激光器可采用波長為405nm、473nm、 532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm等的固體激光器，所述固體激光器的功率可為 50 500mw/cm2。
所述針孔的直徑可為0. 015 0. 025mm。
所述矩形光欄可由菲林圖案組成，所述矩形光欄的大小可為(5 15)mmX (5 15)mm。
所述熒光傳感膜可采用羅丹明B熒光傳感膜(IihB-PVA膜)等。
所述棱鏡可采用等腰直角三角棱鏡。
所述光學常數與兩者匹配的溶液可采用甘油等。
所述C⑶旋轉臂可通過螺絲等緊固部件固定在旋轉臺臺面上。
所述空間濾波器含有05 40) X倍物鏡。
所述CCD接收器可固定在CCD旋轉臂末端，而旋轉臂與旋轉臺臺面連接部分為中空部分。因此，樣品架通過此中空部位時，處于旋轉臺的正中心，且可獨立固定于光學平臺上，不隨旋轉臺一起轉動。
本發明所述樣品包括等腰直角三角棱鏡、樣品膜，其中樣品膜包括納米級的金屬薄膜和熒光傳感膜。棱鏡固定在樣品架上，納米級金屬薄膜附于光學石英基底，光學石英基底附于棱鏡上面，中間涂有折射率油層；熒光傳感膜附于納米級金屬薄膜表面。
激發光源經空間濾波器擴束和平凸透鏡準直后，成為光強分布均勻的平行光束， 經過矩形光欄后，光斑由圓形變成矩形。其中，采用菲林圖案作為矩形光欄，可根據實際需要，改變矩形窗口大小，制作簡便且成本低廉。矩形光斑直接照射在棱鏡表面的樣品膜上， 在棱鏡另一側產生定向發射。通過旋轉臺調整CCD檢測器的檢測角度，采集不同角度下的熒光發射信號，并以圖像格式存儲。將采集到的圖像通過軟件處理，獲取各個角度下對應的熒光信號強度，實現數據分析。
與現有的表面等離子體耦合定向發射熒光成像的檢測裝置對比，本發明具有以下優點可對待測樣品的較大區域實現同時的成像檢測，有效避免由于樣品局部不均勻等造成的影響，同時也可在同等條件下獲取樣品不同區域的相關信息，對待測樣品感興趣區域實現快速定位；采用棱鏡作為耦合元件，代替價格昂貴的高數值孔徑物鏡或制作復雜的拋物面元件，不僅容易加工，價格便宜，而且可適用于不同發射波長染料的檢測。另外，本發明結構簡單，成本低廉，易于在普通實驗室中實現和推廣。


圖1為現有的表面等離子體耦合定向發射熒光的Kretschmarm(KR)模式示意圖。
圖2為現有的表面等離子體耦合定向發射熒光的Kretschmarm(RK)模式示意圖。
圖3為本發明實施例的結構組成示意圖。
圖4為本發明實施例CCD旋轉臂的結構組成示意圖。
圖5為本發明實施例在不同偏振發射條件下所采集的熒光成像數據。在圖5中， 實驗條件為以熒光染料微陣列為檢測樣品，在最強熒光發射角度，即檢測角度為58°時； 圖像21為在未加偏振器所采集到的熒光成像數據，圖像22為完全水平偏振所采集到的熒光成像數據，圖像23為完全垂直偏振所采集到的熒光成像數據。
圖6為在激發波長為532nm，發射波長為580nm狀態下的熒光強度角分布極坐標圖。在圖6中，極坐標為熒光檢測角度(° )，縱坐標為相對熒光強度Fluorescence Intensity ；圖中Exc.表示激發波長(532nm)；檢測角度θ F為58°。
具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。
如圖3所示，本發明實施例設有激光擴束系統、樣品系統和檢測系統。
所述激光擴束系統設有激光光源5、顯微物鏡6、針孔7、平凸透鏡8、衰減器9和矩形光欄10 ；所述激光光源5發出的激發光依次經顯微物鏡6、針孔7和平凸透鏡8擴束準直后，成為平行光束，所述平行光束依次通過衰減器9和矩形光欄10，得到矩形光斑。
所述樣品系統設有旋轉臺11、樣品架、棱鏡12和光學石英基底，所述棱鏡12置于樣品架上并固定在旋轉臺11中心，所述光學石英基底表面設有納米級金屬薄膜13，所述納米級金屬薄膜13表面設有熒光傳感膜14 ；所述光學石英基底與棱鏡12之間涂有光學常數與兩者匹配的溶液(如甘油)。
