擴增核酸的檢測方法和檢測裝置的制作方法

專利名稱：擴增核酸的檢測方法和檢測裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及擴增核酸的簡便的檢測方法及其裝置。
背景技術：
特異性擴增目標核酸序列的方法已經成為了分子生物學研究領域、基因檢查等臨床應用領域中非常重要的技術。作為特異性檢測通過核酸擴增方法獲得的擴增產物的方法之一有如下方法:將包含目標序列的核酸片段固定在固相上并進行檢測的方法。在該方法中，目標核酸被特異地捕獲在固相上，通過清洗等可以容易地去除非特異性核酸序列，從而可以提聞檢測特異性。目前，使目標核酸捕獲于固相的方法可列舉利用能夠形成特異性結合的抗原-抗體的組合、或配體-受體的組合的方法。例如，非專利文獻I公開了使用引物擴增的PCR產物的檢測方法，所述引物中的一條引物末端用生物素修飾，另一條引物用熒光物質修飾。在該方法中，使PCR產物與由鏈霉親和素-瓊脂糖形成的固相接觸，通過形成鏈霉親和素-生物素復合物與固相結合，并可以通過測量其熒光而檢測目標擴增產物。但是，由于受到能夠作為標記使用的抗原/抗體或配體/受體的組合的限制，實際上難以同時檢測多個目標核酸。此外，熒光標記核酸較為昂貴也存在成本方面的問題。在固相上捕獲目標核酸的其他方法還有將由具有與目標核酸互補的序列的寡核苷酸形成的探針固定在固相上，通過目標核酸與探針的雜交，將目標核酸間接固定在固相上的方法。在該方法中，檢測由雜交體的形成所帶來的信號強度。這類核酸解析方法可以通過改變探針序列而一次性分析多個目標序列。但是，對于在固相上使固定化了的探針與目標核酸雜交，一般地，通過熱處理使PCR方法擴增了的雙鏈核 酸變性成為單鏈的步驟是必需的，加熱處理不僅復雜，而且存在由于再退火導致雜交效率低下的問題。此外，單鏈DNA易于球形化，還具有檢測靈敏度差的問題。專利文獻I中公開了不進行加熱處理、通過核酸酶處理來擴增單鏈核酸的方法，但是，其操作仍然復雜，仍然存在單鏈的球形化的問題。在核酸的檢測方法中，作為操作性優異、迅速、簡便的檢測目標核酸的方法，有基于專利文獻2記載的色譜的方法。該方法是如下基因檢測方法，所述方法是在單個基因檢測裝置上，通過毛細管作用，使包含任意被提取的基因或其片段的液體樣品移動，從而連續進行從細胞、病毒或細菌中提取基因的步驟、將任意被提取的基因片段化的步驟和檢測步驟。可以判斷是否存在目的基因，進一步鑒別它的種類。但是，專利文獻2也是通過NASBA法擴增單鏈核酸。在使用單鏈核酸上的問題如前所述。為了解決上述問題，在專利文獻3和專利文獻4中，通過使引物區域的5’端具有抑制DNA聚合酶催化的核酸合成的非天然核酸標簽、發夾結構或假結(- 一 F' 7 〃卜)結構，從而即使在PCR反應后也在雙鏈核酸的一端保留了單鏈區域。由于僅使用特殊的引物進行PCR反應，就能夠制備下述擴增產物，因此是有利的。所述擴增產物具在雙鏈DNA的一個末端具有能夠雜交的單鏈區域。但是，由于必須通過熒光標記、表面等離子體共振差異成像進行檢測，因此高價的專用裝置是必需的，在快捷性、簡便性等方面存在問題。現有技術文獻專利文獻專利文獻I日本特開平5-252998號公報專利文獻2日本特開2006-201062號公報專利文獻3國際公開第2006/095550號小冊子專利文獻4日本特開2009-296948號公報非專利文獻非專利文獻IAnalytical biochemistry, 193, 231-235, (1991)

發明內容
發明要解決的問題由于在臨床現場進行基因診斷或檢查需要大型且高價的檢查裝置，需要檢查時間，患者的檢查費用、多次去醫院就醫的時間或負擔較重。因此，出于確保檢查的準確性，同時減輕患者和檢查者負擔的原因，需要簡便、快速且特異性高的方法、以及低成本且不需要特殊裝置的方法。本發明是針對上述問題進行的發明，其目的在于提供如下核酸檢測方法和核酸檢測裝置或試劑盒，該方法為有效利用雜交法的高特異性，同時減少PCR產物的檢測步驟所需的時間和步驟，在不需要特殊裝置的條件下，簡便且高精度地目測檢測的核酸檢測方法。進一步的，迄今為止需要針對每個目標核酸制備高價的標記標簽，在勞動力和成本方法還有改良的余地。解決問題的方法本發明人等為了解決上述問題進行深入研究，結果獨創性地發現:將目標核酸作為在兩個末端分別具有單鏈區域的雙鏈核酸進行擴增，使該擴增片段與具有能夠與上述單鏈區域之一進行雜交的寡核苷酸探針的固相相結合，從而檢測核酸，就可以在不需要特殊裝置的條件下，簡便且高精度的檢測上述DNA擴增片段，從而完成了本發明。S卩，本發明涉及核酸檢測方法，其包括:使雙鏈DNA擴增片段的一個末端的單鏈區域與固定在固相上的第I寡核苷酸探針雜交的步驟，所述雙鏈DNA擴增片段是在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段。優選還包括使上述DNA擴增片段的另一個末端的單鏈區域與結合有標志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。標志物優選包括著色擔載體，并可以目測檢測上述DNA擴增片段。優選包括在核酸檢測裝置上檢測上述DNA擴增片段的步驟。優選用色譜檢測上述DNA擴增片段。優選包括 下述步驟(a)-(c):(a)在上述核酸檢測裝置上的不同于固定有上述第I寡核苷酸探針的區域的區域中，配置上述DNA擴增片段的步驟，(b)使用溶劑，使上述DNA擴增片段在朝向固定有上述第I寡核苷酸探針的區域的方向上在上述裝置上擴散的步驟，以及
