穩定gpcr的功能構象狀態的蛋白結合結構域及其用途的制作方法

專利名稱：穩定 gpcr 的功能構象狀態的蛋白結合結構域及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及GPCR結構生物學和信號傳導領域。具體而言，本發明涉及針對或能特異性結合G蛋白偶聯受體(GPCR)的功能構象狀態的蛋白結合結構域。更具體地，本發明提供能增強GPCR的功能構象狀態的穩定性、特別是能增強活性構象狀態的GPCR的穩定性的蛋白結合結構域。本發明的蛋白結合結構域可以用作對結合各種天然和合成配體的G蛋白偶聯受體進行結構和功能表征的工具，以及用于以GPCR為目標的篩選和藥物發現工作的工具。此外，本發明還包括這些蛋白結合結構域用于GPCR相關疾病的診斷、預后以及治療的用途。
背景技術：
G蛋白偶聯受體(GPCR)是人類基因組中最大的膜蛋白家族。它們在對一組多樣性的配體的生理應答中發揮至關重要的作用，所述配體如生物胺、氨基酸、肽、蛋白、前列腺素、磷脂、脂肪酸、核苷、核苷酸、Ca2+離子、著嗅齊IJ、較苦和甜的促味齊IJ、信息素以及質子(Heilker et al.2009) XPCR是范圍廣泛疾病的治療靶標。GPCR的特征在于，具有細胞外氨基末端和細胞內羧基末端的7個跨膜結構域，并且也稱為七跨膜或七螺旋受體(Rosenbaumet al.2009)。視紫紅質是高度專業化地有效檢測光的GPCR，由于其在牛視網膜中的生化穩定性和天然豐度，其已經成為GPCR信號傳導和結構生物學的范例(Hofmann et al.2009)。相比之下，許多GPCR通過調節多種G蛋白同種型的活性以及G蛋白非依賴性信號傳導通路(如抑制蛋白)而表現出復雜的功能行為。在一些情況下，GPCR可以表現出針對特異性信號傳導通路的基礎活性，即使在缺少配體的情況下。作用于GPCR的正位配體能夠對下游信號傳導通路具有一系列作用。完全激動劑對受體的激活最大。部分激動劑即使在飽和濃度下也引發極限下刺激。反向激動劑抑制基礎活性，盡管中性拮抗劑對基礎活性沒有影響，但是競爭性地阻斷其他配體的結合。GPCR針對激素和神經遞質的復雜行為可歸因于它們的結構可塑性(Kobilka andDeupi, 2007)。來自功能和生物物理研究的證據表明，GPCR可以以多種功能上不同的構象狀態存在(Kobilka and Deupi2007)。盡管這種結構可塑性和動態行為對于正常功能是必需的，但是其有助于它們的生化不穩定性和難以獲得高分辨率晶體結構。迄今為止，已經報道了人 β 2AR(Rasmussen et al.2007; Rosenbaum et al.2007; Cherezov et al.2007;Hansonet al.2008)、鳥 β (ffarne et al.2008)以及人 A2 腺苷受體(Jaakola et al.2008)的晶體結構。盡管視紫紅質可以由分離自天然組織的未修飾蛋白而結晶，但是這些其他GPCR需要在重組系統中表達、通過反向激動劑穩定非活性狀態以及生化修飾，以穩定受體蛋白。β 2AR的第一晶體結構通過選擇性Fab而穩定(Rasmussen et al.2007)。β 2AR的后繼結構和A2腺苷受體在蛋白工程的幫助下獲得:將T4溶菌酶插入最初針對β 2AR而描述的第三細胞內環(Rosenbaum et al.2007)。最后，由蛋白生長鳥β AR的晶體,所述蛋白通過氨基和羧基末端截短和第三細胞內環的缺失以及增強純化蛋白的熱穩定性的6氨基酸取代而改造(Warne et al.2008)。
獲得GPCR活性狀態的結構較難，因為這種狀態相對不穩定。熒光壽命研究表明，在存在飽和濃度的完全激動劑時，P2AR在結構上是異質的(Ghanouni et al.2001)。這種結構異質性與晶體的形成不相容。β 2AR活性狀態的穩定需要存在其同源G蛋白Gs，即腺苷酸環化酶的刺激蛋白(Yao et al.2009)。迄今為止，僅GPCR的活性狀態結構是視蛋白的活性狀態結構，即視紫紅質的配體游離形式(Park et al.2008)。這些晶體在酸性pH(5.5)下生長，其中通過FTIR光譜，已經證明視蛋白與光激活的視紫紅質(變視紫紅質II)在結構上相似。盡管P2AR在pH降低時也表現出較高的基礎活性，但其是生化不穩定的(Ghanouniet al.2000)。闡明與各種天然和合成配體和蛋白復合的GPCR的不同功能構象狀態的結構，對于理解GPCR信號轉導機制以及基于結構的藥物發現努力都是有價值的。因此需要研發用于對GPCR的個體構象異構體進行高分辨率結構分析的新的簡單工具。

發明內容
本發明的第一方面涉及能特異性結合GPCR的功能構象狀態的蛋白結合結構域。根據優選的實施方案，所述蛋白結合結構域在結合后，能穩定GPCR的功能構象狀態。優選地，所述蛋白結合結構域能在結合后誘導GPCR的功能構象狀態。根據另一優選的實施方案，所述GPCR的功能構象狀態選自基礎構象狀態或活性構象狀態或非活性構象狀態。優選地，所述GPCR的功能構象狀態是活性構象狀態。根據另一優選的實施方案，所述蛋白結合結構域能特異性結合與激動劑結合的GPCR和/或增強GPCR對激動劑的親和性。根據另一優選的實施方案，所述蛋白結合結構域在結合后能增強GPCR的功能構象狀態的熱穩定性。在具體實施方案中，所述蛋白結合結構域能特異性結合所述GPCR的功能構象狀態的構象表位。優選地，所述構象表位是細胞內表位。更優選地，所述構象表位包含于用于下游信號傳導蛋白的結合位點中。最優選地，所述構象表位包含于G蛋白結合位點中。優選地，本發明的蛋白結合結構域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4個構架區和3個互補決定區或其任何合適的片段。更優選地，所述蛋白結合結構域來源于駱駝抗體(camelid antibody)。最優選地,所述蛋白結合結構域包含納米抗體序列或其任何合適的片段。例如，所述納米抗體包含選自SEQ ID NO: 1-29的序列或其任何合適的片段。根據另一優選的實施方案，所述GPCR是哺乳動物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆蟲蛋白。所述哺乳動物蛋白可以是人蛋白。特別是，所述GPCR選自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR視紫紅質家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCR Frizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。具體而言，所述GPCR是腎上腺素能受體，如α -腎上腺素能受體或β -腎上腺素能受體,或其中所述GPCR是毒蕈堿受體,如Ml毒蕈堿受體M2毒蕈堿受體或M3毒蕈堿受體或Μ4毒蕈堿受體或Μ5毒蕈堿受體,或其中所述GPCR是血管緊張素受體，如血管緊張素IIl型受體或血管緊張素112型受體。本發明的第二方面涉及復合體，所述復合體包含(i)本發明的蛋白結合結構域，
(ii)功能構象狀態的GPCR，以及(iii)任選存在的受體配體。所述受體配體可以選自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、離子、碳水化合物或抗體或其任何合適的片段。所述復合體也可以采用溶解形式或固定化于固相支持物。特別是，所述復合體是晶體。本發明還包括晶體形式的復合體，其包含(i)蛋白結合結構域，( )功能構象狀態的GPCR，以及(iii)任選存在的受體配體，其中所述晶體形式通過使用本發明的蛋白結合結構域而獲得。本發明的第三方面涉及包含本發明的蛋白結合結構域和/或本發明的復合體的細胞組合物。優選地，包含于細胞組合物中的蛋白結合結構域在GPCR結合所述蛋白結合結構域后能穩定和/或誘導其功能構象狀態。本發明的第四方面涉及本發明的蛋白結合結構域或本發明的復合體或本發明的細胞組合物用于穩定和/或誘導GPCR的功能構象狀態的用途。根據一優選的實施方案，所述蛋白結合結構域或所述復合體或所述細胞組合物可以用于使功能構象狀態的GPCR的結構結晶和/或溶解。本發明還包括測定功能構象狀態的GPCR的晶體結構的方法，所述方法包括以下步驟:⑴提供本發明的蛋白結合結構域、靶GPCR以及任選存在的受體配體，和(ii)形成蛋白結合結構域、GPCR以及任選存在的受體配體的復合體，以及(iii)使步驟(ii)的所述復合體結晶，從而形成晶體，其中測定功能構象狀態的GPCR的晶體結構。上述測定GPCR晶體結構的方法還可以包括獲得晶體的原子坐標的步驟。根據另一優選 的實施方案，所述蛋白結合結構域或所述細胞組合物，可以用于捕獲功能構象狀態的GPCR，任選地與受體配體或與一個或多個下游信號傳導蛋白一起。本發明因此還包括捕獲功能構象狀態的GPCR的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供本發明的蛋白結合結構域和靶GPCR，以及(ii)形成蛋白結合結構域與GPCR的復合體，其中捕獲功能構象狀態的GPCR。此外，本發明還包括捕獲功能構象狀態的GPCR的方法，所述方法包括以下步驟:(i)將含有多種構象狀態的GPCR的溶液應用于具有固定化的本發明的蛋白結合結構域的固相支持物，和(ii)形成蛋白結合結構域與GPCR的復合體，以及(iii)除去弱結合或未結合的分子，其中，捕獲功能構象狀態的GPCR。上述捕獲功能構象狀態的GPCR的方法可以包括純化所述復合體的步驟。根據另一優選的實施方案，本發明還涉及本發明的蛋白結合結構域或復合體或細胞組合物在GPCR的構象特異性(藥物)化合物或配體的篩選和/或鑒定程序中的用途。本發明因此還包括鑒定能結合GPCR的功能構象狀態的化合物的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供本發明的GPCR和蛋白結合結構域，和(ii)提供測試化合物，和(iii)評估測試化合物是否結合GPCR的功能構象狀態，以及(iv)選擇結合GPCR的功能構象狀態的化合物。優選地，上述用于鑒定化合物的方法還包括形成復合體的步驟，所述復合體包含本發明的蛋白結合結構域和功能構象狀態的GPCR。所述復合體還包含受體配體，所述受體配體可以選自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、離子、碳水化合物或抗體或其任何合適的片段。優選地，所述受體配體是完全激動劑或部分激動劑或反向激動劑或拮抗劑。優選地，所述蛋白結合結構域和/或所述復合體以基本上純化的形式提供。可選地，所述蛋白結合結構域和/或所述復合體以溶解的形式提供。可選地，所述蛋白結合結構域和/或所述復合體固定化于固相支持物。可選地，所述蛋白結合結構域和/或復合體以細胞組合物形式提供。根據另一優選的實施方案，用于上述用來鑒定化合物的方法的測試化合物選自多肽、肽、小分子、天然產物、肽模擬物、核酸、脂質、脂肽、碳水化合物，抗體或其來源的任何片段,如Fab、Fab’和F (ab') 2, Fd、單鏈Fv (scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fv (dsFv)和包含VL或VH結構域的片段,重鏈抗體(hcAb)、單結構域抗體(sdAb)、微型抗體(minibody)、來源于駱駝重鏈抗體的可變結構域(VHH或納米抗體)、來源于鯊魚抗體的新抗原受體的可變結構域(VNAR)、包括α體(alpha body)的蛋白支架、蛋白A、蛋白G、設計的錨蛋白重復結構域(DARPins)、纖連蛋白III型重復、抗運載蛋白、打結素(knottin)、工程化CH2結構域(納米抗體)。優選地，標記所述測試化合物。此外可以使用測試化合物庫。此外，上述鑒定化合物的方法可以是高通量篩選方法。根據另一具體實施方案，所有本發明的蛋白結合結構域或復合體或細胞組合物都可以用于診斷或預后GPCR相關疾病，如癌癥、自身免疫病，傳染病、神經病、心血管疾病。本發明的第五方面涉及包含治療有效量的本發明的蛋白結合結構域和至少一種藥學上可接受載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。本發明的第六方面涉及本發明的蛋白結合結構域或本發明的藥物組合物調節GPCR信號傳導活性、更具體而言阻斷G蛋白介導的信號傳導的用途。本發明的蛋白結合結構域或藥物組合物還可以用于治療GPCR相關疾病，如癌癥、自身免疫病、傳染病、神經病、心血管疾病。本發明的第七方面涉及包含本發明的蛋白結合結構域或本發明的復合體或本發明的細胞組合物的試劑盒。根據本文的進一步公開，本發明的氨基酸序列和多肽的其他應用和用途將會變得顯而易見。附圖簡述