所述檢測系統設有CXD旋轉臂15、(XD接收器16和濾光片17，所述CXD旋轉臂15 固定在旋轉臺11臺面，CCD旋轉臂15可隨旋轉臺11臺面360度自由旋轉，CCD旋轉臂15 連接在旋轉臺11臺面，用于采集圖像的CCD接收器16和濾光片17設在CCD旋轉臂15上。
所述激光光源可采用固定激光器，所述固體激光器可采用波長為405nm、473nm、 532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm或1342nm等的固體激光器，所述固體激光器的功率可為50 500mW/cm2。所述針孔的直徑可為0. 015 0. 025mm。所述矩形光欄可由菲林圖案組成，所述矩形光欄的大小可為(5 15)mmX (5 15)mm。所述棱鏡可采用等腰直角三角棱鏡。所述CCD旋轉臂可通過螺絲等緊固部件固定在旋轉臺臺面上。所述空間濾波器含有(25 40) X倍物鏡。所述CCD接收器可固定在CCD旋轉臂末端，而旋轉臂與旋轉臺臺面連接部分為中空部分。因此，樣品架通過此中空部位時，處于旋轉臺的正中心，且可獨立固定于光學平臺上，不隨旋轉臺一起轉動。
參見圖4，CXD旋轉臂15通過4個緊固螺絲18固定在旋轉臺11臺面。CXD旋轉臂15與旋轉臺11連接部位的正中心19為中空部位，樣品架通過此中空部位，處于旋轉臺 11的正中心，且可獨立固定于光學平臺上，當CCD旋轉臂15隨旋轉臺11轉動時，樣品架始終保持不動。C⑶接收器16的固定溝槽20可方便調整CXD接收器16的位置。
本實施例以羅丹明B熒光傳感膜(IihB-PVA膜)為檢測對象。
所述納米級金屬薄膜可采用真空濺射法制備，具體方法如下在潔凈的石英基底表面濺射厚度為2nm的鉻膜作為粘附層，再濺射厚度為50nm金膜，即得納米級光滑金屬薄膜。
所述熒光傳感膜可采用旋涂法制備，具體方法如下在納米級光滑金屬薄膜表面旋轉鍍膜上含有羅丹明B的PVA膜，結合光漂白方法，制備所需的熒光傳感膜。
固體激光器5波長可采用532nm，功率約為250mW/cm2 (波長的選擇由檢測的熒光染料的激發波長決定)，其發出的激光經40X倍顯微物鏡6和孔徑為Φ0. 025mm的針孔7 組成的空間濾波器擴束和平凸透鏡8準直后，成為光強分布均勻的平行光束。調整衰減器 9，對平行光束進行衰減，直至得到合適的光強(避免造成熒光的光漂白，同時保證在C⑶上獲取清晰的成像)。菲林圖案形成的矩形光欄10大小為7mmX 7mm，將擴束準直后的平行光束由圓形光斑變成矩形光斑。
在SPCDE成像中，光斑直接照射在熒光傳感膜14，此時光斑的面積大小由矩形光欄決定。調整樣品架，使矩形光斑垂直照射熒光傳感膜14表面，從而激發染料分子。激發態的染料分子與納米金屬薄膜13表面產生的等離子體作用后，在等腰直角三角棱鏡12另一側產生定向發射，通過濾光片17后，輻射到CXD接收器16。
固定CXD接收器16的位置后，調整CXD接收器的成像透鏡直至CXD接收器16上呈現清晰的圖像。通過轉動旋轉臺11，改變CXD旋轉臂15的角度，從而實現CXD接收器16 采集不同檢測角度下的SPCDE成像信息，以圖像格式存儲。采集到的圖像用Image J處理， 獲取各個圖像的信號強度并加以分析。
以本發明所述基于棱鏡型表面等離子體耦合定向發射熒光成像裝置進行羅丹明B 熒光傳感膜14的成像檢測，考察其信號角度分布。分析不同檢測角度下所獲取的熒光成像信息，結果顯示，在檢測角度為58°時，熒光發射信號最強，具有顯著的信號角度分布。此外，用熒光染料微陣列樣品進行熒光偏振性檢測，在最強熒光發射角度，即檢測角度為58° 時檢測，對比在不同偏振發射條件下所采集到的熒光成像信息，結果證實SPCDE中的熒光發射信號是垂直偏振的，即P偏振。因此，該裝置滿足SPCDE的實驗要求，可用于表面等離子體耦合定向發射熒光的成像檢測。圖5為檢測角度為58°時，在不同偏振發射下所采集到的熒光成像信息。其中圖像21為在未加偏振器所采集到的熒光成像數據，圖像22為完全水平偏振所采集到的熒光成像數據，圖像23為完全垂直偏振所采集到的熒光成像數據。
