專利名稱：萊姆病的診斷方法
技術領域：
本發明主要涉及萊姆病的診斷，更具體地，本發明涉及在哺乳動物，如馬和犬中確定萊姆病的不同階段。
背景技術：
萊姆病是由伯氏疏螺旋體廣義型的螺旋體感染導致。這是一種人畜共患病，影響人、犬、馬和其他哺乳動物種屬。所述細菌通過被感染的蜱(硬蜱屬)傳播給哺乳動物宿主。萊姆病是美國、歐洲和亞洲最常見的媒傳疾病。在歐洲和亞洲該疾病通常由伽氏疏螺旋體(B.Garinii)和阿氏疏螺旋體(B.Afzelii)引起，而在美國存在伯氏疏螺旋體的狹義菌株。在目前萊姆病的診斷方法中，通常對針對完整伯氏疏螺旋體裂解物或針對螺旋體單個抗原的血清抗體進行分析，以便對同病原體接觸并存在發病風險的犬和馬進行鑒定。在犬和馬中，可以依次使用ELISA和Western印跡(WB)對血清中的伯氏疏螺旋體抗體進行檢測，該方法并不完善，但盡管如此仍被認為是人萊姆病診斷的黃金標準。盡管某些檢測是可用的(如用于檢測犬和馬伯氏疏螺旋體不同表面抗原VlsE的恒定結構域IR6的snap檢測)，但是其缺乏所需的靈敏度水平以及無法對所述疾病的不同階段進行區分。因而，始終需要在哺乳動物，包括但不限于在馬和犬中診斷萊姆病的改進的方法，這樣的需求尚未滿足。本發明則滿足了這些和其他需求。發明概述本發明提供 了一種在哺乳動物中診斷萊姆病狀況的方法。所述方法包括在獲取自或衍生自哺乳動物的生物樣品中，測定存在或不存在伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi )外表面蛋白(Osp) OspA、OspCjP OspF的抗體，并根據所述抗體的存在或不存在鑒定所述哺乳動物已被或未被伯氏疏螺旋體感染。所述方法包括測定所述動物是否已接種了抗伯氏疏螺旋體疫苗。所述方法可以根據測定存在或不存在所述抗體，區分萊姆病的不同階段，即早期、中期或慢性伯氏疏螺旋體感染。在一個實施方式中，通過測定不存在針對OspA、OspC和OspF抗原的抗體，鑒定所述哺乳動物未被伯氏疏螺旋體感染。在一個實施方式中，在所述方法中測定的針對伯氏疏螺旋體抗原的僅有的抗體是針對伯氏疏螺旋體OspA、OspCJP OspF的抗體。所述方法適于使用任意適宜的系統或設備測定存在或不存在所述抗體。在不同實施方式中，使用橫流裝置或基于熒光珠的多重檢測測定所述抗體。本發明包括檢測伯氏疏螺旋體0spA、0spC、和OspF抗體的測定水平，并根據OspA、OspCJP OspF抗體的測定水平與參比值的比較結果，鑒定所述哺乳動物已接種抗伯氏疏螺旋體疫苗和/或具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋體感染。在一個實施方式中，所述參比值為平均熒光強度值的范圍。
在本發明的一個特定方面，所述方法包括:i)根據測定存在針對OspA的抗體且不存在針對OspC或OspF的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種但并未被伯氏疏螺旋體感染；ii)根據測定存在針對OspC的抗體且不存在針對OspA和OspF的抗體，鑒定所述哺乳動物具有早期伯氏疏螺旋體感染；iii)根據測定存在針對OspF的抗體且不存在針對OspA和OspC的抗體，鑒定所述哺乳動物具有慢性伯氏疏螺旋體感染；iv)根據測定存在針對OspA和OspC的抗體且不存在針對OspF的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種并具有早期伯氏疏螺旋體感染；V)根據測定存在針對OspA和OspF的抗體且不存在針對OspC的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種并具有慢性伯氏疏螺旋體感染；vi)根據測定存在針對OspC和OspF的抗體且不存在針對OspA的抗體，鑒定所述哺乳動物具有中期伯氏疏螺旋體感染；或者vii)根據測定存在針對OspC、OspF和OspA的抗體,鑒定所述哺乳動物已接種并且具有中期伯氏疏螺旋體感染。還包括組合物和試劑盒，其包含新型分離的蛋白及編碼其的分離的核酸，所述新型分離的蛋白包括伯氏疏螺旋體蛋 白。附圖簡要說明