(c)在固定有上述第I寡核苷酸探針的區域中，使上述第I寡核苷酸探針與上述DNA擴增片段雜交的步驟。優選還包括在上述步驟(C)之前，使上述DNA擴增片段與結合有上述標志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。優選:(d)在上述核酸檢測裝置上的不同于固定有上述第I寡核苷酸探針的區域的各個區域中，分別配置上述DNA擴增片段、以及結合有所述標志物的第2寡核苷酸探針，(e)使用溶劑，使上述DNA擴增片段在朝向配置有第2寡核苷酸探針的區域的方向上擴散，所述第2寡核苷酸探針結合有上述標志物，(f)在配置了結合有上述標志物的第2寡核苷酸探針的區域中，使上述DNA擴增片段與結合有標志物的第2寡核苷酸探針雜交，(g)使在步驟(f)中雜交而得到的復合物在朝向配置有上述第I寡核苷酸探針的方向上在展開介質上擴散，以及(h)在固定有上述第I寡核苷酸探針的區域中，使上述第I寡核苷酸探針與上述復合物雜交。上述包含天然核苷酸的單鏈區域優選是與雙鏈DNA區域相同方向的序列。上述DNA擴增片段優選是使用2種下述引物且通過核酸擴增方法獲得的產物，所述引物具有在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域。上述DNA擴增片段優選是使用第I引物組和第2引物組且通過核酸擴增方法獲得的產物，所述第I引物組包括下述引物，該引物具有能夠與目標核酸的模板雜交的序列、和不能夠與該模板雜交的共同序列，以及所述第2引物組包括下述引物，該引物具有能夠與上述共同序列的互補序列雜交的序列、和在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域。優選上述在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域包括天然核苷酸，且第2引物組的引物全長為相同方向的序列。此外，本發明涉及在上述核酸檢測方法中使用的核酸檢測裝置，其具有:配置上述DNA擴增片段的區域，保持有上述第I寡核苷酸探針的色譜擔載體，所述第I寡核苷酸探針待與上述DNA擴增片段結合，以及結合有標志物的上述第2寡核苷酸探針。此外，本發明涉及雙鏈DNA擴增片段，其為使用具有在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域的2種引物且通過核酸擴增方法而獲得的、并在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段。優選引物的在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域包括天然核苷酸，且引物全長為相同方向的序列。發明的效果通過本發明，可以利用DNA擴增產物的單鏈區域、特異地與固相結合，進一步的，可以利用另一個末端的單鏈區域與目標化合物形成復合物，能夠在不使用特殊裝置的條件下，簡便、快速的目測判斷DNA擴增產物。此外，通過檢測結構上穩定的雙鏈DNA，使得檢測靈敏度比檢測全長單鏈更高。此外，通過準備用于結合固相的擴增產物的單鏈區域和與其互補的固相上的寡核苷酸探針的多種組合 ，還可以同時鑒別存在于樣品中的2種以上的目標核酸。此外，使用本發明的其他實施方式，可以通過廉價的聯合引物(joint primer),在所有目標核酸上添加相同的單鏈區域。利用該相同的單鏈區域，可以使用相同的標記標簽和裝置進行檢測。在此情況下，不必針對每個目標核酸來制備高價的標記標簽，可以極大的改善時間和成本。


圖1為本發明的PCR用引物的示意圖。圖2為本發明的PCR用第I引物的示意圖。圖3為本發明PCR用第2引物的示意圖。圖4為本發明的部分雙鏈核酸的合成方法示意圖。圖5為本發明的部分雙鏈核酸的合成方法的其他實施方式的示意圖。圖6為顯示本發明的核酸色譜裝置的一個例子的示意圖。圖7為本發明的PCR產物檢測原理的示意圖。圖8為顯示本發明的微陣列(DNA芯片)的一個例子的示意圖。

圖9為顯示本發明的珠狀擔載體的一個例子的示意圖。
具體實施例方式本發明涉及核酸檢測方法，包括使雙鏈DNA擴增片段的一個末端的單鏈區域與固定在固相上的第I寡核苷酸探針雜交的步驟，所述雙鏈DNA擴增片段是在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段。雙鏈DNA擴增片段是針對作為模板的樣品DNA，使用特定的引物組進行核酸擴增反應而獲得的。樣品DNA沒有特殊的限制，只要可以作為核酸擴增反應的模板使用即可。具體而言，可以使用血液、體液、組織、口腔黏膜、毛發、爪、培養細胞、動物、植物、微生物等所有源自生物樣品的DNA。此外，上述樣品DNA可以是基因組DNA、cDNA、線粒體DNA和葉綠體DNA等。此外，也可以使用以RNA為模板逆轉錄后獲得的cDNA。這些DNA可以根據擴增的DNA片段來恰當的選擇。此外，樣品DNA不必是純化的DNA，可以是包含樣品DNA的細胞或組織，在不進行純化處理的條件下，直接適用于核酸擴增反應。在兩個末端具有單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段優選是使用2種下述引物且通過核酸擴增方法獲得的產物，所述引物具有在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域。在此情況下，雙鏈DNA擴增片段的兩個末端的單鏈區域是源自核酸擴增反應中使用的引物中的、通過核酸擴增反應不被雙鏈化的標簽區域的區域。圖1顯示了用于核酸擴增的引物。該引物包括引物本體區域I和位于上述引物本體部分的5’末端的通過核酸擴增反應不被雙鏈化的標簽區域2。此外，引物本體區域和標簽區域之間可以具有包括聚合酶反應抑制區域3的間隔區結構。此外，雙鏈DNA擴增片段優選是使用第I引物組和第2引物組且通過核酸擴增方法獲得的產物，所述第I引物組包括具有能夠與目標核酸的模板雜交的序列、和不能夠與該模板雜交的共同序列的引物，并且所述第2引物組包括具有能夠與上述共同序列的互補序列雜交的序列，和在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域的引物。圖2顯示了構成PCR用第I引物組的引物。PCR用第I引物(聯合引物)的特征是包括能夠與目標核酸的模板雜交的引物本體區域4和位于上述引物本體區域的5’端的共同區域5，所述共同區域5包括與第2引物共同的序列。圖3顯示了構成PCR用第2引物組的引物。第2引物的特征是包括具有與上述第I引物共同的序列的引物本體區域6，和位于本體區域6的5’末端的通過核酸擴增反應不被雙鏈化的標簽區域7。第2引物本體區域和標簽區域之間，可以具有包括聚合酶反應抑制區域8的間隔區結構。引物本體區域是指具有在核酸擴增反應中能夠作為引物發揮作用的堿基序列的寡核苷酸區域。具體而言，是能夠與目標核酸的目標堿基序列的5’末端或3’末端雜交的序列；一般而言，是與目標堿基序列的5’末端或3’末端的堿基序列互補的堿基序列。