圖6為在激發波長為532nm，發射波長為580nm狀態下的熒光強度角分布極坐標圖，最強的熒光發射信號所對應的檢測角度。
權利要求
1.一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于設有激光擴束系統、樣品系統和檢測系統；所述激光擴束系統設有激光光源、顯微物鏡、針孔、平凸透鏡、衰減器和矩形光欄；所述激光光源發出的激發光依次經顯微物鏡、針孔和平凸透鏡擴束準直后，成為平行光束，所述平行光束依次通過衰減器和矩形光欄，得到矩形光斑；所述樣品系統設有旋轉臺、樣品架、棱鏡和光學石英基底，所述棱鏡置于樣品架上并固定在旋轉臺中心，所述光學石英基底表面設有納米級金屬薄膜，所述納米級金屬薄膜表面設有熒光傳感膜；所述光學石英基底與棱鏡之間涂有光學常數與兩者匹配的溶液；所述檢測系統設有CCD旋轉臂、CCD接收器和濾光片，所述CCD旋轉臂固定在旋轉臺臺面，CCD旋轉臂可隨旋轉臺臺面360度自由旋轉，CCD旋轉臂連接在旋轉臺臺面，用于采集圖像的CCD接收器和濾光片設在CCD旋轉臂上。
2.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述激光光源采用固定激光器。
3.如權利要求2所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述固體激光器采用波長為 405nm、473nm、532nm、593. 5nm、808nm、980nm、1064nm 或 1342nm 的固體激光器， 所述固體激光器的功率可為50 500mW/cm2。
4.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述針孔的直徑為 0.015 0. 025mm。
5.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述矩形光欄由菲林圖案組成，所述矩形光欄的大小為(5 15)mmX (5 15)mm。
6.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述熒光傳感膜采用羅丹明B熒光傳感膜。
7.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述棱鏡采用等腰直角三角棱鏡。
8.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述光學常數與兩者匹配的溶液采用甘油。
9.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述CCD旋轉臂通過螺絲等緊固部件固定在旋轉臺臺面上。
10.如權利要求1所述的一種定向發射熒光成像檢測裝置，其特征在于所述CCD接收器固定在CCD旋轉臂末端，而旋轉臂與旋轉臺臺面連接部分為中空部分。
全文摘要
一種定向發射熒光成像檢測裝置，涉及一種熒光成像檢測裝置。設有激光擴束、樣品和檢測系統；激光擴束系統設有激光光源、顯微物鏡、針孔、平凸透鏡、衰減器和矩形光欄；激光光源發出的激發光依次經顯微物鏡、針孔和平凸透鏡擴束準直后成為平行光束，平行光束依次經衰減器和光欄得光斑；樣品系統設旋轉臺、樣品架、棱鏡和光學石英基底，棱鏡置于樣品架上并固定在旋轉臺中心，石英基底表面設有納米級金屬薄膜，薄膜表面設有熒光傳感膜；石英基底與棱鏡之間涂有溶液；檢測系統設有CCD旋轉臂、CCD接收器和濾光片，CCD旋轉臂固定在旋轉臺臺面，CCD旋轉臂連接在旋轉臺臺面，用于采集圖像的CCD接收器和濾光片設在CCD旋轉臂上。
文檔編號G01N21/64GK102539404SQ20121000225
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者劉倩, 曹爍暉, 李耀群, 蔡偉鵬 申請人:廈門大學