圖1.P2AR特異性納米抗體結合并穩定受體的活性狀態。(a)NbSO的尺寸排阻層析(SEC)的代表性蹤跡。在利用FPLC進行分析之前，將結合激動劑W2AR激動劑)的純化的β2ΑΚ(20μΜ)在具有和不具有40μΜ Nb80(分別為黑色和藍色)的情況下在室溫下孵育2hr (小時)。在存在NbSO的情況下，β 2AR激動劑洗脫峰的UV吸光度(280nm)增加，且以比單獨的β 2AR激動劑更早的體積洗脫，同時Nb80洗脫峰(綠色)降低，這表明β 2AR-激動劑-Nb80復合體形成。孵育結合反向激動劑的β 2AR(20 μ Μ)與Nb80 (紅色)，與β 2AR-激動劑-Nb80復合體相比，導致較小的位移和UV吸光度較小的增加。(b)表達β 2AR的Sf9昆蟲細胞膜的劑量應答競爭結合實驗。將通過SEC結合β 2AR的7種納米抗體與表達β 2AR的膜一起在室溫下單獨孵育90min(分鐘)。所有7種納米抗體都增強了 P2AR對(-)_異丙腎上腺素的親和性(表3)。選擇Nb80(藍色)作為引導納米抗體。數據表示一式三份進行的2個獨立實驗的平均值土s.e。(c)利用mono-bromo bimane (mBBr)標記的純化受體進行的基于突光的功能測定表明，與缺少Nb80 (黑色)時的受體相比，I μ M Nb80 (藍色)穩定β 2AR的更具活性的狀態(結合完全激動劑(-)_異丙腎上腺素)。活性狀態的特征是，猝滅mBBr熒光和mBBr熒光紅移(Yao et al.，2009)。圖2.代表性斑點印跡顯示了納米抗體對β #三級結構的特異性。(a)將等量的結合激動劑的天然或SDS變性的純化β 2AR(分別為頂部和中部)或結合反向激動劑的天然P2AR(底部)一式三份點涂于硝酸纖維素帶上。將所述帶用在具有0.05%Tween-20的PBS (pH7.4)中的5%脫脂奶粉封閉，然后與lmg/ml在封閉緩沖液中稀釋的所述納米抗體一起孵育。用抗組氨酸(a-6His)小鼠一抗隨后與山羊抗小鼠IR-800標記的二抗一起孵育，檢測納米抗體的結合。Ml抗體識別線性FLAG表位，將其用Alexa-688進行標記，并直接檢測β 2AR。利用奧德賽紅外線成像系統(Odyssey Infrared ImagingSystem, L1-cor Biosciences)掃描斑點印跡并使之成像。因為兩種不同的通道(分別為800nm對700nm)用于成像，因此通過Ml從檢測β 2AR的印跡分別處理檢測納米抗體的印跡；因此不能直接比較并定量印跡(即納米抗體的結合與Ml結合的比較本質上是定性的)。(b)代表性斑點印跡顯示了與天然折疊的β 2AR結合降低的納米抗體。圖3.納米抗體與受體活性狀態的選擇性結合在通過尺寸排阻層析進行分析之前，將純化的結合激動劑的β2ΑΙ (20μΜ)在具有或不具有40 μ M納米 抗體(分別為黑色和藍色)的情況下在室溫下孵育2hr。還分析存在納米抗體時(紅色)結合反向激動劑的P2AR樣品(20 μ M)。在存在7種納米抗體(Nb72、Nb65、Nb71、Nb69、Nb67以及Nb84)時，β 2AR激動劑洗脫峰的UV吸光度(280nm)增加了，并且以比單獨的P2AR激動劑(藍色)更早的體積洗脫(黑線)，同時NbSO洗脫峰(綠色)降低，這表明β 2AR-激動劑-Nb80復合體形成。未觀察到β 2AR-反向激動劑-Nb80復合體的形成(紅線)。圖4.納米抗體與受體活性狀態的選擇性結合在通過尺寸排阻層析進行分析之前，將純化的結合激動劑的β2ΑΙ (20μΜ)在具有和不具有40 μ M納米抗體(分別為黑色和藍色)的情況下在室溫下孵育2hr。圖5.熒光發射譜表明，納米抗體誘導bimane標記的β2AR的構象變化。增強P2AR的激動劑結合親和性的納米抗體穩定受體的活性狀態。利用mono-bromo bimane (mBBr)標記的純化受體進行的基于突光的功能測定表明，I μ M納米抗體65、67、69、71、72以及84(紅色)，當與缺少納米抗體的受體(黑色)相比時，穩定i32AR(結合完全激動劑異丙腎上腺素)的更具活性的狀態。這種活性狀態的特征是，猝滅mBBr 熒光和 mBBr 熒光紅移(Yao et al., 2009)。圖6.Nb80對β 2AR結構和功能的影響(a)該示意圖說明，在導致在圖6b_c中所觀察的熒光降低的受體激活過程中，在TM6的細胞質端連接于Cys2 6 5 6 27的環境敏感性Bimane探針從更埋入的疏水環境向更極性的溶劑暴露的位置移動。
(b)-(c)熒光發射譜顯示，在缺少(黑色實線)或存在完全激動劑異丙腎上腺素(ISO,綠色寬虛線)、反向激動劑IC1-118，551 (ICI，黑色虛線)、GS異三聚體(紅色實線)、納米抗體_80(Nb80，藍色實線)以及，Gs與ISO的組合(紅色寬虛線)、Nb80與ISO的組合(藍色寬虛線)及Nb80與ICI的組合(藍色虛線)時，重構成高密度的脂蛋白顆粒(mBB-132AR/HDL)的
mono-bromo bimane
標記的P2AR的配體誘導的構象變化。(d) - (f) d，在缺少或存在GTP Y S的情況下，與[3H] - 二氫阿普洛爾([3H] -DHA)競爭用Gs異三聚體重構的β 2AR/HDL的ISO的配體結合曲線；e，在缺少或存在Nb80的情況下，與[3H]-二氫阿普洛爾([3H]-DHA)競爭i32AR/HDL的ISO的配體結合曲線；以及f，在缺少或存在Nb80的情況下，與[3H]- 二氫阿普洛爾([3H]-DHA)競爭β 2AR-T4L/HDL的ISO的配體結合曲線。誤差棒表示標準差。圖7.激動劑-β 2AR-T4L_Nb80復合體在脂質立方相中所形成的晶體中的包裝i32AR、Nb80以及激動劑結構的不同視圖，分別以橙色、藍色和綠色表示。由于拙劣的電子密度，T4溶菌酶(T4L)不能被建模。其可能的位置用淺藍色圓表示，黑色虛線連接于TM5和TM6的細胞內端,在那兒其融合于β 2AR_T4L構建體中。PyMOL(http://www.pymol.0rg)用于制備所有附圖。圖8.反向激動劑和激動劑_Nb80穩定的P2AR.的晶體結構的比較反向激動劑卡拉洛爾結合的02AR_T4L(P2AR-Cz)的結構以藍色顯示，卡拉洛爾以黃色顯示。激動劑結合的和Nb80穩定的i32AR-T4L(i32AR-Nb80)的結構以橙色顯示，激動劑以綠色顯示。利用Pymol比對功能，比對這兩個結構。(a)疊加結構的側視圖，其顯示受體的細胞內和G蛋白面對部分的明顯結構變化。(b)側視圖遵循在縱軸上進行90度旋轉。(c)細胞外配體結合結構域的比較表現出適度的結構變化。圖9.與非活性^2AR和視蛋白結構相比，Nb80無奈的細胞內結構域。(a)具有Nb80的⑶R的β 2AR(橙色)與受體相互作用的側視圖，⑶Rl:淡藍色，⑶R3:藍色。(b)聚焦進入β 2AR的⑶Rl和3的近端視圖(closer view)。顯示了 4 A⑶R內TM3、5、6以及7的側鏈。較大的⑶R3刺入受體13 A 〔C)從細胞內側觀察的⑶Rl與CDR3的相互作用。(d)激動劑結合的和Nb80穩定的02AR-T4L(02AR-Nb8O)與β 2AR_T4L的卡拉洛爾結合的非活性結構(P2AR-Cz)疊加。TM3中DRY基元的Asp3.49與Arg3.50之間的離子鎖相互作用，在P2AR-Nb80結構中被打破。TM6的細胞內端向外移動并離開受體的核心。箭頭表示在P2AR-Cz和P2AR-Nb80的結構中，Glu6.30的α-碳之間距離的
11.4 A變化。ΤΜ3和ΤΜ7的細胞內端向核心分別移動了 4 A和2.5 Α，而ΤΜ5向外移動了6Α。(e) P2AR-Nb80結構與與Gt (轉導蛋白)的C末端肽一起結晶的視蛋白的結構疊加。圖10.與視蛋白結構相比，Nb80穩定β 2AR的細胞內結構域。(a) ^2AR與Nb80之間的相互作用。(b)視蛋白與轉導蛋白羧基末端肽之間的相互作用。圖11.在激動劑結合后，跨膜節段包裝相互作用的重排(a)在 TM5 中的 Pro211、TM3 中的 Ilel21、TM6 中的 Phe282 以及 TM5 中的 Asn316之間觀察到穩定非活性狀態的包裝相互作用。(b)在激動劑結合后TM5的向內運動干擾Ilel21和Pro211的包裝，導致Ilel21與Phe282之間相互作用的重排。這些變化有助于TM6的旋轉和向外運動以及TM7的向內運動。圖12.針對P2AR而產生的不同納米抗體的氨基酸序列已經利用標準軟件工具對序列進行了比對，已經根據MGT編號(Lefranc etal.，2003)定義了 CDR。圖13.Nb80對β 2AR受體熱穩定性的影響在存在和缺少NbSO的情下，去污劑增溶的(DDM)激動劑結合(異丙腎上腺素)β 2AR的熔解曲線的比較。無Nb80時β 2AR的表觀熔解溫度為12.0° C。在具有Nb80的情況下，β 2AR的表觀熔解溫度為24° C。圖14.Nb80對溫度的影響誘導β 2AR受體聚集A.在存在NbSO或異丙腎上腺素的情況下，將去污劑增溶的(DDM) β 2AR于50° C下加熱10分鐘，并利用SEC分析受體的聚集。B.在存在NbSO時，異丙腎上腺素結合受體的溫度依賴性。圖15.Nb80對β 2AR結合反向激動劑IC1-118，551具有很少的影響將β 2AR或β 2AR-T4L重構成HDL顆粒，并在缺少或存在Nb80的情況下，進行激動劑競爭結合實驗。a:在存在和缺少Nb80的情況下，與[3H]-二氫阿普洛爾([3H]-DHA)競爭i32AR/HDL的反向激動劑IC1-118551的配體結合曲線，b，在存在和缺少Nb80的情況下，與與[3H]-二氫阿普洛爾([3H]-DHA)競爭i32AR-T4L/HDL的反向激動劑IC1-118551的配體結合曲線。圖16.Nb80增強激動劑的β 2AR親和性，但是不增強拮抗劑的β 2AR親和性。