這些引物本體區域只要可以與目標核酸特異性結合即可，可以具有堿基缺失、插入和錯配位點。引物本體區域的長度優選是8個堿基以上，更優選是12個堿基以上，更優選是15個堿基以上。此外，引物的鏈長沒有特殊的上限，從它的合成成本等觀點來看，通常50個堿基以下，或者40個堿基以下是合適的。引物的標簽區域只要是包含天然核苷酸即可，沒有特殊的限制。天然核苷酸是指由天然的腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶堿基，以及脫氧核糖、核糖糖基，以及磷酸基形成的核苷酸，各部分都是未經人工修飾的核苷酸。天然核苷酸可以是D型核苷酸，也可以是L型核苷酸。D型核苷酸表示包含D型脫氧核糖或核糖的核苷酸。此外，L型核苷酸表示包含L型脫氧核糖或核糖的核苷酸 的標簽區域中的天然核苷酸的比例優選在5%以上，更優選在20%以上，更優選在50%以上，更優選在70%以上，最優選在90%以上。標簽區域的長度沒有特殊的限制，只要是具有對于與互補鏈核酸雜交而言為足夠的長度即可。通常是5個堿基-60個堿基，優選是6個堿基-40個堿基。引物的標簽區域的核酸方向優選朝向與引物本體區域相同的方向排列。通過朝向與引物本體區域相同的方向來排列引物的標簽區域的核酸方向，實現了廉價且方便的合成的效果。標簽區域和引物本體區域即使沒有直接連接，例如，在標簽區域和引物本體區域之間插入偶氮苯這樣的非天然化合物時，也優選朝向相同的方向排列。在本文中，核酸為相同方向是指相鄰的核苷酸是通過核苷酸糖基的5’位和3’位之間的磷酸二酯鍵而結合，并不是通過3’位和3’位之間或者是5’位與5’位之間的磷酸二酯鍵而結合。例如，標簽區域中的核苷酸彼此之間通過磷酸二酯鍵在糖基的5’位和3’位之間結合時，本體區域中的核苷酸彼此之間也在糖基的5’位和3’位之間形成連接。聚合酶反應抑制區域，其只要是能夠抑制聚合酶催化的核酸延伸反應，保持該區域的單鏈結構即可，沒有特殊的限制。這類結構包括:具有穩固的發夾結構或假結結構這一類抑制聚合酶行進的立體結構的核酸序列 、或L型核酸或人工核酸等非天然核酸、或RNA、和脂肪鏈這類非核酸結構。“發夾結構”或“假結結構”是指與同一分子中的另一單鏈區域配對所形成的穩定的環狀結構。L型DNA是包含L型脫氧核糖的DNA，由于不能被一般使用的DNA聚合酶識別，因此不具有作為DNA延伸反應的模板的功能。進一步的，L型DNA由于形成左旋的雙螺旋結構，不能與天然存在的D型核酸形成雜交體，而僅可以在L型核酸之間形成雜交體。人工核酸是指人為插入在天然核酸序列中不存在的化合物而得的核酸。可列舉例如肽核酸(PNA)、交聯核酸(BNA或LNA)或偶氮苯、熒光素、Cy3、Cy5等，但不限于此。
PNA是指在主鏈中保留了肽結構，并具有與DNA或RNA類似結構的分子，N-(2-氨基乙基)甘氨酸以酰胺鍵相結合而得到的物質作為主鏈。因此，與核酸堿基相對應的嘌呤環或嘧啶環通過亞甲基和羰基與主鏈結合。BNA (LNA)表示通過交聯修飾DNA或RNA的糖基結構而人工合成的核酸。在標簽區域僅由天然核苷酸組成，且標簽區域的核酸方向與引物本體區域的方向相同的情況下，通常與引物區域之間需要聚合酶反應抑制區域。另一方面，在當標簽區域是L型核酸或人工核酸等這類不能作為DNA聚合酶催化的反應的模板、且在核酸擴增反應后也不被雙鏈化的情況下，也可以省略聚合酶反應抑制區域。此外，本發明的引物可以單獨具有發夾結構、假結結構等穩定的環狀結構、L型核酸、人工核酸等非天然核酸、以及脂肪鏈等非核酸結構等，也可以具有多個的組合。可以通過寡核苷酸標記中常用的各種分子來標記引物。這類分子可列舉酶、磁性顆粒、熒光色素、放射性同位素等。這些分子可以單獨使用，也可以組合多個來使用。制備所設計 的引物的方法沒有特殊的限制，可以通過公知的方法來制備。具體而言，使用DNA合成裝置，利用委托合成服務，可以容易的獲得設計的引物。核酸擴增方法只要是使用上述引物，獲得在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段的方法即可，沒有特殊的限制。可列舉例如PCR。此外，也可以使用LAMP法、ICAN法等等溫擴增方法。在使用PCR作為核酸擴增方法時，作為用于PCR反應中的反向引物和正向引物的組合，可以使用與兩條引物不同的聚合酶反應抑制區域，也可以在一條中使用聚合酶反應抑制區域，在另一條中不導入聚合酶反應抑制區域而是進行生物素等修飾。PCR條件沒有特殊的限制，在以上述樣品DNA作為模板，使用上述引物組進行PCR時，只要是可以擴增樣品DNA的預期區域的條件即可。具體而言，用于PCR的聚合酶沒有特殊的限制，更優選是耐熱性DNA聚合酶，更優選是實質上沒有3’ 一 5’外切核酸酶活性的耐熱性DNA聚合酶。此類耐熱性DNA聚合酶可列舉Ex-Taq (TAKARA BIO公司生產)等，但不限于此。此外，對溫度、時間、緩沖液組成等PCR反應條件也沒有特殊的限制，可以根據所選擇的DNA聚合酶、引物序列、目的序列部分的長度等，恰當地設置。通過核酸擴增反應擴增的DNA長度優選是20個堿基以上，更優選是40個堿基以上。如果少于20個堿基，則非特異性擴增的傾向增加。使用上述引物組，通過常規方法進行PCR，可以獲得在目標核酸序列的兩末端添加了單鏈區域的擴增產物。圖4顯示了擴增反應的一個例子，是在使用了包含引物本體區域和標簽區域的引物時的擴增反應的模式圖。正向引物10具有引物本體區域11和位于其5’末端的標簽區域12，所述引物本體區域11包括與目標核酸序列9的5’末端的一部分相同的序列。反向引物13具有引物本體區域14和位于其5’末端的標簽區域15，所述引物本體區域14包括與目標核酸序列的3’末端的一部分互補的序列。兩條引物結合的標簽區域的序列通常分別具有不同的序列。使用上述引物組進行PCR時，由于添加在兩條引物上的標簽區域實際上不參與PCR反應，因此，獲得了在兩個末端具有單鏈區域的DNA擴增產物16。在兩個末端具有單鏈區域的DNA擴增片段是指下述DNA擴增產物，如圖4所示的，所述DNA擴增產物具有與目標DNA區域相同的雙鏈DNA部分，以及在其兩側各自的5’末端具有作為標簽部分的單鏈區域。換言之，如果對上述DNA擴增片段更詳細的說明，其表示在兩個末端具有包含沒有修飾的核酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段，并且，兩個末端的單鏈區域分別具有與其所連接的DNA鏈方向相同的序列。