一種區分甲狀腺癌變的方法、實施該方法的試劑盒以及金屬硫蛋白在區分甲狀腺癌變中 ...的制作方法
【專利摘要】本發明是關于區分包含濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌的甲狀腺癌變的方法，其特征在于采用抗金屬硫蛋白單克隆抗體，利用免疫組織化學方法評估患者的癌組織樣本中的金屬硫蛋白（MT）的表達，根據Remmele的半定量免疫反應積分法在光學顯微鏡下評估所述金屬硫蛋白表達的強度，其中若所述金屬硫蛋白的表達強度的半定量免疫反應積分值等于或大于8，確定具有濾泡狀癌。
【專利說明】—種區分甲狀腺癌變的方法、實施該方法的試劑盒以及金屬硫蛋白在區分甲狀腺癌變中的用途
【技術領域】
[0001]本發明的主題是ー種區分包含濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌的甲狀腺癌變的方法、實施該方法的試劑盒以及金屬硫蛋白在區分上述甲狀腺癌變類型中的用途。本發明的主題屬于診斷領域以及通過免疫組織化學方法區分甲狀腺腫瘤領域。
【背景技術】
[0002]甲狀腺癌是最常見的內分泌系統腫瘤。甲狀腺濾泡細胞發展成常見于年輕人群的高分化型癌癥(乳頭狀和濾泡狀)以及常見于六十歲以上人群的低分化型退行發育性癌癥。乳頭狀癌占甲狀腺癌的70-80%，并被認為是該器官最輕微的ー種癌癥。濾泡狀癌占甲狀腺癌的5-15%。由于濾泡狀癌和濾泡狀腺瘤只有微小區別，難以區分二者，因此它們均稱為濾泡狀腫瘤。僅可通過術后離析區分二者，卻無法通過細針穿刺活檢進行區分。
[0003]最普遍的診斷增殖標記物之ー是K1-67。在其他諸如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、軟組織癌和腦瘤中，K1-67表達均有上升，但是還未掲示它的生物學作用。迄今為止，許多已公開的報道比較了各種類型的腫瘤中金屬硫蛋白(MT)和抗原K1-67的表達。至今，人們已對位于結腸腫瘤、腎上腺皮質腫瘤、口腔腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤、軟組織肉瘤以及非小細胞肺癌均展開研究。在大多數情況下，金屬硫蛋白和K1-67抗原的表達呈明顯的相關性。然而，研究對金屬硫蛋白及其亞型在甲狀腺良性及惡性病變中的表達尚未得到一致結果。
[0004]現有技術包括Ferrario等人所著的公開文獻(作者:C ? Ferrario> P ? Lavagni>M ? Garibold1、C ? Miranda、M ? Losa、L ? Cleris>F ? Formelli>S ? Pilott1、MA ? Pierotti 矛ロA-Greco ;名稱:金屬硫蛋白IG在乳頭狀甲狀腺癌中用作抑癌物；Lab Invest88:474-481,2008)，其中作者掲示了乳頭狀癌中的金屬硫蛋白的功能亞型(MT1E、MT1G、MT1F和MT2A)的表達下降，并用細胞模型證明了 MTlG可能發揮了致癌抑制物的作用。該文獻僅涉及區分乳頭狀癌和濾泡狀癌中惡性類型病變的問題，而并未觸及濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌診斷的問題。Y -Huang發表的文章掲示了乳頭狀甲狀腺癌中MT-1G的表達下降是由其啟動子高甲基化所導致的(Y-HuangJ ? de la Chapelle和NS *Pellegata ;名稱:高甲基化(而不是雜合性缺失)與乳頭狀甲狀腺癌中的MTlG和CRABPl的低表達有關；Int J Cancerl04:735-744,2003)。該文章提供了正常的甲狀腺組織、乳頭狀癌及乳頭狀癌濾泡變異體(FVPTC)的研究結果。但是并未涉及濾泡狀腺瘤以及濾泡狀腺瘤相對濾泡狀癌的診斷。Liu等人掲示了在乳頭狀甲狀腺癌細胞中，金屬硫蛋白的8個功能亞型的表達均可能是由于受到鎘元素的刺激和ERK1/2激酶的激活。