在存在和缺少NbSO的情況下，對含有全長β 2AR的商業昆蟲細胞來源的膜進行競爭性配體結合實驗。在存在NbSO和兩個代表性激動劑(異丙腎上腺素，丙卡特羅)與兩個代表性拮抗劑(IC1-118，551和卡維地洛)的不相關納米抗體(Irr Nb)的情況下的劑量依賴性放射性配體位移曲線。圖17:人β IAR和人β 2AR的序列比對突出顯示了在β 2AR-Nb80界面中與Nb80相互作用的β 2腎上腺素能受體的氨基酸。圖18:Nb80選擇性結合人β iAR受體的活性構象與[3H]- 二氫阿普洛爾([3H]_DHA)競爭的激動劑和反向激動劑的配體結合曲線。A)在存在和缺少Nb80時，激動劑異丙腎上腺素(ISO)結合i32AR。B)在存在和缺少Nb80時，反向激動劑IC1-118，551(ICI)結合^2AR0 C)在存在和缺少NbSO時，激動劑異丙腎上腺素(ISO)結合β AR。D)在存在和缺少Nb80時，反向激動劑CGP20712A(CPG)結合β 0發明詳述定義將針對具體實施方案并參考某些附圖對本發明進行描述，但是本發明并非限于此，而是僅僅受到權利要求的限制。權利要求中的任何附圖標記不應當解釋為限制范圍。所述附圖僅僅是示意性的，并且非限制性的。在附圖中，一些元素的大小可以放大，且并非按說明目的的比例繪制。當術語“包含”用于說明書和權利要求中時，其不排斥其他元素或步驟。當提及單數名詞使用了不定冠詞或的定冠詞如"一個(a)"或"(an)"、"所述(the)"時，除非另有明確說明，否則這包括所述名詞的復數。此外，在說明書和權利要求書中術語第一、第二、第三等用于區分相似的元素，且未必用于描述相繼順序或時間順序。應當理解至IJ，如此使用的術語在適當的情形下可以互換，并且本文所述的本發明的實施方案能以除了本文所述或說明的順序之外的其他順序運行。除非本文另有定義，否則用于本發明的科技術語和短語，應具有本領域普通技術人員通常所理解的含義。通常，本文所述分子和細胞生物學、遺傳學以及蛋白和核酸化學和雜交技術和用于所述技術中的術語，都是用于本領域公知和常用的技術和術語。除非另有說明，否則，通常根據本領域公知且在各種通用且更具體的參考文獻中所述的常規方法進行，所述參考文獻在本說明書中做了引用和討論。參閱例如Sambrook et al.MolecularCloning:A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y.(1989);Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to2002)。術語〃蛋白結合結構域〃通常指能利用特異性分子間相互作用結合蛋白或肽的任何非天然存在的分子或其部分。多種分子都可以發揮蛋白結合結構域的功能，包括但不限于蛋白質分子(蛋白、肽、肽樣或含有蛋白的分子)、核酸分子(核酸、核酸樣或含有核酸的分子)以及碳水化合物分子(碳水化合物、碳水化合物樣、含有碳水化合物的分子)。在本說明書中可以進一步發現更詳細的描述。本文所用術語〃多肽〃、〃蛋白〃、“肽”在本文中可互換使用，并指任何長度的氨基酸的多聚體形式，其可以包括編碼和非編碼的氨基酸、化學或生化修飾的或衍生的氨基酸以及具有修飾的肽主鏈的多肽。本文所用術語“多蛋白復合體”或“蛋白復合體”或僅僅“復合體”指一組兩個或更多個相關的多肽鏈。蛋白復合體中的蛋白，通過非共價蛋白-蛋白相互作用而連接。“四級結構”是蛋白復合體中相關折疊蛋白的結構排列。“多聚體復合體(multimeric complex)”指本文所定義的蛋白復合體，其還可以包含非蛋白分子。本文所用術語〃核酸分子〃、〃多核苷酸〃，“多核酸(polynucleic acid) ”、“核酸”可互換使用，指任何長度的多聚體形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結構，并且可以執行任何功能，已知的或未知的。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、分離的任何序列的DNA、調控區、分離的任何序列的RNA、核酸探針以及引物。核酸分子可以是線性的或環狀的。本文所用術語〃配體〃或“受體配體”表示在細胞內或細胞外特異性結合GPCR的分子。配體可以是但不限于蛋白、(聚)肽、脂質、小分子、蛋白支架、核酸、離子、碳水化合物、抗體或抗體片段，如納米抗體(都如本文所定義)。配體可以是合成的或天然存在的。配體還可以包括"天然配體〃，天然配體是天然GPCR的內源性、天然配體的配體。"調節劑〃是當與在細胞中表達的GPCR接觸如結合時，增強或降低GPCR的信號傳導活性(即通過細胞內應答)的配體。該術語包括激動劑、完全激動劑、部分激動劑、反向激動劑以及拮抗劑，其更詳細的描述可進一步見于本說明書中。術語蛋白的〃構象〃或〃構象狀態〃通常指蛋白在任何情況下可能適時采用的結構范圍。本領域技術人員應當認識到，構象或者構象狀態的決定因素包括蛋白的氨基酸序列(包括修飾的氨基酸)所反映的蛋白的一級結構和蛋白周圍的環境。蛋白的構象或構象狀態還涉及結構特征，如蛋白二級結構(如α-螺旋、β_折疊等)、三級結構(如多肽鏈的三維折疊)以及四級結構(如多肽鏈與其他蛋白亞基的相互作用)。多肽鏈的翻譯后修飾和其他修飾，如配體結合、磷酸化、硫酸化、糖基化或連接疏水基團等，可以影響蛋白的構象。此外，環境因素，如周圍溶液的pH、鹽濃度、離子強度和摩爾滲透壓濃度，以及與其他蛋白和輔因子的相互作用等，可以影響蛋白的構象。蛋白的構象狀態可以由活性功能測定或結合另一分子或借助物理方法如X射線晶體學、NMR或自旋標記等其他方法測定。有關蛋白構象和構象狀態的一般討論，參考 Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry, Part1: The Conformation of Biological.Macromolecules,.W.H.Freeman and Company, 1980，和 Creighton，Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H.Freeman andCompany, 1993。“特異性構象狀態”是蛋白可能采用的構象或構象狀態范圍的任何子集。本文所用的“功能構象”或“功能構象狀態”指這樣一個事實，即蛋白具有具有擁有動態活性范圍的的不同構象狀態，特別是從無活性到最大活性。應當明確的是，意欲“功能構象狀態”涵蓋GPCR的任何構象狀態，具有任何活性，包括無活性；并且并非意圖其涵蓋蛋白的變性狀態。在抗體語境中，本文所用術語〃互補決定區〃或〃⑶R 〃指H(重)或L(輕)鏈(也分別簡稱為VH和VL)的可變區，并且含有能特異性結合抗原性靶標的氨基酸序列。這些CDR區負責抗體對具體抗原性決定子結構的基本特異性。這類區域也稱為〃高變區"。CDR代表可變區內非連續的氨基酸序列，但是不管種類如何，據發現，可變的重鏈和輕鏈區內這些關鍵氨基酸序列的位置定位在可變鏈的氨基酸序列中具有相似的定位。所有標準抗體的可變重鏈和輕鏈每個都具有3個CDR區，對于各自輕(L)和重(H)鏈，每個CDR區域與其他的(稱為L1、L2、L3、H1、H2、H3)都是不連續的。特別是，納米抗體通常包含單個氨基酸鏈，其可以被認為包含4個“構架序列或區域”或FR和3個“互補決定區”或⑶R。納米抗體具有3個⑶R區域，每個與其他的(稱為⑶R1XDR2、⑶R3)都是非連續的。FR和⑶R序列的描述，基于V結構域和V樣結構域的IMGT獨特的編號系統(Lefranc et al.2003)。本文所用“表位”指多肽的抗原決定簇。在空間構象中，表位可能包含3個氨基酸，這對于其他表位來說是獨特的。通常，表位由至少4、5、6、7個此類氨基酸組成，更通常由至少8、9、10個此類氨基酸組成。測定氨基酸空間構象的方法，在本領域中時已知的，并且包括例如X射線晶體學和2維核磁共振。本文所用“構象表位”指在對于多肽的折疊的3維構象是獨特的空間構象中包含氨基酸的表位。通常構象表位由線性序列中不連續的氨基酸組成，其在蛋白的折疊結構中集合在一起。然而，構象表位也可以由這樣的線性氨基酸序列組成，即其采用對于多肽的折疊的3維構象是獨特(且不存在于變性的狀態中)的構象。在多蛋白復合體中，構象表位由一個或多個多肽的線性序列中不連續的氨基酸組成，這些氨基酸在不同的折疊的多肽發生折疊后，它們在獨特的四級結構中相關聯，集合在一起。同樣，在本文中構象表位也可以由一個或多個多肽的線性氨基酸序列組成，所述多肽集合在一起并采用對于四級結構是獨特的構象。本文所用術語"特異性"指蛋白結合結構域特別是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段如納米抗體與不同的抗原相比優先結合一個抗原的能力，并且未必意味著高親和性。本文所用術語"親和性"指蛋白結合結構域特別是免疫球蛋白如抗體或免疫球蛋白片段如納米抗體結合抗原的程度，以改變抗原和蛋白結合結構域與存在它們的結合所形成的復合體的平衡。因此，例如，如果抗原和抗體(片段)以相對相同的濃度混合，則高親和性抗體(片段)會結合可用的抗原，以改變向所得的高濃度復合體的平衡。解離常數通常用于描述蛋白結合結構域與抗原靶標之間的親和性。通常，解離常數低于10_5m。優選地，解離常數低于10_6M，更優選地，低于10_7M。最優選地，解離常數低于10_8M。本文所用術語〃特異性結合(specifically bind) 〃和〃特異性結合(specificbinding)"通常指蛋白結合結構域特別是免疫球蛋白如抗體或免疫球蛋白片段如納米抗體優先結合存在于不同抗原的均質混合物中的具體抗原的能力。在某些實施方案中，特異性結合相互作用，會區分樣品中合適的和不合適的抗原，在一些實施方案中，多于約10-100倍或更多(如多于約1000或10，000倍)。在GPCR構象狀態譜的語境中，所述術語特別指與另一構象狀態相比，蛋白結合結構域(如本文所定義)優先識別和/或GPCR的結合具體構象狀態的能力。例如，活性狀態選擇性蛋白結合結構域會優先結合活性構象狀態的GPCR，并且不會或者會以較小程度結合非活性構象狀態的GPCR，因此對于所述活性構象狀態具有更高的親和性。所述術語“特異性結合”、“選擇性結合”、”優先結合”及其語法等同體在本文中可互換使用。所述術語“構象特異性”或“構象選擇性”在本文中也可互換使用。本文所用“抗原”表示能在動物中誘發免疫應答的分子。在GPCR的構象狀態譜的語境中，所述分子在具體構象狀態中包含在另一構象狀態中不形成或更難以形成的GPCR構象表位。"缺失"在本文中定義為氨基酸或核苷酸序列中的變化，在所述序列中，與親本多肽或核酸的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分別缺少一個或多個氨基酸或核苷酸殘基。在蛋白語境中，缺失可以涉及約2、約5、約10、高達約20、高達約30或高達約50個或更多個氨基酸的缺失。蛋白或其片段可以含有多于一個缺失。在GPCR的語境中，缺失也可以是環缺失或N-和/或C末端缺失。〃插入〃或〃添加〃是指氨基酸或核苷酸序列的變化，與親本蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列相比，其分別導致一個或多個氨基酸或核苷酸殘基的添加。"插入"通常指在多肽的氨基酸序列中添加一個或多個氨基酸殘基，而“添加”可以是插入或指在N-或C末端或者兩端添加的氨基酸殘基。在蛋白或去片段的語境中，插入或添加通常為約1、約3、約
5、約10、高達約20、高達約30或高達約50或更多個氨基酸。蛋白或其片段可以含有多于一個插入。本文所用"取代〃，與親本蛋白或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，分別由不同的氨基酸或核苷酸取代一個或多個氨基酸或核苷酸所致。應當理解到，蛋白或其片段可以具有實質上對蛋白活性不具有影響的保守氨基酸取代。保守取代是既定組合，如 gly，ala ；val, ile, leu, met ；asp, glu ；asn, gin ；ser, thr ；lys, arg ；cys, met ；以及phe，tyr, trpD本文所用“晶體”或“晶體結構”指固體材料，其組成性原子、分子或離子以在所有3個空間維度上延伸的有序重復模式排列。由流體或由溶解于流體中的材料形成晶體結構的過程經常稱為“結晶”或“晶體發生”。蛋白晶體經常生長于溶液中。最常見的放法是逐步降低其組成分子的溶解性。溶液中晶體生長的特征以2個步驟為特征:纖維微晶的成核作用(可能僅具有100個分子)，隨后理想的是微晶生長成衍射質量的晶體。