圖1:純化的重組伯氏疏螺旋體OspA (A)、OspC (B)和OspF (C)蛋白，以及使用來自已接種疫苗或已感染的犬的血清，通過免疫印跡對所述蛋白進行的檢測。左圖:在還原條件下使用15%SDS-PAGE分離重組蛋白，并用考馬斯亮藍染色(1=分子量標記物；2=純化的重組伯氏疏螺旋體蛋白)。右圖:通過WB隨后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜并與犬血清共同孵育，犬血清已在常規的伯氏疏螺旋體全細胞裂解物WB中進行了預實驗(3=陽性血清；4=陰性血清)。圖2:對伯氏疏螺旋體OspA、OspC和OspF抗原的血清抗體進行分析的單重(單珠分析)和多重檢測結果的相關性。共有79個犬血清用于比較。根據表3中確定的陰性(白圈)、待定(灰圈)和陽性(黑圈)的判讀范圍對數據進行顏色編碼。對各抗原計算斯皮爾曼等級相關性。MFI=平均熒光強度。圖3:用于檢測犬血清中針對伯氏疏螺旋體的抗體的常規WB。在還原條件下在12%SDS凝膠中分離伯氏疏螺旋體的全細胞裂解物。通過WB轉移蛋白。使用5%的牛奶封閉印跡膜，然后將其與不同的犬血清孵育。使用過氧化物酶偶聯的抗犬免疫球蛋白二抗，隨后加入顯色底物進行檢測。泳道1=分子量標記物；泳道2=來自已感染犬的血清；泳道3=來自已接種疫苗犬的血清；泳道4=陰性犬血清。細箭頭指向分別位于22、28、29、30和39kDa的蛋白，其提示存在感染。粗箭頭指向位于31kDa的蛋白，其確證犬已接種疫苗。圖4:伯氏疏螺旋體OspA、OspC和OspF抗原的WB結果(全細菌裂解物)和多重檢測分析比較。通過WB對共計188個犬血清進行檢測并針對各抗原將其分為WB陰性(陰性(neg))或WB陽性(陽性(pos))組。使用曼_惠特尼(Mann-Whitney)檢驗對WB陰性和WB陽性組的多重檢測結果進行比較。MFI=平均熒光強度。圖5:受試者工作曲線(R0C)，用于通過多重檢測對伯氏疏螺旋體OspA、OspC和OspF抗原的血清抗體進行檢測。對各抗原在存在或不存在血清抗體條件下的多重檢測結果進行比較，所述抗體為通過WB檢測得到的針對對應的伯氏疏螺旋體蛋白的抗體。在各ROC曲線中對來自188個犬血清樣品的結果進行比較。OspA、OspC和OspF的曲線(粗線)下面積分別為0.93、0.82和0.89。虛線曲線表示95%的置信區間。(箭頭指示粗線；粗線兩側的兩條線=‘虛’線。)圖6:馬血清中抗體的分析,該分析通過Western印跡用于檢測伯氏疏螺旋體蛋白。通過SDS-PAGE分離伯氏疏螺旋體的全細胞裂解物并通過Western印跡將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。泳道(I)表示分子量標記物。其余被染色的泳道為(2)來自已感染伯氏疏螺旋體馬的血清、(3)來自未感染馬的血清、或(4)已接種抗萊姆病疫苗的馬血清。來自已感染或已接種疫苗馬的血清顯示出特征性的檢測模式。針對0spC、0spF以及位于28、30和39kDa抗原的抗體能指示存在感染，而OspA被認為是已接種的馬的標記物。圖7:抗體的單重和多重結果的比較，所述抗體為在81個馬血清樣品中檢測得到的針對伯氏疏螺旋體0spA、0spC和OspF抗原的抗體。多重檢測結果以平均熒光強度(MFI)表示。計算各次比較的斯皮爾曼等級相關性(rsp)。圖8:將562個馬血清樣品中的抗體的Western印跡(WB)和多重檢測結果(MFI)進行比較，所述抗體為針對伯氏疏螺旋體OspA、OspC和OspF抗原的抗體。與WB陰性樣品相比，使用WB陽性血清進行的三個基于小珠的檢測中，均觀察到MFI值明顯增加，P-值〈0.0001。圖9:多重檢測的一個實施方式的圖示，所述多重檢測用于檢測針對伯氏疏螺旋體的抗體。(I)偶聯至熒光小珠的重組伯氏疏螺旋體OspA、OspC和OspF抗原。(2)樣品(例如，血清、腦脊液(CSF)或其他體液)同時與三個熒光小珠孵育。(3)在檢測中加入生物素化的抗種屬的特異性免疫球蛋白抗體。