這些亞型在其中表達的細胞的特征是具有較短的GI期，并在細胞周期中迅速轉換至 S 期和 M 期(作者:ZM.Liu ZM, CA ? Hasselt,FZ ? Song FZ、AC ? VlantisAC、MG ? Cherian> J ? Koropatnick和GG ? Chen GG ;名稱:金屬硫蛋白功能亞型在乳頭狀甲狀腺癌中的表達；Mol Cell Endocrinol302:92-98, 2009)。Liu等人所做的關于金屬硫蛋白在甲狀腺腫瘤中的表達研究只基于一例病人的一種乳頭狀癌(KAT5)。該報告無法提供來自不同病人臨床材料的研究結果，這樣的研究結果才能確保各種情況并說明實際狀況。該文獻也未涉及有關濾泡狀癌的濾泡狀腺瘤的診斷問題，而專注于分析一種乳頭狀癌中金屬硫蛋白表達水平的調控機制。
[0005]受鈣離子影響的甲狀腺退行發育性癌細胞中也會發生金屬硫蛋白亞型誘導，其表達增加同樣導致細胞周期中GI期縮短(作者:ZM ? Liu、GG ? Chen、CK ? Shum、AC ? Vlantis、MG ? Cherian> J ? Koropatnick和CA ? van Hasselt ;名稱:甲狀腺退行發育性癌細胞中功能亞型MTl和MT2的鈣誘導；FEBSLett.581:2465_2472，2007)。該項研究依然未涉及通過測定金屬硫蛋白的表達來區分濾泡狀癌和濾泡狀腺瘤。
[0006]因此，亟需ー種有效的甲狀腺濾泡狀腺瘤和甲狀腺濾泡狀癌癌變的標記物，便于正確診斷并選擇正確的治療性干預。盡管對金屬硫蛋白在各種惡性腫瘤中的作用已研究了多年，但它在上述幾種甲狀腺腫瘤中預測值的大小尚未得到證實。
【發明內容】
[0007]本發明的主題是ー種在體外區分包含濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌的甲狀腺癌變的方法，其特征在于采用抗金屬硫蛋白(MT)的單克隆抗體，利用免疫組織化學方法檢測患者的癌組織樣本中MT的表達。根據Remmele的半定量免疫反應積分(IRS)方法在光學顯微鏡下評估金屬硫蛋白表達的增加度。其中金屬硫蛋白表達的增加度的半定量IRS值等于或大于8,則確定具有濾泡狀癌。
[0008]優選地，評估金屬硫蛋白亞型MT I和MT II的表達。
[0009]優選地，檢測源自 經胸腺切除術且腫瘤已摘除的患者的物料中金屬硫蛋白的表達。
[0010]本發明的另ー個較優的實施例中，利用同步的病理組織檢查上述病變確定濾泡狀癌或濾泡狀腺瘤的存在。
[0011]本發明的下ー主題是ー種區分包含濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌的甲狀腺癌變的試劑盒，該試劑盒包含抗MT的單克隆抗體。
[0012]本發明的一個優選實施例中，試劑盒包含抗金屬硫蛋白亞型MT I和MT II的單克隆抗體。
[0013]本發明的另ー主題是金屬硫蛋白在區分濾泡狀癌和濾泡狀腺瘤型甲狀腺腫瘤中的用途。
[0014]優選地，金屬硫蛋白亞型為MT I和MT II。
[0015]金屬硫蛋白(MT)是一族低分子量蛋白，該蛋白主要存在于動物中。這種蛋白保守性強，在正常組織和癌組織的各不同位置呈現出四種主要亞型。金屬硫蛋白多肽鏈由61至68個氨基酸組成(依據不同的亞型)，其中30%的氨基酸殘基是半胱氨酸殘基。ー個金屬硫蛋白分子由兩個結構域通過賴氨酸二聚體連接而成。金屬硫蛋白的生理學作用在于結合并輸送鋅離子和銅離子，通過結合給有機體消解有毒重金屬，如鎘，汞和鉛。在密集分裂的細胞(包括癌細胞)中，觀察到金屬硫蛋白的表達增加，將鋅離子(Zn)運送至參與DNA復制的酶，同時金屬硫蛋白的表達增加還防止細胞凋亡。金屬硫蛋白還可能對ー些化療的活性產生影響(它們使在如蒽環類藥物等細胞抑制劑的新陳代謝中形成的自由基失活，或者結合如順鉬等其它物質)。