本文所用“X射線晶體學”是測定晶體內原子排列的方法，其中X射線束攻擊晶體并衍射成許多具體方向。根據這些衍射光束的角度和強度，檢晶器可以產生晶體內電子強度的三維圖像。根據所述電子強度，可以測定原子在晶體中的位置以及它們的化學鍵、它們的無序以及各種其他信息。本文所用術語“原子坐標”指分子結構中原子的一組三維坐標。在一實施方案中，利用X射線晶體學根據生物物理學領域普通技術人員熟知的方法，獲得原子坐標。簡而言之，X射線衍射圖可以通過使X射線脫離晶體產生衍射而獲得。衍射數據用于計算包含晶體的晶胞的電子密度圖；所述圖用于建立在晶胞中原子的位置(即原子坐標)。本領域技術人員應當理解，利用X射線晶體所測定的一組結構坐標含有標準誤差。在其他實施方案中，原子坐標可以利用其他實驗物理結構測定方法獲得，所述方法可以包括電子衍射(也稱為電子晶體學)和核磁共振(NMR)方法。還在其他實施方案中，原子坐標可以利用分子建模工具獲得，所述工具可以基于一個或多個從頭開始的蛋白折疊算法、能量最小化以及基于同源性建模。這些技術對于生物物理學和生物信息學的普通技術人員而言是熟知的。本文所用“解析結構”指測定原子的排列或蛋白的原子坐標，其經常利用諸如X射線晶體學的生物物理學方法進行。本文所用術語“化合物”或“測試化合物”或“候選化合物”或“藥物候選化合物”描述在測定如篩選測定或藥物發現測定中測試的天然存在的或合成的任何分子。因此，這些化合物包含有機或無極化合物。所述化合物包括以低分子量為特征的多肽、脂質或激素類似物。其他生物多聚有機測試化合物包括包含約2至約40個氨基酸的小肽或肽樣分子(肽模擬物)和包含約40至約500個氨基酸的較大的多肽如抗體、抗體片段或抗體綴合物。測試化合物也可以是蛋白支架。為了高通量目的，可以使用測試化合物庫，如提供足夠范圍的多樣性的組合或隨機化文庫。實例包括但不限于天然化合物文庫、變構化合物文庫、肽文庫、抗體片段文庫、合成化合物文庫、基于片段的文庫、噬菌體展示文庫等。更詳細的描述還可以進一步見于說明書中。本文所用術語“測定” (determining)、“測量”、“評估”、“監測”以及“測定(assaying) ”在本文中可互換使用，包括定量和定性測定。有關GPCR的術語〃生物學活性〃指示具有天然存在的GPCR的生化功能(如結合功能、信號轉導功能或由于配體結合而改變構象的能力的GPCR。本文所用術語〃治療有效量"、〃治療有效劑量〃和〃有效量〃表示實現期望的一個或多個結果所需的量。本文所用術語〃藥學上可接受的〃表示非生物學或其他方面不期望的材料，即可以將所述材料與所述化合物一起給予個體，而不引起任何不期望的生物影響或以有害方式與含有所述材料的藥物組合物中的任何其他組分相互作用。詳細描述GPCR的結構信息會提供與信號從受體轉移到細胞內相互作用蛋白(G蛋白、β -抑制蛋白等)有關的結構、功能和生物信息變化的洞見，并且會描繪干擾這些藥理上相關的相互作用的方式。因此，獲得并晶體化GPCR的努力非常重要。然而，由于用GPCR工作的生化挑戰和這些復合體在去污劑溶液中的固有不穩定性，這是非常困難的企圖。同時，僅僅GPCR固有的構象韌性就使得GPCR的高分辨率結構分析復雜化，因為生長衍射質量晶體需要穩定的構象上均質的蛋白(Kobilka et al.2007)。本發明提供了捕獲或“冷凍”目的GPCR的功能構象狀態、特別是其活性構象狀態的實驗和分析工具，從而允許對GPCR進行結構和功能分析，包括高分辨率結構分析和由其衍生的許多其他應用。本發明的第一方面涉及能特異性結合GPCR的功能構象狀態的蛋白結合結構域。本發明的蛋白結合結構域可以是能特異性結合靶GPCR的功能構象狀態的任何非天然存在的分子或其一部分(如上文所定義)。在優選的實施方案中，本文所述的蛋白結合結構域是蛋白支架。術語"蛋白支架"通常指形成結構、特別是蛋白或肽結構的折疊單位，所述結構包含用于另一分子例如蛋白結合的構架(參閱例如Skerra，J.2000，供參考)。蛋白結合結構域可以來源于天然存在的分子，例如來源于固有或適應性免疫系統組分，或其可以完全是人工設計的。蛋白結合結構域可以是基于免疫球蛋白的，或其可以基于存在于蛋白中的結構域，包括但不限于微生物蛋白、蛋白酶抑制劑、毒素、纖連蛋白、脂鈣蛋白、單鏈反平行卷曲螺旋蛋白或重復基元蛋白。本領域已知的蛋白結合結構域的實例包括但不限于:抗體、重鏈抗體(hcAb)、單結構域抗體(sdAb)、微型抗體、來源于駱駝重鏈抗體的可變結構域(VHH或納米抗體)、來源于鯊魚抗體的新抗原受體的可變結構域(VNAR)，α體、蛋白Α、蛋白G、設計的錨蛋白重復結構域(DARPins)、纖連蛋白III型重復、抗運載蛋白(anticalin),打結素、工程化CH2結構域(納米抗體)、肽和蛋白、脂肽(如pepducin)、DNA以及 RNA (參見例如 Gebauer&Skerra, 2009; Skerra, 2000; Starovasnik et al., 1997; Binzet al., 2004;Koide et al., 1998;Dimitrov, 2009;Nygren et al.2008;W02010066740)。經常，當利用選擇方法產生具體類型的蛋白結合結構域時，用包含共有序列或構架序列的組合文庫篩選與目的分子如蛋白的結合，所述共有序列或構架序列含有隨機的潛在相互作用殘基。本文所用的"G蛋白偶聯受體"或"GPCR"是共享共同的結構基元的多肽，具有7個22-24個疏水氨基酸的區域，所述7個區域形成7個α螺旋，每個螺旋都跨越膜。每次跨越以數字來確定，即跨膜-1 (TMl)、跨膜-2 (ΤΜ2)等。跨膜螺旋通過細胞膜的外部或細胞外側上跨膜-2與跨膜_3、跨膜-4與跨膜-5以及跨膜-6與跨膜-7之間的氨基酸區域連接，也分別稱為“細胞外”區域1、2以及3(EC1、EC2以及EC3)。跨膜螺旋還通過細胞膜內部或細胞內側上的跨膜-1與跨膜_2、跨膜-3與跨膜-4以及跨膜-5與跨膜-6之間的氨基酸區域連接，也分別稱為“細胞內”區域1、2以及3 (ICl、IC2以及IC3)。受體的〃羧基〃 (〃C〃)末端位于細胞內的細胞內空間，并且受體的“氨基”("N")末端位于細胞外的細胞外空間。這些區域中的任何區域都易于通過分析GPCR的一級氨基酸序列而鑒定。GPCR結構和分類在本領域中通常是公知的，并且GPCR的進一步討論可見于 Probst et al.1992; Marchese et al.1994; Lagerstroni & Schioth,2008; Rosenbaum et al.2009 ；以及下列書籍:Jurgen Wess (Ed) Structure-FunctionAnalysis of G Protein-Coupled Receptors published by WiIey-Liss(1stedition;October 15，1999) ;Kevin R.Lynch (Ed)Identification and Expressionof Protein-Coupled Receptors published by John ffiley&Sons (Marchl998)and Tatsuya Haga(Ed) , G Protein-Coupled Receptors, published by CRCPress (September24, 1999)；以及 Steve Watson(Ed)G-Protein Linked ReceptorFactsbook, published by Academic Press (1st edition;1994)。
可以基于序列同源性將GPCR歸為若干不同的家族。盡管所有GPCR都具有相似的7個跨膜α螺旋的結構，但是該受體類別中不同的家族依然沒有表現出與另一家族的序列同源性，因此這表明，它們跨膜結構域結構的相似性可能限定了共同的結構要求。當人類基因組的初稿可用時，有關GPCR庫的綜述是可能的。弗雷德里克森(Fredriksson)及其同事基于系統發育標準將802個人GPCR分成家族。這表明，大多數人GPCR可見于5個主要的家族，稱為谷氨酸家族、紫紅質家族、粘附家族、Frizzled/Taste2家族以及分泌素家族(Fredriksson et al., 2003)。在本發明的優選實施方案中，蛋白結合結構域針對或能特異性結合GPCR的功能構象狀態，其中所述GPCR選自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR視紫紅質家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCRFrizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。優選地，GPCR是哺乳動物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆蟲蛋白。甚至，更優選地，GPCR是人蛋白。視紫紅質家族(在較老的分類系統中對應于A類(Kolakowski, 1994)或I類(Foord et al(2005))的成員，僅具有小細胞外環，并且配體與殘基的相互作用發生于跨膜裂隙中。這是迄今為止最大的一組(>90%的GPCRs)并且含有著嗅劑、小分子如兒茶酚胺和胺、(神經)肽以及糖蛋白激素的受體。視紫紅質是該家族的代表，其是結構已經被解析的第一個GPCR (Palczewski et al.，2000)。β 2AR是與結構已經被解析的擴散性配體相互作用的第一個受體(Rosenbaum et al, 2007),其也屬于該家族。最近基于系統發育分析，已經將B類GPCR或2類(Foord et al, 2005)受體細分成2個家族:粘附和分泌素(Fredrikssonet al., 2003) 0粘附和分泌素受體的特征是，參與配體結合的相對長的氨基末端細胞外結構域。有關跨膜結構域的了解很少，但是其非常可能不同于視紫紅質的跨膜結構域。這些GPCR的配體是激素，如胰高血糖素、分泌素、促性腺激素釋放激素以及副甲狀腺激素。谷氨酸家族受體(C類或3類受體)也具有大的細胞外結構域，所述結構域的功能如同"捕蠅草(Venus fly trap)"，因為其與內部結合的激動劑一起打開和關閉。家族成員是代謝型谷氨酸受體、Ca2+敏感受體以及Y-氨基丁酸(GABA)-B受體。GPCR包括但不限于血清素嗅覺受體、糖蛋白激素受體、趨化因子受體、腺苷受體、生物胺受體、黑皮質素受體、神經肽受體、趨化性受體、生長激素抑制素受體、阿片樣受體、褪黑素受體、降鈣素受體、PTH/PTHrP受體、胰高血糖素受體、分泌素受體、蛛毒素受體、代謝型谷氨酸受體、鈣受體、GABA-B受體、信息素受體、蛋白酶激活受體、視紫紅質和其他G蛋白偶聯的7跨膜節段受體。GPCR還包括這些彼此相關的GPCR受體，如同聚二聚體或異聚二聚體或更高級別的寡聚體。GPCR的氨基酸序列(和編碼它們的cDNA的核苷酸序列)容易獲得，例如，參考 GenBank (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/entrez)。根據優選的實施方案，GPCR選自腎上腺素能受體，優選α腎上腺素能受體，如α I腎上腺素能受體和α 2腎上腺素能受體，以及β腎上腺素能受體，如β I腎上腺素能受體、β 2腎上腺素能受體以及β 3腎上腺素能受體；或選自毒蕈堿受體，優選Ml毒蕈堿受體、M2毒蕈堿受體、M3毒蕈堿受體、Μ4毒蕈堿受體以及Μ5毒蕈堿受體；或選自血管緊張素受體，優選血管緊張素I1-1型受體、管緊張素ΙΙ-2型受體以及其他非點心的血管緊張素II型受體，所有這些受體在本領域中都是熟知的。本文所用的GPCR可以是任何天然存在的或非天然存在的(即人為改變的)多肽。