(4)加入鏈霉親和素-藻紅蛋白作為報告染料。然后在多重分析儀中檢測各次小珠檢測的熒光小珠編碼和報告染料。發明詳述本發明提供了一種在哺乳動物中診斷萊姆病狀況的方法。概括地說，該方法包括，在獲取自或衍生自哺乳動物的生物樣品中，測定針對伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi )外表面蛋白(Osp) OspA、OspCjP OspF的抗體。根據所述OspA、OspC和OspF抗體的測定結果，可以診斷哺乳動物已被或者未被伯氏疏螺旋體感染。在不同實施方式中，所述方法能夠用于鑒定哺乳動物已接種抗伯氏疏螺旋體疫苗和/或具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋體感染。本發明還提供了包含新型分離的伯氏疏螺旋體蛋白及其片段的組合物。如本文所使用的，萊姆病“狀況”指涉及特異性識別伯氏疏螺旋體OspA、OspC和OspF的抗體的哺乳動物的抗體譜。確定萊姆病狀況可以包括確定哺乳動物落入下述分類之一:i)已接種抗伯氏疏螺旋體疫苗但未被伯氏疏螺旋體感染；ii)具有早期伯氏疏螺旋體感染；iii)具有慢性伯氏疏螺旋體感染；iv)已接種抗伯氏疏螺旋體疫苗且具有早期伯氏疏螺旋體感染；v)已接種抗伯氏疏螺旋體疫苗且具有慢性伯氏疏螺旋體感染；vi)具有中期伯氏疏螺旋體感染；vii)已接種抗伯氏疏螺旋體疫苗且具有中期伯氏疏螺旋體感染；或者viii)未接種抗伯氏疏螺旋體疫苗且不具有伯氏疏螺旋體感染。如本文所使用的，“早期”感染指感染2至6周。 “慢性”或“晚期”感染指感染5個月或以上。中期感染指感染6周至5個月。
本發明的方法對于確定任何哺乳動物中的萊姆病狀況是有用的。在特定實施方式中，所述哺乳動物是人、馬科動物、犬科動物或人。馬科動物包括分類學家族為馬科的成員。在某些實施方式中，根據本發明被診斷的馬科動物為馬。犬科動物包括分類學家族為犬科的成員。在某些實施方式中，根據本發明被診斷的犬科動物為犬，如馴養的犬。在所述方法中檢測的生物樣品可以是預計含有抗體的任意生物樣品。生物樣品優選生物液體。在不同實施方式中，生物樣品包含血液、血清、或腦脊液(CSF)。可以使用任意適宜的技術從哺乳動物中獲取生物樣品，并可以直接使用所述生物樣品確定抗體是否存在。或者，樣品可以衍生自經過處理步驟的生物樣品，所述處理步驟如分離或純化血液、血清、CSF、或任意此類生物液體的成分的處理步驟。總之，根據本發明可以使用表I中列出的矩陣確定萊姆病的狀況，其中“ + ”表示存在特異性識別指示Osp抗原的抗體，表示不存在此類抗體。表權利要求
1.一種在哺乳動物中診斷萊姆病狀況的方法，所述方法包括在獲取自或衍生自哺乳動物的生物樣品中，測定存在或不存在伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp)OspA, OspCJP OspF的抗體，并根據所述抗體的存在或不存在來鑒定所述哺乳動物已被或未被伯氏疏螺旋體感染。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物是馬或犬。
3.根據權利要求1所述的方法，其中在所述方法中測定的針對伯氏疏螺旋體抗原的僅有的抗體是針對伯氏疏螺旋體OspA、OspCJP OspF的抗體。
4.根據權利要求3所述的方法，其中通過測定不存在針對OspA、OspCJPOspF抗原的抗體，鑒定所述哺乳動物未被伯氏疏螺旋體感染。
5.根據權利要求1所述的方法，所述方法進一步包括根據測定存在或不存在所述抗體，確定所述動物為早期、中期或慢性伯氏疏螺旋體感染。
6.根據權利要求1所述的方法，所述方法進一步包括根據測定存在或不存在所述抗體，確定所述哺乳動物是否已接種抗伯氏疏螺旋體感染疫苗。
7.根據權利要求1所述的方法，其中使用橫流裝置測定所述抗體存在或不存在。
8.根據權利要求1所述的方法，其中使用基于熒光珠的多重檢測測定所述抗體存在或不存在。