金屬硫蛋白的表達在濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌之間的差異表示可將金屬硫蛋白用作區分上述病變的輔助標記物。此外，金屬硫蛋白是比K1-67更好的用于區分濾泡狀腺瘤型病變和濾泡狀癌型病變的診斷標記物，其原因在于上述不同腫瘤類型的金屬硫蛋白的表達在統計上有顯著差異。而抗原K1-67的表達則缺乏這種顯著性差異。所述診斷方法的應用構成了這兩種甲狀腺肥厚性病變的組織病理診斷的輔助方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1表示金屬硫蛋白在濾泡狀腺瘤(IA)及濾泡狀癌(IB)中的細胞核-細胞質表達以及細胞核抗原K1-67在濾泡狀腺瘤(1C)及濾泡狀癌(1D)中的表達。
[0017]圖2表示金屬硫蛋白表達在甲狀腺不同病變下的增強。統計上在濾泡狀癌和乳頭狀癌(P〈0.001)以及濾泡狀癌和濾泡狀腺瘤(p〈0.05)之間均存在顯著差異。在濾泡狀癌的表達在統計上顯著高于在髓狀癌的表達(圖2 ;P〈0.0001)。統計上在乳頭狀癌的表達(p〈0.0001)和在髓狀癌(p〈0.005)的表達均顯著低于在腫瘤狀甲狀腺腫的表達。
[0018]圖3顯示了抗原K1-67表達在甲狀腺不同病變下的增強。髓狀癌和濾泡狀腺瘤(p〈0.05)以及髓狀癌和腫瘤狀甲狀腺腫(p〈0.05)之間在統計上均具顯著差異。
【具體實施方式】
[0019]本研究所采用的甲狀腺各種病變的186塊石蠟塊均來自弗羅茨瓦夫醫學院病理形態學系。所檢測的石蠟塊包括92例癌癥，其中48例乳頭狀癌、35例濾泡狀癌、9例髓狀癌、31例腺瘤以及63例腫瘤狀甲狀腺腫。
[0020]A.免疫組織化學法
[0021]將腫瘤活組織切片固定于10%緩沖福爾馬林中，進行脫水，然后將其包埋在石蠟塊中。所有免疫組織化學(IHC)反應都在4 u m厚的石蠟切片上進行，在ニ甲苯去除石蠟，再水化。對于免疫組織化學抗K1-67反應，將切片置入檸檬酸鹽緩沖液(pH6.1OmM)在95-98°C的溫度下溫育20分鐘，從而使表位暴露。將其置入3%H202中溫育5分鐘來封閉內源性過氧化物酶活性。MT I/II (克隆E9)和K1-67 (克隆MIB-1)的表達用小鼠單克隆抗體(產自丹麥格洛斯楚普的DakoCytomation公司)測定。檢測的抗原可通過生物素化的抗體和辣根過氧化物酶共軛標記的鏈霉親和素(DakoCytomation LSAB+System-HRP)顯現。酶作用物為ニ氨基聯苯胺(DAB, DakoCytomation)。利用陰性對照進行各反應。利用蘇木精對各樣本進行對比染色。
[0022]B.免疫組織化學反應強度評估
[0023]我們使用根據Remmele的半定量免疫反應積分法來評估金屬硫蛋白表達的強度，并考慮了顯色反應的強度和陽性癌細胞占樣本的百分比。該數值范圍從0至12:0表示無反應’ 1-2表示弱反應,3-4表示中等反應,6-12表示強反應。癌細胞中抗原K1-67的表達強度通過表示陽性細胞占所有癌細胞百分比的數值來評估。該數值對應下述比例:0表示無反應，I代表1-10%, 2代表11-25%, 3代表26-50%, 4代表>50%。
[0024]C.統計分析
[0025]利用軟件Prism5.0package (美國加州GraphPad公司出品)統計分析結果。我們還進行了斯皮爾曼相關性檢驗(Spearman correlation tests),克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(Kruskal-Wallis test)和曼-惠特尼 U 檢驗(Mann-Whitney U test)。當 p〈0.05 時，視為具有統計上的顯著差異。
[0026]在檢測的186例甲狀腺病變中，在180例(96，7%)中發現有金屬硫蛋白在細胞核-細胞質的表達(圖1A、1B)。金屬硫蛋白在73%腫瘤狀甲狀腺腫例、70.9%濾泡狀腺瘤例(圖1A)、45.8%乳頭狀癌例和85.7%濾泡狀癌例(圖1B)中表現出高表達(6_12pkt)。而金屬硫蛋白在33%髓狀癌例中有高表達。