術語〃天然存在的〃在提及GPCR時表示，天然產生的GPCR(例如但不限于，由哺乳動物，更具體而言由人或由病毒或由植物或由昆蟲等產生的)。這類GPCR是在自然界發現的。術語〃非天然存在的〃在提及GPCR時表示不是天然存在的GPCR。通過突變在組成上變成有活性的野生型GPCR和天然存在的GPCR的變體是非天然存在的GPCR的實例。非天然存在的GPCR可以具有與天然存在的GPCR至少80%相同、至少90%相同、至少95%相同或至少99%相同的氨基酸序列。在本發明的范圍內以β 2-腎上腺素能受體作為GPCR的具體非限制性實例，根據上述應當明確，除了人@2腎上腺素能受體(Genbank登錄號ΝΡ_000015所述序列)以外，也可以使用小鼠β 2腎上腺素能受體(如Genbank登錄號ΝΜ007420所述的序列)或其他哺乳動物β2腎上腺素能受體。另外，意欲所述術語包括來自具體物種的32腎上腺素能受體的野生型多態性變體和某些其他活性變體。例如，〃人32腎上腺素能受體"具有與Genbank登錄號為ΝΡ_000015的天然存在的〃人β 2腎上腺素能受體〃至少95%相同(如至少95%或至少98%相同)的氨基酸序列。此外，應當認識到，本發明還考慮到具有環缺失或N-和/或C末端缺失或有關其氨基酸或核苷酸序列的取代或插入或添加或上述的任何組合的GPCR(如上文所定義，并也可參見實施例部分)。進一步預期，本發明的蛋白結合結構域通常能結合所述GPCR的所有天然存在的或合成的類似物、變體、突變體、等位基因。可以用各種方法測定蛋白結合結構域與靶GPCR之間的特異性結合，包括例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、表面等離子共振測定、噬菌體展示等，上述都是本領域的普通實踐，例如討論于 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual.ThirdEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 中。應當認識至Li,出于該目的，經常使用特殊的標記或標簽，如肽標記、核酸標記、化學標記、突光標記或射頻標簽，如本文進一步所述。應當明確的是，GPCR是構象上復雜的膜蛋白，其表現出響應天然和合成配體的特征功能行為。根據結合蛋白激活的激動劑限定通路，會要求與各種天然或合成配體(包括活性激動劑結合狀態和GPCR - G蛋白復合體的結構)復合的所研究的受體不同構象狀態的晶體結構的組合，這會沿著激活通路提供快照。因此，在優選的實施方案中，蛋白結合結構域能穩定或增強GPCR的具體功能構象狀態的穩定性。優選地，蛋白結合結構域能在結合GPCR后誘導所述GPCR的功能構象狀態。所述GPCR的所述功能構象狀態可以是基礎構象狀態或活性構象狀態或非活性構象狀態。優選地，蛋白結合結構域能穩定活性構象狀態的GPCR和/或能迫使GPCR在結合后采用其活性構象狀態。對于GPCR(如本文所定義的)的功能構象狀態，本文所用的措辭“誘導”或“迫使”或“鎖定”或“誘捕(trapp ing) ”或“固定”或“冷凍”指，根據本發明，由于GPCR與蛋白結合結構域相互作用的影響，保持或支持GPCR采用其另外呈現的可能的構象子集。因此，本文所用“構象誘捕”或“構象固定”或“構象鎖定”或“構象冷凍”的蛋白是這樣的一種蛋白，由于GPCR與本發明的蛋白結合結構域相互作用的影響，其被保持在其可能另外采用的可能的構象子集中。在這種語境下，特異性或選擇性接結合蛋白的具體構象或構象狀態的蛋白結合結構域，指以比蛋白可能呈現的其他構象或構象狀態更高的親和性結合采用構象或構象狀態子集的所述蛋白的蛋白結合結構域。本領域技術人員應當認識到，特異性或選擇性結合蛋白的具體構象或構象狀態的蛋白結合結構域，會穩定這種具體構象或構象狀態。
本文所用術語“功能構象狀態”指蛋白特別是膜蛋白如GPCR具有不同構象狀態的事實，所述構象狀態具有動態活性范圍，特別是從無活性到最大活性范圍(Kobilka andDeupi，2007做了綜述)。應當明確的是，并非意圖“功能構象狀態”涵蓋蛋白的變性狀態。GPCR的多功能性與導致這一構象譜的這些蛋白的柔韌性固有偶聯。構象能量圖景本質上與存在結合配體(效應分子、激動劑、拮抗劑、反向激動劑……)、脂質環境或相互作用蛋白的結合偶聯。例如，“基礎構象狀態”可以定義為缺少配體(如上文所定義的，如效應分子、激動劑、拮抗劑、反向激動劑)情況下的受體的低能狀態。蛋白會經歷向另一構象狀態轉變的概率，是兩種狀態之間的能量差異與兩種狀態之間能障高度的函數。在受體蛋白如GPCR的情況下，配體結合的能量可以用于改變兩種狀態之間的能障或改變兩種狀態之間的相對能量水平，或改變兩者。改變能障會對兩種狀態之間的轉變速率具有影響，而改變能量水平會對兩種狀態的受體的平衡分布具有影響。激動劑或部分激動劑的結合會減少能障和/或相對于非活性構象狀態降低更具活性的構象狀態的能量。反向激動劑會增加能障和/或相對于“活性構象”降低“非活性狀態構象”的能量。受體與其G蛋白的偶聯，可能進一步改變能量圖景。包括GPCR在內的膜本體蛋白的活性，也受到在膜中圍繞它們的脂質分子結構的影響。膜蛋白不是剛性實體，并且變形，以確保與周圍脂質雙層良好的疏水匹配。一個重要的參數是脂質雙層的疏水厚度，其由脂質脂肪酰鏈限定。同時，脂質首基區的結構可能對于限定位于脂質首基區的膜蛋白這些部分的結構是重要的。在其他脂質中，膽固醇的棕櫚酰化和與GPCR的結合，可能也在單體受體內發揮結構作用，并有助于受體寡聚體的形成/穩定(Lee2004;Chini and Parenti2009)。上文所定義的“受體配體”或僅僅“配體”可以是“正位”配體(天然和合成的)，意即它們結合受體的活性位點，并且根據它們的功效或換而言之根據它們通過具體通路對受體信號傳導的影響而對其進一步分類。本文所用的“激動劑”指通過結合受體增強所述受體的信號傳導活性的配體。完全激動劑能進行最大受體刺激；部分激動劑不能誘發完全活性，即使在飽和濃度下。部分激動劑通過防止更強激動劑的結合而發揮“阻斷劑”的功能。“拮抗劑”指結合受體但不刺激任何活性的配體。由于能防止其他配體的結合并因此阻斷激動劑誘導的活性，“拮抗劑”也被稱為“阻斷劑”。此外，“反向激動劑”指除了阻斷激動劑作用之外，還將受體的基礎或固有活性降低至低于無配體受體的活性。GPCR如何調節細胞生理的正規觀點是，配體(如激素、神經遞質或感官刺激物)的結合穩定受體的活性構象狀態，從而允許與異源三聚體G蛋白相互作用。除了與G蛋白相互作用之外，激動劑結合的GPCR與GPCR激酶(GRKs)結合，導致受體磷酸化。GRK磷酸化GPCR的常見結果是降低GPCR與G蛋白的相互作用，并增強GPCR與抑制蛋白的相互作用，這在空間上進一步阻斷G蛋白信號傳導，從而導致受體脫敏。因為β抑制蛋白關掉G蛋白信號，因此它們可以同時啟動一組第二平行信號級聯，如MAPK通路。GPCR還與一般的GPCR相互作用蛋白家族(G蛋白 、GRK、抑制蛋白和其他受體)外的各種蛋白結合。這些GPCR選擇性伴侶可以介導GPCR信號傳導，通過G蛋白組織GPCR信號傳導，指導GPCR運輸，將GPCR錨定在特定亞細胞區域和/或影響GPCR藥理(Ritter and Hall2009)。因此，本文所用的配體也是能選擇性刺激一子集受體的信號傳導活性的“偏愛性配體”，例如選擇性激活G蛋白或β抑制蛋白功能。這類配體也稱為“偏愛性配體”、“偏愛性激動劑”或“功能選擇性激動劑”。具體而言，配體偏愛可以是不完美的偏愛，其特征是對于不同信號，配體以不同的相對功效刺激多受體活性(非絕對選擇性)；或可以是完美的偏愛，其特征是，配體刺激一種受體活性，而對另一已知的受體活性無任何刺激。GPCR的信號傳導活性(以及因此它們的構象行為)也可以受到另一類稱為變構調節劑的配體的影響。“變構調節劑(allosteric regulators) ”或“變構調節劑(allostericmodulator) ”、“變構配體”或“效應分子”在GPCR的變構位點(也就是說，在物理上不同于蛋白的活性位點 的調節位點)結合。與正位配體相比，變構調節劑是非競爭性的，因為它們在不同的位點結合受體，并且修飾受體功能，即使內源性配體正在結合。因為這一點，變構調節劑并不限于僅僅打開或關閉受體，這是大多數藥物的方式。相反，它們更像二聚體開關一樣發揮作用，從而對激活或失活強度提供控制，同時允許肌體保留其對啟動受體激活的天然控制。增強蛋白活性的變構調節劑在本文中也稱為“變構激活劑”或“正向變構調節齊U”，而降低蛋白活性的那些在本文中稱為“變構抑制劑”或“負向變構調節劑”。優選地，本發明的蛋白結合結構域能特異性結合與激動劑結合的GPCR和/或增強GPCR對激動劑的親和性。優選蛋白結合結構域在結合受體后能增強激動劑的親和性至少2倍、至少5倍，更優選至少10倍，這可以通過EC5Q、IC5Q、Kd的降低或本領域技術人員已知的親和性或潛能的任何其他測量而測量。應當認識到，GPCR的結構穩定性和/或具體生物學活性的增強，也可以是其他變性劑或變性條件的指導，包括熱、去污劑、離液劑和極端pH。因此，在另一實施方案中，本發明的蛋白結合結構域能在稀釋、濃縮、緩沖組合物、熱、冷卻、冷凍、去污劑、離液齊U、pH誘導的非生理條件下增強GPCR的功能構象狀態。與水溶性蛋白相比，已經證明膜蛋白折疊和穩定性的熱力學研究是非常具有挑戰性的，并且由于難以發現可逆折疊的條件而復雜化。使通過諸如熱和化學方法等大多數方法誘導的螺旋跨膜蛋白解折疊，如Stanley and Fleming(2008)所綜述的，都是不可逆的。因此,本文所用的術語“熱穩定
(thermostabilize) ”、“熱穩定(thermostabilizing) ”、“增強......的熱穩定性”，指 GPCR 的
功能特性而不是指其熱力學特性，并且指蛋白對熱和/或化學方法所誘導的不可逆變性的抗性，所述方法包括但不限于加熱、冷卻、冷凍、化學變性劑、pH、去污齊IJ、鹽、添加齊IJ、蛋白酶或溫度。不可逆變性導致蛋白功能構象的不可逆解折疊、生物學活性喪失以及變性蛋白的聚集。本文所用的術語“(熱)穩定”、“(熱)穩定”、“增強……的(熱)穩定性”適用于包埋于脂質顆粒或脂質層(例如脂質單層、脂質雙層等)的GPCR，并且適用于已經溶解于去污劑中的GPCR。優選地，本發明的蛋白結合結構域能增強GPCR的功能構象狀態、優選GPCR的活性構象狀態的熱穩定性。對于對熱的穩定性增強，這可以容易地通過以下方式測定:測量配體結合，或利用溫度增加時對解折疊敏感的光譜法，如熒光、CD或光散射(也請參閱實施例部分)。優選地，蛋白結合結構域能增強穩定性，如通過功能構象狀態的GPCR的熱穩定性增強至少2° C、至少5° C、至少8° C、更優選至少10° C或15° C或20° C所測量的。根據另一優選的實施方案，蛋白結合結構域能增強與配體復合的GPCR的功能構象的熱穩定性，所述配體諸如但不限于GPCR的激動劑、反向激動劑、拮抗劑和/或調節劑或抑制劑或GPCR依賴性信號傳導通路。根據另一優選的實施方案，本發明的蛋白結合結構域在存在去污劑或離液劑的情況下能增強GPCR的功能構象狀態的穩定性。優選地，蛋白結合結構域能增強GPCR活性構象狀態對熱或化學方法所誘導的變性的穩定性。對于對熱、去污劑或離液劑穩定性的增強，通常在存在測試去污劑或測試離液劑的情況下，將GPCR孵育確定的時間，并且利用例如配體結合或光譜方法，任選地在上文所討論的溫度增加的下，測定穩定性。仍然根據另一優選的實施方案，本發明的蛋白結合結構域能增強GPCR的功能構象狀態對極端PH的穩定性。優選地，蛋白結合結構域能增強GPCR活性構象狀態對極端pH的穩定性。對于PH的限度，所選擇的典型測試pH范圍為例如6-8、5.5-8.5、5_9、4.5-9.5，更具體而言范圍為4.5-5.5 (低pH)，或范圍為8.5-9.5 (高pH)。