圖5顯示了擴增反應的一個例子，是在使用了包含引物本體區域和共同序列區域的引物作為聯合引物組、以及包含共同序列和標簽區域的引物的情況下的擴增反應的模式圖。使用第I和第2引物組，通過常規方法進行PCR，可以獲得在目標核酸序列的兩末端添加了單鏈區域的擴增產物。正向第I引物18具有引物本體區域19及位于其5’末端的共同序列區域20，所述引物本體區域19包括與目標核酸序列17的5’末端的一部分相同的序列。反向第I引物21具有引物本體區域22及位于其5’末端的共同序列區域23，所述引物本體區域22包括與目標核酸序列的3’末端的一部分互補的序列。在兩條引物中添加的共同區域的序列通常分別具有不同的序列。使用上述第I引物組進行PCR，獲得具有共同區域的雙鏈DNA擴增產物24。此外，DNA擴增產物24的兩端的共同序列區域的正向第2引物25，具有引物本體區域26及位于其5’末端的標簽區域27，所述引物本體區域26包括與具有上述共同區域的雙鏈DNA擴增產物24的5’末端的一部分相同的序列。反向第2引物28具有引物本體區域29及位于其5’末端的標簽區域30，所述引物本體區域29包括與具有上述共同區域的雙鏈DNA擴增產物24的3’末端的一部分共同的互補的序列。兩條引物中結合的標簽區域的序列通常分別具有不同的序列。使用上述引物組進行PCR時，由于添加在兩條引物上的標簽區域實際上不參與PCR反應，因此，獲得了在兩個末端具有單鏈區域的DNA擴增產物31。在該實施方式中，使用第I引物的PCR反應和使用第2引物的PCR反應，如圖5所示連續進行，其順序可以是同時添加第I引物和第2引物。或者也可以是后添加第2引物。在兩個末端具有單鏈區域的DNA擴增片段是指如圖5的31所示，具有與目標DNA區域相同的雙鏈DNA部分，及在其兩側的5’末端分別具有作為標簽部分的單鏈區域的DNA擴增產物。

通過使用第I和第2引物組，即使改變目標核酸，通過將共同序列設計為相同的序列，第2引物可以使用相同的引物，可以制備出相同的單鏈標簽序列。如果對上述DNA擴增片段更詳細的說明，其表示在兩個末端具有包含沒有修飾的核酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段，并且，兩個末端的單鏈區域分別具有與其所連接的DNA鏈方向相同的序列。利用使用上述引物獲得的上述擴增產物的單鏈區域，形成雜交復合物。雜交是指包含核酸的分子互補地形成復合物，除DNA/DNA外，還包括DNA/RNA、DNA/PNA、L-DNA/L-DNA等。在本發明的核酸檢測方法中，由于DNA擴增片段具有單鏈區域，因此，在核酸擴增步驟中獲得的DNA擴增產物可以不進行熱處理等單鏈化處理等，就用于雜交反應中。可以使在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域標簽的雙鏈DNA擴增片段的一個單鏈區域，與固定在用于捕獲的擔載體(固相)上的第I寡核苷酸探針雜交。優選還包括使雙鏈DNA擴增片段的另一個單鏈區域，與直接或間接結合了標志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。雙鏈DNA擴增片段、第I寡核苷酸探針和第2寡核苷酸探針這3者的復合物的形成被稱為夾心雜交。此外，對三者的雜交順序沒有特殊的限制。對第I寡核苷酸探針的長度沒有特殊的限制，只要能夠與雙鏈DNA擴增片段的單鏈區域雜交即可，優選5-60個堿基長，更優選10-40個堿基長。
對第2寡核苷酸探針的長度沒有特殊的限制，只要能夠與雙鏈DNA擴增片段的單鏈區域雜交即可，優選5-60個堿基長，更優選10-40個堿基長。與第2寡核苷酸探針結合的標志物沒有特殊的限制，只要能夠實現雙鏈DNA擴增片段的檢測即可，優選能夠實現目測檢測雙鏈DNA擴增片段的著色擔載體。這類著色擔載體可列舉著色顆粒、酶或色素結合但載體等。其中，優選使用著色顆粒。著色顆粒可列舉包括金、銀、銅、鉬等金屬的膠體粒子、用色素或染料等使膠乳著色而形成的著色膠乳、將色素分子固定在硅石(二氧化硅)顆粒內部的硅石納米顆粒等。其中，優選使用金膠體顆粒、由藍色、紅色等著色的水分散型高分子聚合物所形成的著色膠乳顆粒。通過使用這類著色顆粒，可以方便的目測判斷DNA擴增片段。特別是當同時檢測多個對象時，通過每個對象使用不同顏色的著色顆粒，可以方便地同時目測判斷多個對象。在使用著色顆粒的情況下，對顆粒的粒徑沒有特殊的限制，優選是對夾心雜交復合物的形成和在固相上捕獲包含目標序列的擴增產物的不利影響小，且在檢測時顯色好的粒徑。著色顆粒的粒徑選自比下述用于色譜的介質的孔徑更小的粒徑。具體而言，通常使用500nm以下的,其中優選0.1nm-1OOnm,更優選lnm_50nm的。作為著色擔載體使用的酶是指催化顯色或發光的底物的反應的蛋白質。可列舉例如過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素酶等，只要能夠用肉眼檢測即可，沒有特殊的限制。對雙鏈DNA擴增片段末端的單鏈區域與第I或第2寡核苷酸探針的雜交條件沒有特殊的限制，只要是發生雜交的條件即可，優選是在室溫下，IOmM磷酸緩沖液中反應。此時，通過加入氯化鈉等鹽，可以提高雜交效率。通過檢測在捕獲擔載體(固相)上的能夠識別的位置所形成的夾心雜交復合物中所包含的標志物，可以判斷有無目標核酸。檢測優選通過目測判斷。通過本發明的檢測方法，核酸擴增反應的擴增產物可以在不進行熱變性等單鏈化處理的條件下，直接用于雜交反應。此外，也不需要特殊的裝置，就可以簡單、迅速的目測判斷有無目標核酸。

上述通過形成夾心雜交復合物而檢測核酸的方法，優選在核酸檢測裝置上實施。此外，優選用色譜檢測DNA擴增核酸。圖6的核酸色譜裝置是在作為基體材料的構件36上，使用粘合劑等貼合樣品墊32 (用于添加DNA擴增產物的擔載體)、聯結墊33 (配置有結合了著色擔載體的寡核苷酸的擔載體)、保持有捕獲用寡核苷酸的擔載體34 (色譜用介質)和吸收墊35。在擔載體34上，設計了涂抹了捕獲用寡核苷酸的測試線37和控制線38。當將結合著色擔載體的寡核苷酸混合在展開溶液中時，也可以沒有聯結墊33。色譜優選通過包括下述步驟(a)-(c)的方法，檢測雙鏈DNA擴增片段:(a)在核酸檢測裝置上的不同于固定有第I寡核苷酸探針的區域的區域中，配置DNA擴增片段的步驟；