[0027]金屬硫蛋白在濾泡狀癌中呈現最高表達(9.14±3.32)稍低但依然保持極高水平的表達存在于腫瘤狀甲狀腺腫(7.25±3.41)和濾泡狀腺瘤(6.54±3.40)，在乳頭狀癌(4.47±3.14)和髓狀癌(3.22±2.54)中的表達最低。金屬硫蛋白的表達在各甲狀腺病變之間存在統計上的顯著差異性(圖2)。
[0028]金屬硫蛋白表達的強度在濾泡狀癌(圖1B)和濾泡狀腺瘤(圖1A)之間存在統計上的顯著差異，這一點很難通過組織結構區分(圖2，P〈0.05)。在乳頭狀癌中的表達在統計上顯著高于在濾泡狀癌(圖2，P〈0.0001)和髓狀癌(圖2，P〈0.0001)中的表達。在乳頭狀癌(圖2，P〈0.0001)和髓狀癌(圖2，P〈0.005)中的表達在統計上顯著低于在腫瘤狀甲狀腺腫中的表達。
[0029]在131例檢查的病變中，我們在118例中發現抗原K1-67的細胞核表達。在濾泡狀癌中的表達(1.13±0.92)最高(圖3)，依次降低為濾泡狀腺瘤(1.08±0.4)、乳頭狀癌(1.05±0.52)和腫瘤狀甲狀腺腫(1.05±0.22)，最低的是髓狀癌(0.56±0.53)。
[0030]抗原K1-67表達的強度在濾泡狀腺瘤(圖1C)和濾泡狀癌(圖1D)之間沒有統計上的顯著差異。而該抗原表達在髓狀癌和腫瘤狀甲狀腺腫(P〈0.05)之間以及髓狀癌和濾泡狀腺瘤(p〈0.05)之間具有統計上的顯著差異(圖3)。
[0031]通過斯皮爾曼檢驗所評估出的金屬硫蛋白和抗原K1-67的表達在如濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌等病變中的依賴性表示上述抗原間缺乏相關性(r=0.12，p>0.05)。
【權利要求】
1.ー種區分包含濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌的甲狀腺癌變的方法，其特征在于采用抗金屬硫蛋白單克隆抗體，利用免疫組織化學方法評估ー患者的一癌組織樣本中的金屬硫蛋白(MT)的表達，根據Remmele的半定量免疫反應積分法在一光學顯微鏡下評估所述金屬硫蛋白表達的強度，其中若所述金屬硫蛋白的表達強度的半定量免疫反應積分值等于或大于8，確定具有濾泡狀癌。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于檢測金屬硫蛋白亞型MTI和MT II的表達。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于檢測源自經胸腺切除術且腫瘤已摘除的患者的物料中金屬硫蛋白的表達。
4.根據權利要求1-3中任ー權利要求所述的方法，其特征在于對具有濾泡狀癌或濾泡狀腺瘤的確定伴有對所述病變進行一充分的組織評估。
5.ー種區分包含濾泡狀腺瘤和濾泡狀癌的甲狀腺癌變的試劑盒其特征在于包含抗金屬硫蛋白的單克隆抗體。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于包含抗金屬硫蛋白亞型MTI和MT II的單克隆抗體。
7.金屬硫蛋白在區分濾泡狀癌和濾泡狀腺瘤型甲狀腺腫瘤中的用途。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述金屬硫蛋白亞型是MTI和MTII。
【文檔編號】G01N33/577GK103562722SQ201180062178
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2011年12月21日 優先權日:2010年12月22日
【發明者】皮奧特·德茲艾基爾, 瑪茲納·博得爾斯卡奧克羅, 安娜·克羅里卡, 克里斯托弗·克比爾斯基, 巴托斯·普拉, 艾里克桑德拉·皮奧托斯卡 申請人:弗羅茨瓦夫研究中心有限公司