本發明的蛋白結合結構域通常可以針對任何期望的GPCR，并且特別是可以針對任何GPCR的任何構象表位，優選任何GPCR的功能構象狀態，更優選GPCR的活性構象狀態(都如上文所定義)。具體而言，所述構象表位可以是細胞內或細胞外區域或膜內區域或任何期望的GPCR的結構域或環結構的一部分。根據具體實施方案，蛋白結合結構域可以針對GPCR的任何合適的細胞外區域、結構域、環或其他細胞外構象表位，但是優選針對跨膜結構域的細胞外部分之一，或更優選針對連接跨膜結構域的細胞外環之一。可選地，蛋白結合結構域可以針對GPCR的任何合適的細胞內區域、結構域、環或其他細胞內構象表位，但是優選針對跨膜結構域的細胞內部分之一，或更優選針對連接跨膜結構域的細胞內環之一。特異性結合“三維”表位或“構象”表位的蛋白結合結構域，特異性結合折疊蛋白的三級(即三維)結構，并且以大量降低(即至少2、5、10、50或100倍)的親和性結合線性(即解折疊的，變性的)形式的蛋白。進一步期望，本發明的蛋白結合結構域通常會結合所述GPCR的所有天然存在的或合成的類似物、變體、突變體、等位基因。在具體實施方案中，本發明的蛋白結合結構域能特異性結合GPCR的細胞內構象表位。優選地，所述蛋白結合結構域能特異性結合這樣的構象表位，其包含于、位于GPCR的G蛋白結合位點，或與之重疊。更優選地，所述蛋白結合結構域可以占據GPCR的功能構象狀態、更優選GPCR活性構象狀態的G蛋白結合位點。最優選地，所述蛋白結合結構域表現出G蛋白樣行為。本文所用術語“G蛋白樣行為”指與例如反向激動劑結合的受體相比，蛋白結合結構域優先結合與激動劑結合的受體的特性。表現出G蛋白樣行為的蛋白結合結構域也增強受體對激動劑的親和性，這歸因于激動劑占據的受體與G蛋白之間的協同相互作用(也請參見實施例部分)。在優先的實施方案中，蛋白結合結構域來源于固有或適應性免疫系統。優選地，所述蛋白結合結構域來源于免疫球蛋白。優選地，本發明的蛋白結合結構域是抗體或是抗體衍生物。術語"抗體"(Ab)通常指免疫球蛋白級基因所編碼的多肽或其功能片段，所述多肽特異性結合并識別抗原，并且是本領域技術人員已知的。常見的免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。每個四聚體都由2對相同的多肽鏈構成，每對鏈都具有一條"輕"鏈(約25kDa)和一條〃重鏈〃鏈(約50-70kDa)。每條鏈的N末端都限定主要負責抗原識別的約100-110個或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈。術語“抗體”意圖包括全抗體，包括單鏈全抗體和抗原結合片段。在一些實施方案中，抗原結合片段可以是抗原結合抗體片段，其包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fv(dsFv)和包含或組成為VL或VH結構域的片段以及上述的任何組合，或能結合靶抗原的免疫球蛋白肽的任何其他功能部分。如本文進一步所限定的，術語“抗體”還意圖包括重鏈抗體或其功能片段，如單鏈結構域抗體，更具體而言納米抗體。
優選地，所述蛋白結合結構域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4個構架區和3個互補決定區(順序優選為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)或其任何合適的片段(則其通常會含有至少一些形成至少一個互補決定區的氨基酸殘基)。包含4個FR和3個CDR的蛋白結合結構域對本領域技術人員而言是已知的，并且作為非限制性實例描述于Wesolowski et al.(2009)中。優選地，本發明的蛋白結合結構域來源于駱駝抗體。更優選地，本發明的蛋白結合結構域包含納米抗體的氨基酸序列或其任何合適的片段。具體而言，蛋白結合結構域是納米抗體或其任何合適的片段。本文所用的“納米抗體”(Nb)指來源于天然存在的重鏈抗體的最小抗原結合片段或單個可變結構域(“VHH”)，并且對本領域技術人員而言是已知的。它們來源于見于胳5它中的僅具有重鏈的抗體(heavy chain only antibody) (Hamers-Castermanet al.1993;Desmyter et al.1996)。在駱5它科(Camelids)中，發現了不含輕多肽鏈的免疫球蛋白。“胳馬它科”包括舊世界胳馬它(雙峰胳馬它(Camelus bactrianus)和單峰胳馬它(Camelusdromedarius))和新世界胳馬它(例如(Lama paccos)、(Lama glama)、(Lama guanicoe)以及(Lama vicugna))。所述單個可變結構域重鏈抗體在本文中稱為納米抗體或VHH抗體。NanobodyTM、Nanobodies 以及 Nanoclone 是 Ablynx NV(Belgium)的商標。Nb 的小尺寸以及獨特的生物物理特性，對于識別不常見的或隱藏的表位而言以及對于結合到蛋白靶標的腔或活性位點而言，勝過常規抗體片段。此外，Nb可以稱為雙特異性或二價抗體，或連接于報道分子(Conrath et al.2001)。Nb是穩定且剛性的單結構域蛋白，其易于制造并且幸免于胃腸系統。因此，Nb可以用于許多應用中，包括藥物發現和治療(Saerens et al.2008),但也用作蛋白純化、功能研究和結晶的通用和有價值的工具(Conrath et al.2009)。本發明的納米抗體通常包含單個氨基酸鏈，可以認為所述單個氨基酸鏈包含4個“構架序列”或FR和3個“互補決定區”或CDR(如上文所定義)。本發明納米抗體的非限制性實例在本文中有更詳細的描述。應當明確的是，納米抗體的構架區也有助于它們抗原的結合(Desmyter et al2002; Korotkov et al.2009)。本發明納米抗體的非限制性實例包括但不限于SEQ ID NO: 1-29所限定的納米抗體(參見圖12，表I)。CDR序列的描述基于V結構域和V樣結構域的IMGT獨特編號系統(Lefranc et al.2003)。在具體實施方案中，上述納米抗體可以包含至少一個氨基酸序列選自SEQ ID N0:30-70(參見圖12 ;表2)的互補決定區(⑶R)。具體而言，上述納米抗體可以選自包含SEQ ID NO: 1-29的組或其功能片段。本文所用的“功能片段”或“合適的片段”例如可以包含一個CDR環。優選地，所述功能片段包含CDR3。具體而言，所述納米抗體由SEQ IDNO: 1-29中的任何一條組成，且所述納米抗體的所述功能片段由SEQ ID NO:30-70中的任何一條組成。仍然在另一實施方案中，編碼任何上述納米抗體或功能片段的核酸序列，也是本發明的一部分。此外，本發明還考慮了包含編碼人惡化上述納米抗體或其功能片段的核酸序列的表達載體，以及表達這類表達載體的宿主細胞。合適的表達系統包括細菌或酵母的組成型和誘導型表達系統，病毒表達系統如桿狀病毒、塞姆利基森林病毒(semliki forestvirus)以及慢病毒，或在昆蟲或哺乳動物細胞中瞬時轉染。合適的宿主細胞包括大腸桿菌(E.coli)、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯得畢赤酵母菌(Pichia pastoris)等。合適的動物宿主細胞包括HEK293、COS、S2、CH0、NS0, DT40等。納米抗體的克隆、表達和/或純化可以根據本領域技術人員已知的技術進行。應當指出，本文以最廣泛涵義使用的術語納米抗體并非限于具體的生物來源或限于具體的制備方法。例如，本發明的納米抗體通常可以通過以下方式獲得:(I)分離天然存在的重鏈抗體的VHH結構域；(2)表達編碼天然存在的VHH結構域的核苷酸序列；(3)"人源化"天然存在的VHH結構域或表達編碼人源化VHH結構域的核酸；(4)"駱駝源化(camelization)"來自任何動物種類、特別是來自哺乳動物種類如來自人類的天然存在的VH結構域，或表達編碼駱駝源化VH結構域的核酸；(5)"駱駝源化"本領域所述的"結構域抗體〃或〃Dab〃，或表達編碼這類駱駝源化VH結構域的核酸；(6)利用本身已知的制備蛋白、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技術；(7)利用本身已知的核酸合成技術，制備編碼納米抗體的核酸，隨后表達由此獲得的核酸；和/或(8) —種或多種上述方式的任何組
口 ο一類優選的納米抗體對應于針對GPCR的功能構象狀態的天然存在的重鏈抗體的VHH結構域。盡管納米抗體的天然或合成文庫(對于文庫的實例，參閱W09937681、W00043507, W00190190, W003025020以及W003035694)可以含有針對功能構象狀態的GPCR的構象粘合劑，但是本發明的優選實施方案包括用任選地結合受體配體的功能構象狀態的GPCR免疫駱駝，以暴露具有對GPCR而言獨特的構象表位的動物的免疫系統(例如，激動劑結合的GPCR，從而產生抗活性構象狀態的GPCR的抗體)。因此，如本文進一步所述，優選這類VHH序列可以通過以下方式產生或獲得:用GPCR，優選功能構象狀態、更優選活性構象狀態的GPCR合適地免疫駱駝科物種(即以便產生針對所述GPCR的免疫應答和/或重鏈抗體)，由所述駱駝(如B細胞的血樣或任何樣品)獲得合適的生物樣品，以及從所述樣品開始，產生針對所述GPCR的VhH序列。這類技術是技術人員清楚的。獲得期望的VHH序列的另一項技術包括，合適地免疫能表達重鏈抗體的轉基因哺乳動物(即以便產生針對功能構象狀態的GPCR的免疫應答和/或重鏈抗體)，從所述轉基因哺乳動物獲得合適的生物樣品(如B細胞的血樣或任何樣品)，以及接著從所述樣品開始，利用本身已知的任何合適技術，產生針對所述GPCR的VHH序列。例如，出于這個目的，可以利用描述于W002085945和W004049794中的表達重鏈抗體的小鼠和其他方法及技術。因此，本發明包括產生本發明的蛋白結合結構域的方法。作為非限制性實例，提供了產生特異性結合GPCR的功能構象狀態的構象表位的納米抗體的方法，包括:⑴用GPCR免疫動物，和(ii)篩選特異性結合所述GPCR的功能構象狀態的構象表位的納米抗體。優選地，在存在受體配體的情況下，會用GPCR免疫動物，其中所述配體誘導所述GPCR的具體功能構象狀態。例如，在存在誘導GPCR活性構象狀態形成的激動劑的情況下，通過用所述GPCR免疫動物，可以產生特異性結合所述GPCR活性構象狀態的構象表位的納米抗體(還參閱實施例部分)。為了用GPCR免疫動物，可以利用常規方法產生并純化GPCR，所述方法可以使用在宿主細胞中表達重組形式的GPCR，并利用親和層析和/或基于抗體的方法純化GPCR。在具體實施方案中，桿狀病毒/Sf-9系統可以用于表達，盡管其他表達系統(例如細菌、酵母或哺乳動物細胞系統)也可以使用。表達和純化GCPR的實例性方法描述于例如Kobilka (1995), Eroglu et al (2002), Chelikani et al (2006)和書籍"Identificationand Expression of G Protein-Coupled Receptors^ (Kevin R.Lynch (Ed.), 1998)等許多其他文獻中。也可以在磷脂泡中重建GPCR。同樣，在磷脂泡中重構活性GPCR的方法是已知的，并且描述于:Luca et al (2003), Mansoor et al (2006), Niu et al.(2005)，Shimada etal.(2002)以及Eroglu et al.