(b)使用溶劑，使DNA擴增片段在朝向固定有第I寡核苷酸探針區域的方向上在裝置上擴散的步驟；以及(c)在固定有第I寡核苷酸探針的區域中，使第I寡核苷酸探針和DNA擴增片段雜交的步驟。例如，在圖6的核酸色譜裝置的情況下，在步驟(a)中，DNA擴增片段配置在樣品墊32上。在步驟(b)中，按箭頭方向使DNA擴增片段擴散。在步驟(c)中，在測試線37中，通過與固定的第I寡核苷酸探針雜交，捕獲DNA擴增片段。在步驟(c)之前，優選還包括使DNA擴增片段與結合有標志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。例如，在圖6的核酸色譜裝置的情況下，DNA擴增片段和第2寡核苷酸探針在聯結墊33中雜交。此外，色譜優選是(d)在核酸檢測裝置上的不同于固定有第I寡核苷酸探針的區域的各個區域中，分別配置DNA擴增片段、以及結合有標志物的第2寡核苷酸探針；(e)使用溶劑，使DNA擴增片段在朝向配置有第2寡核苷酸探針的區域的方向上擴散，該第2寡核苷酸結合有標志物；(f)在配置了結合有標志物的第2寡核苷酸探針的區域中，使DNA擴增片段與結合有標志物的第2寡核苷酸探針雜交；(g)使在步驟(f)中雜交而得的復合物在朝向配置有第I寡核苷酸探針的方向上在展開介質上擴散；以及(h)在固定有上述第I寡核苷酸探針的區域中，使上述第I寡核苷酸探針與上述復合物雜交。
例如，在圖6的核酸色譜裝置的情況下，在步驟(d)中，DNA擴增片段配置在樣品墊32上，第2寡核苷酸探針配置在聯結墊33上。在步驟(e)中，DNA擴增片段從樣品墊32按箭頭方向擴散。在步驟(f)中，DNA擴增片段和第2寡核苷酸探針在聯結墊33中雜交。在步驟(g)中，DNA擴增片段和結合了標志物的第2寡核苷酸探針的復合物按箭頭方向擴散。在步驟(h)中，第I寡核苷酸探針和復合物在測試線37中雜交。將具有與上述DNA擴增片段的一個標簽區域互補的序列的寡核苷酸探針，作為用于捕獲的第I寡核苷酸探針，固定在膜上的測試線中。用于捕獲的第I寡核苷酸探針可以直接與膜結合，也可以通過官能團結合，也可以通過任何物質與膜結合。作為中介的物質可列舉肽、蛋白質、核酸等，沒有限制。當作為中介的物質是抗生物素蛋白時，用于捕獲的寡核苷酸需要進行生物素修飾。在膜上的控制線中，固定有用于捕獲著色擔載體的寡核苷酸探針。用于控制線的寡核苷酸探針具有與結合有標志物的第2寡核苷酸探針互補的序列，使得當溶液展開時，必然捕獲標志物。用于控制線的寡核苷酸探針也如前所述，同樣可以直接與膜結合，也可以通過官能團結合，也可以通過任何物質與膜結合。作為中介的物質可列舉肽、蛋白質、核酸等，沒有限制。當作為中介的物質是抗生物素蛋白時，用于捕獲的寡核苷酸需要進行生物素修飾。通過在測試線中顯色，可以目測判斷樣品中存在目標核酸。另一方面，通過控制線中的顯色，可以目測判斷正常進行了展開與著色反應。在本文中，目測是指用肉眼觀察判斷顏色。色譜用介質可列舉包括定性濾紙、定量濾紙、分液濾紙、玻璃纖維濾紙、二氧化硅纖維濾紙、復合纖維濾紙在內的濾紙等。此外，也可以使用硝化纖維素等包含纖維素的濾紙、聚醚砜膜等合成樹脂的膜、硅膠、瓊脂糖、葡聚糖、明膠等多孔凝膠。此外，也可以恰當的使用尼龍膜。在實際使用時，對該色譜介質的形態和大小沒有特殊的限制，只要適合操作和觀察反應結果即可。為了提高親水性或與化合物的結合性，可以對這些擔載體實施各種修飾。為了使操作更簡單，優選在表面形成反應部位的色譜介質的內部，設計包括塑料等在內的支持物。裝置內的展開方向可以是如圖6所示的水平方向，也可以是垂直方向，沒有特殊的限制。對于展開溶劑，由于可以在核酸擴增反應中使用溶劑，因此可以直接將核酸擴增反應后的反應液滴至圖6中的樣品墊32上。或者，也可以在擴增反應后的反應液中另外添加展開溶液并加至樣品墊中。展開溶劑只要是液體即可，沒有特殊的限制，可以使用磷酸緩沖液、Tris緩沖液等優秀的緩沖液。此外，也可以在溶劑中溶解鹽、表面活性劑、蛋白質或核酸。在圖7中，作為本發明的實施方案的一個例子，以在層析擔載體上形成的夾心雜交復合物為例進行說明。在不進行熱處理等單鏈化處理的條件下，將核酸擴增步驟中獲得的DNA擴增片段16用于之后的復合物形成步驟中。通過寡核苷酸探針與DNA擴增片段16之間的雜交，形成第I復合物41，所述寡核苷酸探針包括能夠與上述DNA片段一個末端的標簽區域12特異性結合的核酸序列39和著色擔載體40。復合物41可以在上樣至展開介質之前在PCR反應容器中形成，也可以將DNA擴增片段上樣至擔載體上，并使其利用毛細管現象，在移動中，使其通過涂布了與上述標記分子結合的寡核苷酸并干燥了的擔載體而形成。復合物41與用于捕獲的寡核苷酸探針43在展開介質上接觸，所述寡核苷酸探針43預先結合在了包括多孔膜等的色譜用介質42上的能夠識別的位置上。上述用于捕獲的寡核苷酸43具有與上述DNA擴增片段的另一個末端的標簽序列15互補的序列，通過復合物41與用于捕獲的寡核苷酸雜交，形成夾心雜交復合物。形成夾心雜交復合物的順序沒有特殊的限制。優選在形成DNA擴增片段與結合有標志物的第2寡核苷酸探針的復合物41之后，形成與用于捕獲的第I寡核苷酸探針的復合物，但也可以在展開介質上通過用于捕獲DNA擴增片段的第I寡核苷酸探針來濃縮DNA擴增片段之后，展開結合了標志物的第2寡核苷酸，形成夾心雜交復合物。其他的核酸檢測裝置的實施方式可列舉圖8所示的微陣列(DNA芯片)。在微陣列44上的固定有用于捕獲的寡核苷酸的孔內，可以通過夾心雜交形成3者的復合物。此外，可列舉圖9所示的珠狀方式。在保持有用于捕獲的寡核苷酸的珠狀載體45上,可以通過夾心雜交成3者的復合物。