9.一種在哺乳動物中診斷萊姆病狀況的方法，所述方法包括在獲取自或衍生自哺乳動物的生物樣品中，檢測伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp) OspA、OspCjPOspF的抗體的測定水平，并根據0spA、0spC、和OspF抗體的測定水平與參比值的比較結果，鑒定所述哺乳動物已接種抗伯 氏疏螺旋體疫苗和/或具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋體感染。
10.根據權利要求9所述的方法，其中在所述方法中測定的針對伯氏疏螺旋體抗原的僅有的抗體是針對伯氏疏螺旋體OspA、OspCJP OspF的抗體。
11.根據權利要求10所述的方法，其中通過測定不存在針對OspA、OspCJPOspF蛋白的抗體，鑒定所述哺乳動物未被伯氏疏螺旋體感染。
12.根據權利要求10所述的方法，其中使用基于熒光珠的多重檢測，檢測所述抗體存在或不存在。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述參比值為平均熒光強度值的范圍。
14.一種在哺乳動物中診斷萊姆病狀況的方法，所述方法包括在獲取自或衍生自哺乳動物的生物樣品中，測定存在或不存在伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp)OspA、OspCjP OspF的特異性抗體，并且: i )根據測定存在針對OspA的抗體且不存在針對OspC或OspF的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種但并未被伯氏疏螺旋體感染； ii)根據測定存在針對OspC的抗體且不存在針對OspA和OspF的抗體，鑒定所述哺乳動物具有早期伯氏疏螺旋體感染； iii)根據測定存在針對OspF的抗體且不存在針對OspA和OspC的抗體，鑒定所述哺乳動物具有慢性伯氏疏螺旋體感染； iv)根據測定存在針對OspA和OspC的抗體且不存在針對OspF的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種并具有早期伯氏疏螺旋體感染；V)根據測定存在針對OspA和OspF的抗體且不存在針對OspC的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種并具有慢性伯氏疏螺旋體感染； vi)根據測定存在針對OspC和OspF的抗體且不存在針對OspA的抗體，鑒定所述哺乳動物具有中期伯氏疏螺旋體感染；或者 vii)根據測定存在針對OspC、OspF和OspA的抗體，鑒定所述哺乳動物已接種并且具有中期伯氏疏螺旋體感染。
15.一種包括分離蛋白的組合物，所述分離蛋白包含SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 17,SEQID NO: 19的序列，或所述蛋白的組合。
16.根據權利要求15所述的組合物，所述組合物包含蛋白的組合，所述蛋白包含SEQID NO:15、SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO:17。
全文摘要
本發明提供了一種在哺乳動物中診斷萊姆病狀況的方法。所述方法涉及在獲取自或衍生自哺乳動物的生物樣品中，測定針對伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)外表面蛋白(Osp)OspA、OspC、和OspF的抗體。根據OspA、OspC、和OspF抗體的測定，可以將所述哺乳動物診斷為已接種或未接種伯氏疏螺旋體疫苗、感染或未感染伯氏疏螺旋體。還可以鑒定出具有早期、中期或慢性伯氏疏螺旋體感染的哺乳動物。所述方法特別適于馬和犬使用。本發明還提供了分離的或重組的伯氏疏螺旋體抗原以及含有其的組合物。
文檔編號G01N33/53GK103229055SQ201180056250
公開日2013年7月31日 申請日期2011年9月27日 優先權日2010年9月27日
發明者B·瓦格納 申請人:康奈爾大學