(2003)等中。在某些情況下，GPCR和磷脂可以以高密度重構(例如Img受體/mg磷脂)。在具體實施方案中，可以測試磷脂泡以證實GPCR是活性的。在許多情況下，GPCR可以以兩種方向存在于磷脂泡中(以正常方向，和以〃倒置〃方向，其中細胞內環位于小泡的外面)。用GPCR免疫的其他的方法包括但不限于使用表達GPCR的完整細胞、用編碼GPCR的核酸序列接種(如DNA接種)、用表達GPCR的病毒或病毒樣顆粒免疫等其他方法。可以利用本領域熟知的適合產生免疫應答的任何技術，免疫任何合適的動物，如溫血動物，特別是哺乳動物如兔、小鼠、大鼠、駱駝、綿羊、牛、鯊魚或豬或鳥如雞或火雞。作為非限制性實例，篩選特異性結合所述GPCR的功能構象狀態的構象表位的納米抗體可以例如通過以下方式進行，篩選在表面表達重鏈抗體的細胞組、集合或文庫(如從合適地免疫的駱駝科動物獲得的B細胞)或篩選在表面展示了 genIII和納米抗體融合的噬菌體，篩選VHH序列或納米抗體序列的(天然或免疫)文庫，或篩選編碼VHH序列或納米抗體序列的核酸序列的(天然或免疫)文庫，上述都可以以本身已知的方式進行，并且所述方法還可以任選地包括一個或多個其他合適的步驟，例如但不限于親和性成熟步驟、表達期望的氨基酸序列的步驟、篩選針對期望的抗原的結合和/或活性的步驟(在此情況下，為GPCR)、測定期望的氨基酸序列或核苷酸序列的步驟、引入一個或多個人性化取代的步驟、以合適的多價和/或多特異性格式進行格式化的步驟、篩選期望的生物和/或生理特性的步驟(即利用本領域已知的合適的測定)和/或一個或多個這類步驟以任何合適的順序的組合。 本發明的一類特別優選的蛋白結合結構域包含具有氨基酸序列的納米抗體，所述氨基酸序列對應于天然存在的VHH結構域的氨基酸序列，但是其已經被“人源化”，即用一個或多個存在于來自 人常見4鏈抗體的VH結構域中相應位置處的氨基酸殘基，取代所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列(特別是構架序列)中的一個或多個氨基酸殘基。這可以以本身已知的方式進行，基于有關人源化的本文進一步描述和現有技術，這對技術人員是清楚的。還應當指出，本發明的這類人源化納米抗體可以以本身已知的任何合適的方式獲得(即如根據上文(1)-(8)點所述)，因此并非嚴格限于利用包含天然存在的VHH結構域作為起始材料的多肽獲得的多肽。人源化納米抗體具有數個優勢，例如與相應的天然存在的VHH結構域相比，免疫原性降低。這類免疫通常涉及用存在于人VH結構域如人VH3結構域中相同位置的氨基酸殘基，取代天然存在的VHH序列中的一個或多個氨基酸殘基。人源化取代的選擇應當使得所得的人源化納米抗體仍然保留本文所限定的納米抗體的有利特性。技術人員應當能選擇人源化取代或人源化取代的合適組合，從而在一方面所述人源化取代所提供的有利特性與另一方面天然存在的VHH結構域的有利特性之間優化或實現期望的或合適的平衡。本發明的另一類特別優選的蛋白結合結構域包含具有氨基酸序列的納米抗體，所述氨基酸序列對應于天然存在的VH結構域的氨基酸序列，但是其已經被“駱駝源化”，即用一個或多個存在于重鏈抗體VHH結構域中相應位置處的氨基酸殘基，取代來自常見4鏈抗體的天然存在的VH結構域氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基。優選將這類"駱駝源化"取代插入形成和/或位于VH-VL界面處和/或位于本文所限定的所謂駱駝標志殘基處的氨基酸位置處(參閱例如W09404678)。優選地，用作產生或設計駱駝源化納米抗體的起始材料或起始點的VH序列優選是來自哺乳動物的VH序列，更優選人的VH序列，如VH3序列。然而，應當指出，本發明的這類駱駝源化納米抗體可以以本身已知的任何合適的方式獲得(即如根據上(1)-(8)點所述)，并且因此并非嚴格限于利用包含天然存在的VH結構域的多肽作為起始材料獲得的多肽。例如，〃人源化〃和〃駱駝源化〃兩者都可以通過以下方式進行:提供分別編碼天然存在的VHH結構域或VH結構域的核苷酸序列，接著以本身已知的方式改變所述核苷酸序列中的一個或多個密碼子，從而使得新的核苷酸序列分別編碼本發明的“人源化”或“駱駝源化”納米抗體。隨后可以以本身已知的方式表達這種核酸，從而提供本發明的期望的抗體。可選地，分別基于天然存在的VHH結構域或VH結構域的氨基酸序列，可以分別設計本發明的期望的人源化或駱駝源化納米抗體的氨基酸序列，并隨后利用本身已知的肽合成技術從頭合成。還分別基于天然存在的VHH結構域或VH結構域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以設計分別編碼本發明的期望的人源化或駱駝源化納米抗體的核苷酸序列，并隨后利用本身已知的核酸合成技術從頭合成,之后，由此獲得的核酸可以以本身已知的方式表達,從而提供本發明的期望的納米抗體。從天然存在的VH序列或優選VHH序列開始，獲得本發明的納米抗體和/或其編碼核酸的其他合適的方法和技術，對技術人員而言是清楚的，并且可以例如包括以合適的方式組合一個或多個天然存在的VH序列(如一個或多個FR序列和/或CDR序列)的一個或多個部分、一個或多個天然存在的VHH序列(如一個或多個FR序列或CDR序列)的一個或多個部分和/或一個或多個合成或半合成序列，以便提供本發明的納米抗體或其編碼核苷酸序列或核酸。還位于本發明范圍內的是，利用本發明的蛋白結合結構域優選納米抗體的天然或合成類似物、突變體、變體、等位基因、同源物和直系同源物(在本文中統稱為“類似物”)，特別是SEQ ID NO: 1-29(參見表1，圖12)的納米抗體的類似物。因此，根據本發明的一個實施方案，最廣泛含義的術語〃本發明的納米抗體〃還涵蓋這類類似物。通常在這類類似物中，與本文所定義的本發明的納米抗體相比，可能已經取代、缺失和/或添加一個或多個氨基酸殘基。可以在一個或多個構架區和/或一個或多個⑶R，特別是SEQ ID NO: 1-29的納米抗體的CDR的類似物中進行這類取代、插入、缺失或添加，所述CDR對應于SEQ IDNO:30-70(參見表2，圖12)。本文所用的類似物是序列，其中每一或任何構架區每一或任何互補決定區都與參照序列中的相應區域表現出至少80%的同一性，優選至少85%的同一性，更優選90%的同一性，甚至更優選95%的同一性(即？1 1_類似物對FR1_參照，⑶町_類似物對CDR1_參照，FR2_類似物對FR2_參照，CDR2_類似物對CDR2_參照，FR3_類似物對FR3_參照，CDR3_類似物對CDR3_參照，FR4_類似物對FR4_參照)，這可通過BLASTp比對(Altschul et al;1987;FR and CDR definitions according to IMGT unique numberingsystem for V-domains and V-1ike domains (Lefranc et al.2003))測量。作為非限制性實例，取代可以是例如保守取代(如本文所述)和/或氨基酸殘基可以被天然存在于另一 VHH結構域中相同位置的另一氨基酸殘基取代。因此，任何一個或多個取代、缺失或插入或其任意組合， 其改善了本發明納米抗體的特性或至少不過多有損于本發明納米抗體的期望特性或本發明納米抗體期望特性的平衡或組合(即到所述納米抗體不在適合其既定用途的程度)，都包括于本發明的范圍內。基于本文公開的內容以及任選地在有限程度的常規實驗后，技術人員通常能確定并選擇合適的取代、缺失、插入或其合適的組合，所述常規實驗可以涉及例如引入數量有限的可能取代，并測定它們對因此獲得的納米抗體特性的影響。例如，并取決于用于表達本發明蛋白結合結構域、優選納米抗體的宿主有機體，可以設計這類缺失和/或取代，從而使得除去一個或多個用于翻譯后修飾的位點(如一個或多個糖基化位點)，這也在本領域技術人員能力范圍內。可選地，可以設計取代或插入，以便引入一個或多個用于連接功能基團的位點(如本文所述)，例如以允許位點特異性聚乙二醇化。修飾的實例，以及蛋白結合結構域序列、優選納米抗體序列中可以修飾的氨基酸殘基的實例(即位于蛋白主鏈上，但是優選位于側鏈上)，可以用于引入這類修飾的方法和技術，以及這類修飾的潛在用途和優勢，對本領域技術人員而言是清楚的。例如，這類修飾可以涉及，將一個或多個官能團、殘基或部分引入(例如通過共價連接或以另一合適的方式)本發明的納米抗體中或之上，特別是引入一個或多個賦予本發明的納米抗體一種或多種期望的特性或功能的官能團、殘基或實體。這類官能團的實例和將其引入的技術的實例，對技術人員而言是清楚的，并且通常可以包括上文引用的一般背景技術所提到的所有官能團和技術，以及用于修飾藥用蛋白特別是用于修飾抗體或抗體片段(包括ScFv和單結構域抗體)的本身已知的官能團和技術，為此，可以參考例如Remington’sPharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing C0.，Easton, PA(1980)。這類官能團可以例如直接(例如共價)連接于本發明的納米抗體，或任選地通過合適的連接體或間隔子，同樣，這對于技術人員而言也是清楚的。用于增加藥用蛋白的半衰期和/或降低免疫原性的最常用的技術之一，包括連接合適的藥學上可接受的多聚體，如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。通常，可以使用任何形式的合適的聚乙二醇化，如用于抗體和抗體片段(包括但不限于(單)結構域抗體和ScFv’ s)領域的；參考例如 Chapman, Nat.Biotechnol.，54，531-545 (2002) ; Veronese and Harris, Adv.Drug Deliv.Rev.54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat.Rev.Drug.Discov., 2, (2003)和TO04060965。用于蛋白聚乙二醇化的各種試劑，也可以以商業方式獲得，例如從NektarTherapeutics, USA獲得。優選地,使用定點聚乙二醇化,特別是通過半胱氨酸殘基(參見例如 Yang et al., Protein Engineering, 16，10，761-770 (2003)。例如，為此目的，可以將PEG連接于天然存在于本發明的納米抗體中的半胱氨酸殘基，可以修飾本發明的納米抗體，從而合適地引入一個或多個半胱氨酸殘基用于連接PEG，或可以將包含用于連接PEG的一個或多個半胱氨酸殘基的氨基酸序列與本發明納米抗體的N-和/或C末端稠合，所有這些都利用實質上技術人員已知的蛋白工程技術。優選地，對于本發明的納米抗體和蛋白而言，所用的PEG的分子量為大于5000，如大于10，000并小于200，000，如小于100，000 ;例如在20，000-80, 000的范圍內。另一通常較少優選的修飾包含，N-連接或O-連接的糖基化，通常作為共翻譯和/或翻譯后修飾的一部分，這取決于表達本發明的納米抗體或多肽所用的宿主細胞。用于增加納米抗體半衰期的另一項技術可以包括，改造到雙功能納米抗體(例如，一針對靶GPCR的納米抗體和一針對血清蛋白如白蛋白的納米抗體)中或改造到納米抗體與肽(例如針對針對血清蛋白如白蛋白的肽)的融合物中。另一種修飾可以包括，引入一個或多個可檢測的標記或其他信號產生基團或部分，這取決于標記的蛋白結合結構域、特別是納米抗體的既定用途。