本發明的核酸檢測方法和核酸檢測裝置可用于包括核酸擴增步驟的所有技術。換言之，可用于包括檢測通過核酸擴增法得到的DNA擴增片段(例如，PCR產物)的所有技術領域。具體而言，可用于例如分子生物學的研究領域、病原體檢測、過敏原等食品中的摻入物檢測、食品質量管理(仿冒食品、基因重組食品等的檢查)、家畜管理、堿基多態性(下文也稱為“SNP”)檢測、癌癥等疾病檢查等。因此，本發明還包括了病原體感染癥的檢測方法、食品中的混合物(例如，過敏原)的檢測方法、食品質量管理、家畜的管理方法和堿基多態性的檢測方法等，上述方法包括本發明所涉及的核酸檢測方法作為一個步驟。在本文中，作為本發明應用的一個實施方案，詳細的說明本發明所涉及的病原體檢測方法和過敏原的檢測方法。本發明所涉及的病原體檢測方法使用了本發明所涉及的核酸檢測方法，只要包括檢測病原體特有基因的步驟即可。上述病原體沒有特殊的限制，具體而言，可列舉例如病原性細菌、病原性病毒、食物中毒細菌、醫院內感染病原菌和病毒等。更具體而言，可列舉例如丙型肝炎病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、皰疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)等病毒、0157等大腸桿菌、結核菌、傷寒桿菌、沙門氏菌或腸炎弧菌等細菌、或支原體等微生物。對本發明所涉及的病原體檢測方法更具體的說明是:例如，使用上述核酸檢測方法，判斷由作為檢查有無病原體的對象的樣品制備的DNA樣品中，是否包含上述病原體特有的基因。此外，在不制備DNA樣品的條件下，可以將作為檢查有無病原體的對象的樣品直接作為核酸擴增法的模板使用。例如，在檢測作為病原體的大腸桿菌等細菌的情況下，可以使用細菌菌落的懸浮液作為模板。其結果是，當檢測到病原體特有的基因時，判斷所述樣品中包含病原體。因此，可以不需要特殊的裝置，簡單且高精度地判斷樣品中是否包含病原體。S卩，本發明所涉及的病原體檢測方法可用于診斷微生物感染癥。本發明所涉及的過敏原的檢測方法只要包括使用本發明所涉及的核酸檢測方法，檢測編碼過敏原的基因的步驟即可。上述過敏原沒有特殊的限制，具體而言，可列舉例如包含在食品中的過敏原。更具體而言，可列舉蛋清過敏原、乳過敏原、小麥過敏原、蕎麥過敏原和花生過敏原等。對本發明所涉及的過敏原的檢測方法更具體的說明是:例如，使用上述核酸檢測方法，判斷從食品制備的DNA樣品中，是否存在編碼蛋、乳、小麥、蕎麥、花生等過敏原的基因。其結果是在檢測到這類基因的情況下，判斷所述食品中包括含有過敏原的原材料。因此，不需要特殊的裝置，就可以簡單且高精度地判斷食品等樣品中是否包含具有過敏原的原材料。此外，過敏原的來源不限于上文示例的對象，例如以谷類為例，包括稻、玉米、小米、黍、稗子、蕎麥和豆類的全部。此外，DNA是熱穩定的，也可以在加工食品中進行微量檢測。因此，通過本發明所涉及的過敏原的檢測方法獲得的數據，除了用于食品標示、食品的過敏原信息外，還可用于檢測極微量殘存的加工助劑或殘留物等食品添加物，或者生產線之間有無相互污染等生產者預料以外的物質的摻入。此外，本發明可用于包括人在內的哺乳動物的親子鑒定、家畜的血統鑒定、農產品品種鑒定、SNP檢測、由于基因突變造成的疾病(癌等)檢測等。具體而言，例如，以家畜為例，可用于血統登記、個體識別、親子鑒定、去除病原基因攜帶個體等目的。但本發明并不限于上文說明的各種構成，可以在權利要求保護的范圍所表示的范圍內進行各種改變，對于恰當的組合不同實施方案中啟示的技術手段所獲得的實施方案，也包括在本發明的技術范圍內。

實施例下面通過實施例更詳細地說明本發明。但本發明的技術范圍不限于這些實施例。〈實施例1>(I)連接有L-DNA標簽的引物的合成在本實施例中，使用pUC19 (Takara Bio公司生產)作為模板，設計了用于通過PCR擴增擴增約330個堿基對的正向引物(F)和反向引物(R)。進一步地，設計了分別在上述引物的5’末端導入了由非天然型(L型)DNA鏈形成的標簽序列Tl和T2的連有L-DNA標簽的引物，即Tl-F和T2-R。連接有L-DNA標簽的引物的合成使用0.2 μ M尺寸的柱子，基于一般的亞磷酰胺法，使用DNA自動合成儀(H-8-SE =Gene World)合成。示出在本研究中制備的引物組。引物F:5’ -Dd (GGAAACAGCTATGACCATGA) -3’ (序列號 I)引物R: 5 ’ -Dd (CTATGCGGCATCAGAGCAG) -3 ’ (序列號 2)標簽序列Tl:5’ -Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)-3’ (序列號 3)標簽序列T2:5 ’ -Ld (ATGCTACCGTATGCCCAGTG) -3 ’ (序列號 4)引物Tl-F:5，-Ld (GACAACGGAGACAGAGCCAA) -Dd (GGAAACAGCTATGACCA TGA) -3 ’ (序列號 5)
引物T2-R:5，-Ld (ATGCTACCGTATGCCCAGTG) -Dd (CTATGCGGCATCAGAGCAG) -3 ’ (序列號 6)。(2)使用連接有L-DNA標簽的引物組的PCR反應使用在上述步驟(I)中實施制備的引物組進行PCR反應。將各15pmol引物F和引物R、10ng pUC19添加到0.2M1 PCR管中，根據ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產)的說明書，配制100 μ I的PCR反應液。然后，將PCR管放入熱循環儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產)中，在95°C熱處理5分鐘后，進行35個95°C下30秒、55°C下30秒、72°C下30秒的循環，擴增約330bp的目標。此外，進行不添加pUC19的相同反應，作為陰性對照。(3)制備與膠乳結合的L型寡核苷酸探針在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(固體成分10%(w/w) >Bangs公司生產)和含有氨基的L型寡核苷酸探針(序列號7、序列號3的互補鏈)，在結合后，用單乙醇胺進行嵌段。在離心分離上述反應液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，將其均勻的添加在用玻璃纖維生產的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯結墊。核苷酸探針1:5’ -Ld(TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC)-NH2-3’ (序列號 7)。(4)將L型寡核苷酸探針固定在固相上用水溶性碳化二亞胺處理羧基修飾的尼龍膜(日本Pall公司生產、6mmX60mm),用去離子水洗滌。在距活化的膜的一個末端30mm處，用分配器將具有與序列號4互補的序列(序列號8)的含有氨基的L型寡核苷酸探針涂抹在線上，風干15分鐘。然后，用Tris緩沖液處理膜，在嵌段后，水洗膜并干燥。核苷酸探針2:5 ’ -Ld (CACTGGGCATACGGTAGCAT) _NH2_3 ’ (序列號 8)。(5)制備核酸色譜型測試條(test strip)如圖6所示，將如上所述制備的由尼龍膜構成的色譜介質、聯結墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標志物的吸收墊，貼合在由底板(backingsheet)制成的基體材料上，制備了用于檢測使用了連接有L型DNA標簽的引物組的PCR擴增產物的測試條。(6)用測試備檢測PCR產物在不變性通過步驟(2)制備的PCR產物的條件下，將所述產物直接上樣于通過步驟(5)制備的測試條上的樣品添加部位，通過色譜進行檢測。當步驟(2)中添加pUC19作為檢查材料時，在測試線上檢測到目標核酸特異性的著色線。另一方面，當添加水作為陰性對照時，沒有發現檢測到線。此外，用色譜檢測所需要的時間是10-15分鐘的短時間。〈實施例2>(I)合成連接有發夾標簽的引物與實施例1的步驟(I)相同，使用pUC19 (Takara Bio公司生產)作為模板,設計用于通過PCR擴增擴增約330個堿基對的正向引物(F)和反向引物(R)。還分別在上述引物的5’末端導入具有發夾結構的聚合酶反應抑制區域(H)和標簽序列T3和T4，合成連接有標簽的引物T3-H-F和T4-H-R。示出在本研究中制備的引 物組。
聚合酶反應抑制序列H:5，-Dd (AGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTC GCCT) -3 ’ (序列號 9)標簽序列 :5’ -Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)_3’ (序列號 10)標簽序列T4:5’ -Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAAT)-3’ (序列號 11)引物T3-H-F:5’ -Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAATAGGCGAGGTCGCGAGC GCACATG TGCGCTCGCGACCTCGCCTGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號 12)引物T4-H-R:5’ -Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCAC ATGTGC GCTCGCGACCTCGCCTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’ (序列號 I3)。(2)使用了連接有發夾標簽的引物組的PCR反應使用了在上述步驟⑴中實施制備的引物組進行PCR反應。將各15pmol引物F和引物R、10ng pUC19添加到0.2ml PCR管中，根據ExTaq PCR裝置(Takara Bio公司生產)的說明書，配制100 μ I PCR反應液。然后，將PCR管放入熱循環儀(GeneAmp PCR System、Applied Biosystems公司生產)中，在95°C熱處理5分鐘后，進行35個95°C下30秒、55°C下30秒、72°C下30秒的循環，擴增約330bp的目標。此外，進行不添加pUC19的相同反應，作為陰性對照。(3)制備與膠乳結合的寡核苷酸探針在添加了必需量的水溶性碳化二亞胺的MES緩沖液中，混合含有羧基的聚苯乙烯膠乳(固體成分10%(w/w)、Bangs`公司生產)和含有氨基的寡核苷酸探針(序列號14、序列號10的互補鏈)，在結合后，用單乙醇胺進行嵌段。在離心分離上述反應液后，去除上清液，用水洗滌獲得的沉淀。洗凈后，重新懸浮在含有表面活性劑的HEPES緩沖液中，將其均勻的添加在用玻璃纖維生產的墊片上，然后通過真空干燥器干燥，作為聯結墊。寡核苷酸探針3:5，-Dd (ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA) _NH2_3 ’ (序列號 14)。(4)將寡核苷酸探針固定在固相上用水溶性碳化二亞胺處理羧基修飾的尼龍膜(日本Pall公司生產、6mmX60mm),用去離子水洗滌。在距活化的膜的一個末端30mm處，用分配器將具有與序列號11互補的序列(序列號15)的含有氨基的L型寡核苷酸探針涂抹在線上，風干15分鐘。然后，用Tris緩沖液處理膜，在嵌段后，水洗膜并干燥。寡核苷酸探針4:5’ -Dd(ATTGAGCAAGTGTACAGAGCA)-NH2-3’ (序列號 15)。(5)制備核酸色譜型測試條如圖6所示，將如上所述制備的由尼龍膜構成的色譜介質、聯結墊、作為樣品添加部的通用樣品墊、用于吸收所展開的樣品或標志物的吸收墊，貼合在由底板制成的基體材料上，制備了用于檢測使用了連接有發夾標簽的引物組的PCR擴增產物的測試條。(6)用測試備檢測PCR產物在不變性通過步驟(2)制備的PCR產物的條件下，將所述產物直接上樣至由步驟(5)制備的測試條上的樣品添加部位，通過色譜進行檢測。當步驟(2)中添加PUC19作為檢查材料時，在測試線上檢測到目標核酸特異性的著色線。另一方面，當添加水作為陰性對照時，沒有發現檢測到線。此外，用色譜檢測所需要的時間是10-15分鐘的短時間。〈實施例3>(I)合成插入人工核酸(偶氮苯)的引物與實施例1的步驟(I)相同，使用pUC19 (Takara Bio公司生產)作為模板,設計用于通過PCR擴增擴增約330個堿基對的正向引物(F)和反向引物(R)。還分別在上述引物的5’末端導入含有人工核酸即偶氮苯的聚合酶反應抑制區域(X)和標簽序列T5和T6，合成了連接有標簽的引物T5-X-F和T6-X-R。這2種插入偶氮苯的引物是委托筑波OLIGOSERVICE株式會社合成并購入的。示出本研究中制備的引物組。標簽序列T5:5’ -Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG) -3 (序列號 I6)標簽序列T6:5’ -Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)-3’ (序列號 17)弓I物 T5-X-F: 5 ’ -Dd (TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG XGGAAACAGCTATGACCATGA)-3’(序列號 I8)弓I物 T6-X-R: 5 ’ -Dd (GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA XTCTATGCGGCATCAGAGCAG)-3’(序列號 19)此外，插入到引物中的偶氮苯如下式(I)所示。[化學式I]
權利要求
1.核酸檢測方法，其包括: 使雙鏈DNA擴增片段的一個末端的單鏈區域與固定在固相上的第I寡核苷酸探針雜交的步驟，所述雙鏈DNA擴增片段是在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域的雙鏈DNA擴增片段。
2.根據權利要求1所述的核酸檢測方法，其還包括: 使所述DNA擴增片段的另一個末端的單鏈區域與結合有標志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。
3.根據權利要求2所述的核酸檢測方法，其中，標志物包括著色擔載體，并可以目測檢測所述DNA擴增片段。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的核酸檢測方法，其包括: 在核酸檢測裝置上檢測所述DNA擴增片段的步驟。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的核酸檢測方法，其用色譜檢測所述DNA擴增片段。
6.根據權利要求4或5所述的核酸檢測方法，其包括下述步驟(a)-(c): (a)在所述核酸檢測裝置 上的不同于固定有所述第I寡核苷酸探針的區域的區域中，配置所述DNA擴增片段的步驟， (b)使用溶劑，使所述DNA擴增片段在朝向固定有所述第I寡核苷酸探針的區域的方向上在所述裝置上擴散的步驟，以及 (c)在固定有所述第I寡核苷酸探針的區域中，使所述第I寡核苷酸探針與所述DNA擴增片段雜交的步驟。
7.根據權利要求6所述的核酸檢測方法，其還包括: 在所述步驟(c)之前，使所述DNA擴增片段與結合有所述標志物的第2寡核苷酸探針雜交的步驟。
8.根據權利要求4或5所述的核酸檢測方法，其中， (d)在所述核酸檢測裝置上的不同于固定有所述第I寡核苷酸探針的區域的各個區域中，分別配置所述DNA擴增片段、以及結合有所述標志物的第2寡核苷酸探針， (e)使用溶劑，使所述DNA擴增片段在朝向配置有第2寡核苷酸探針的區域的方向上擴散，所述第2寡核苷酸探針結合有所述標志物， (f)在配置了結合有所述標志物的第2寡核苷酸探針的區域中，使所述DNA擴增片段與結合有標志物的第2寡核苷酸探針雜交， (g)使在步驟(f)中雜交而得的復合物在朝向配置有所述第I寡核苷酸探針的方向上在展開介質上擴散，以及 (h)在固定有所述第I寡核苷酸探針的區域中，使所述第I寡核苷酸探針與所述復合物雜父。
9.根據權利要求1 8中任一項所述的核酸檢測方法，其中，所述包含天然核苷酸的單鏈區域是與雙鏈DNA區域相同方向的序列。
10.根據權利要求1 9中任一項所述的核酸檢測方法，其中，所述DNA擴增片段是使用2種引物且通過核酸擴增方法獲得的產物，所述引物具有在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域。
11.根據權利要求1 9中任一項所述的核酸檢測方法，其中，所述DNA擴增片段是使用第I引物組和第2引物組且通過核酸擴增方法獲得的產物， 所述第I引物組包括下述引物，該引物具有能夠與目標核酸的模板雜交的序列、和不能夠與該模板雜交的共同序列，以及 所述第2引物組包括下述引物，該引物具有能夠與所述共同序列的互補序列雜交的序列、和在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域。
12.根據權利要求11所述的核酸檢測方法，其中，所述在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域包含天然核苷酸、且是與能夠和共同序列的互補序列雜交的序列相同方向的序列。
13.檢測裝置，其為在權利要求1 12中任一項所述的核酸檢測方法中使用的核酸檢測裝置，其具有: 配置所述DNA擴增片段的區域， 保持有所述第I寡核苷酸探針的色譜擔載體，所述第I寡核苷酸探針待與所述DNA擴增片段結合， 結合有標志物的所述第2寡核苷酸探針。
14.雙鏈DNA擴增片段，其為使用具有在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域的2種引物且通過核酸擴增方法而獲得的，在兩個末端具有包含天然核苷酸的單鏈區域。
15.根據權利要求14所述的雙鏈DNA擴增片段，其中，引物的在核酸擴增反應中不被雙鏈化的標簽區域包括天然核苷酸、 且引物全長為相同方向的序列。
全文摘要
本發明的目的是提供核酸檢測方法和核酸檢測裝置或試劑盒，所述核酸檢測方法有效利用雜交法的高特異性，并且減少PCR產物的檢測步驟所需的時間和步驟，在不需要特殊裝置的條件下，簡便且高精度地進行目測檢測。提供了檢測樣品中的目標核酸的方法以及檢測裝置，所述方法包括在擴增目標核酸序列時，合成在兩個末端添加了單鏈區域的、具有部分雙鏈結構的擴增產物的步驟；和采用結合了所述擴增產物的單鏈區域和展開介質的核酸序列、以及結合了目標化合物的核酸序列來形成夾心雜交復合物的步驟。
文檔編號G01N33/53GK103228785SQ20118005658
公開日2013年7月31日 申請日期2011年11月24日 優先權日2010年11月24日
發明者高橋孝治, 宮本重彥, 直原啟明, 友野潤 申請人:株式會社鐘化