合適的標記以及連接、使用以及檢測它們的技術，對技術人員而言是清楚的，并且例如包括但不限于熒光標記(如熒光素、異硫氰酸鹽、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白、O-苯二醛、熒光胺以及突光金屬，如Eu或鑭系兀素的其他金屬)、磷光標記、化學發光標記或生物發光標記(如魯米那、異魯米那、theromatic B丫唳酯、咪唑、B丫唳鹽(acridinium salt)、草酸酯、二惡二酮(dioxetane)或GFP及其類似物)、放射性同位素、金屬、金屬螯合物或金屬陽離子或特別適合體內、體外使用或原位診斷以及成像的其他金屬或金屬陽離子，以及生色團和酶(如蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、生物素親和素過氧化物酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-V1-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶以及乙酰膽堿酯酶)。其他合適的標記對于技術人員而言是清楚的，例如包括可以利用NMR或ESR譜檢測的部分。本發明的這類標記的納米抗體或多肽可以用于體外、體內或原位測定(包括本身已知的免疫測定，如ELISA、RIA、EIA和其他〃夾心測定〃等)以及體內診斷和成像目的，這取決于對具體標記的選擇。對技術人員顯而易見的是，另一種修飾可以涉及，引入螯合基團，例如以便螯合上文提到的金屬或金屬陽離子之一。合適的螯合基團例如包括但不限于二乙基-三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。另一種修飾可以包括，引入為具體結合對的一部分的官能團，如生物素_(鏈霉)親和素結合對。這類官能團可以用于將本發明的納米抗體連接于結合于結合對的另一半的另一蛋白、多肽或化學化合物，即通過形成親和對。例如，本發明的納米抗體可以綴合于生物素，并連接于綴合于親和素或鏈霉親和素的另一蛋白、多肽、化合物或載體。例如，這類綴合的納米抗體可以用作報道子，例如在診斷系統中，其中產生可檢測信號的試劑綴合于親和素或鏈霉親和素。這類親和對也可以例如用于將本發明的納米抗體結合于載體，包括適合藥物用途的載體。一非限制性實例是描述于 Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8，4，257 (2000)的脂質體制劑。這類結合對也可以用于將治療活性劑連接于本發明的納米抗體。在具體實施方案中，本發明的納米抗體是二價的并通過化學結合或通過重組DNA技術和重鏈的兩個單價單結構域形成。在另一具體實施方案中，本發明的納米抗體是雙特異性的，并通過同時結合重鏈的兩個可變結構域而形成，每個結構域都具有不同的特異性。同樣，作為非限制性實例，包含多價或多特異性納米抗體的多肽，也包括在本文中。優選地，本發明的單價納米抗體是這樣的單價納米抗體，即其會結合GPCR的功能構象狀態、更優選GPCR活性構象狀態的細胞外部分、區域、結構域、環或其他細胞外表位，且結合時的親和性小于500nM、優選小于200nM、更優選小于ΙΟηΜ，如小于500pM。可選地，本發明的單價納米抗體是這樣的單價納米抗體，即其會結合GPCR的功能構象狀態、更優選GPCR活性構象狀態的細胞內部分、區域、結構域、環或其他細胞內表位，且結合時的親和性小于500nM、優選小于200nM、更優選小于10nM，如小于500pM。同樣，根據這一方面，本發明的任何多價或多特異性(如本文所限定)納米抗體還可以合適地針對相同抗原上的兩個或多個不同的細胞外或細胞內部分、區域、結構域、環或其他細胞外或細胞內表位，例如針對兩個不同的細胞外環或細胞內環，或針對跨膜結構域的兩個不同的細胞外部分或細胞內部分。針對期望的GPCR和/或針對可以通過使用本發明的這類多價或多特異性納米抗體而獲得的任何其他期望的特性或期望的特性的組合，這類多價或多特異性納米抗體還可以具有(或經改造和/或選擇)增強的親和力和/或改善的選擇性。在具體實施方案中，本發明的這類多價或多特異性納米抗體還可以具有(或經改造和/或選擇)改善的調節GPCR的信號傳導活性的功效(同樣進一步參閱本文)。應當認識到，本發明的多價或多特異性納米抗體還可以合適地針對不同的抗原，例如但不限于與GPCR或一個或多個下游信號傳導蛋白相互作用的配體。本發明的第二方面涉及復合體，其包含(i)本發明的蛋白結合結構域，(ii)功能構象狀態的GPCR，以及任選地(iii)受體配體。本文所限定的“受體配體”或“配體”可以是小化合物、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、離子、碳水化合物或抗體或來源于其的任何合適的片段等。配體優先來自激動劑類，并且受體處于活性構象狀態。配體也可以是反向激動齊U、拮抗劑或偏愛性配體。配體可以是正位的或變構的。配體還包括變構調節劑、增效劑(potentiator)、增強劑(enhancer)、負向變構調節劑以及抑制劑。它們自身可以具有生物學活性，或它們可以僅在存在另一配體的情況下調節活性。Neubig et al (2003)描述了許多這類配體。優選地，本發明提供了復合體，其中蛋白結合結構域結合于GPCR ;更優選地，蛋白結合結構域結合于GPCR，其中所述GPCR結合于受體配體。為了進一步說明這一點，并且并無限制目的，含有納米抗體、GPCR以及激動劑的穩定的三元復合體，可以通過親和層析或凝膠過濾從混合物純化，所述混合物含有(I)對所述GPCR的活性構象具有特異性的納米抗體，⑵去污劑增溶的受體以及⑶激動劑。在另一優選的實施方案中，復合體是晶體。因此，還提供了復合體的晶體，以及制備所述晶體的方法，其更詳細的描述于下文。優選地，考慮了晶體形式的復合體，其包含(i)本發明的蛋白結合結構域，(ii)功能構象狀態、更優選活性構象狀態的GPCR，以及任選地(iii)受體配體，其中所述晶體形式通過使用本發明的蛋白結合結構域獲得。在另一優選的實施方案中，本發明的復合體采用溶解的形式，例如在用去污劑水性溶解后。在可選的優選實施方案中，將本發明的復合體固定化于固相支持物上。固相支持物的非限制性實例以及固定方法和技術在詳細的描述中有進一步描述。仍然在另一實施方案中，本發明的復合體采用“細胞組合物”形式，包括有機體、組織、細胞、細胞系以及來源于所述有機體、組織、細胞或細胞系的膜組合物。意圖所述膜組合物還包括可以包含天然或合成脂質或其組合的任何脂質體組合物。膜或脂質體組合物的實例包括但不限于細胞器、膜制劑、病毒樣脂質顆粒、脂質層(雙層和單層)、脂質泡、高密度脂質顆粒(如納米盤)等。應當認識到，細胞組合物或膜樣或脂質體組合物可以包含天然或合成脂質。因此，本發明的第三方面涉及包含本發明的蛋白結合結構域和/或復合體的細胞組合物，包括其來源的膜或脂質體組合物(都如上文所限定)。優選地，提供和/或表達蛋白結合結構域的細胞組合物能在結合所述蛋白結合結構域后穩定和/或誘導GPCR的功能構象狀態。應當理解到，保持各自蛋白的充分的功能非常必要，用于此的方法和技術是可以利用的，并且對本領域技術人員而言是已知的。還應當認識到，所述細胞組合物可以內源性或外源性提供和/或靶GPCR。由膜片段或膜-去污劑提取物形成的GPCR制劑的詳細綜述見于COOper(2004)，其在此通過援引并入。實施例部分進一步提供了溶解的受體制劑的非限制性實例。
可以遵循下述文獻所概括的原則實施靶細胞(如哺乳動物細胞)的轉染uSambrook and Russel(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Volume3,Chapterl6, Sectionl6.1-16.54)。另外，也可以利用諸如腺病毒載體的試劑進行病毒轉導。選擇合適的病毒載體系統、調節區域以及宿主細胞，是本領域普通技術人員的公知常識。根據標準實踐，維持培養所得的轉染細胞，或冷凍供以后使用。優選地，細胞是表達目的GPCR的真核細胞，例如酵母細胞，或培養的細胞系，例如哺乳動物細胞系，優選人細胞系。在功能上表達蛋白結合結構域和/或GPCR的優選細胞系包括昆蟲細胞(如SF-9)、人細胞系(如HEK293)、嚙齒動物細胞系(如CH0-K1)、駱駝細胞系(Dubca)。上文所述的蛋白結合結構域或復合體或細胞組合物可以用于多種環境和應用，這會在下文有進一步的詳細描述。GPCR的結晶及其結構解析包括GPCR在內的膜蛋白的結晶仍然是令人敬畏的挑戰。盡管出現了允許產生毫克數量的表達和純化方法，但是用這些分子實現穩定性可能是最難克服的障礙。純化必須通過去污劑增溶從脂質雙層釋放GPCR，這是用表面活性劑單體涂覆蛋白的疏水表面以形成蛋白-去污劑復合體(PDC)的過程。然而，在蛋白周圍所形成的去污劑帶是脂質雙層拙劣的取代物，因為喪失了周圍脂質施加于蛋白的許多側壓。因此，膜蛋白的溶解經常導致不穩定、解折疊以及隨后的聚集。除了視紫紅質外GPCR通常在去污劑中具有拙劣的穩定性，并且易于聚集和蛋白水解。完整膜蛋白的其他固有特性已經使晶體GPCR的努力受挫。GPCR的7個疏水跨膜螺旋為晶體接觸產生了拙劣的表面，并且細胞外和細胞內結構域經常是相對短的和/或拙劣結構化的。除了視紫紅質(在天然豐度和穩定性方面非典型GPCR)夕卜，從結合Fab片段的β 2AR獲得GPCR的第一晶體，所述Fab片段識別由連接TMs5和6的第三細胞內環的氨基和羧基末端構成的表位(Rasmussen, 2007)。在第二種方法中,第三細胞內環被T4溶菌酶取代(i32AR-T4L; Rosenbaum，2007)。最后，GPCR作為信號傳導分子的非凡多功能性可歸因于其韌性且動態的三維結構。遺憾的是，這類動態行為對于高分辨率結構分析而言特別富有挑戰性。生長衍射質量的晶體需要穩定的構象上均質的蛋白。因此，天然的未結合的GPCR的衍射質量的晶體難以獲得，并且即使實現這一目標時，晶體結構也僅僅代表了許多天然構象中的一種。通過使用蛋白結合結構域特別是是納米抗體作為穩定、純化以及結晶GPCR的具體構象狀態的工具，用于高分辨率結構分析，本發明解決了這些問題中的許多問題。因此，本發明的目標是，利用蛋白結合結構域作為穩定GPCR蛋白的工具，并進一步利用這些蛋白結合結構域作為GPCR共同結晶的輔助物，或換而言之，促進優選處于功能構象狀態的GPCR的晶體發生。因此，本發明的第四方面涉及本發明的蛋白結合結構域或在具體實施方案中包含蛋白結合結構域的復合體或提供蛋白結合結構域的細胞組合物的以下用途:穩定功能構象狀態、特別是活性構象狀態的GPCR ;和/或在GPCR中誘導具體構象(優選活性)構象狀態的形成。應當認識到，此類蛋白結合結構域是純化、結晶和/或解析功能構象狀態、特別是活性構象狀態的GPCR的非常有用的工具。如在上文所清楚概述的，應當明確的是，本發明的蛋白結合結構域用于純化、穩定、結晶和/或解析GPCR的結構，其可以針對任何期望的GPCR，并且可以特異性結合或識別任何期望的GPCR的功能構象狀態、優選活性構象狀態的構象表位。特別是，所述構象表位可以是任何期望的GPCR的部分細胞內或細胞外區域或膜內區域或結構域或環結構。首先，本發明的蛋白結合結構域可以增強去污劑增溶的受體的熱穩定性，穩定具體構象狀態，保護它們免于蛋白水解降解和/或聚集，并促進正確折疊的受體的均質樣品純化和濃縮。本領域普通技術人員應當認識到，這類樣品是用于產生衍射晶體的優選起始點。純化的受體的結晶是利用X-射線晶體學處理大分子結構的另一瓶頸。成功結晶需要形成核心以及它們隨后生長成合適大小的晶體。由于均質成核作用，晶體生長通常在超飽和溶液中同時發生。在典型的稀疏矩陣篩選實驗中可以結晶蛋白，其中對沉淀、添加劑以及蛋白濃度廣泛取樣，并且可以為具體蛋白確定適合成核和晶體生長的超飽和條件。在蛋白自身中產生結構變化，與稀疏矩陣篩選方法有關，例如通過添加結合蛋白的配體，或通過優先在靶蛋白的表面殘基中產生不同突變，或通過盡力結晶靶蛋白的不同種類直系同源物(Changl998)。本發明的一個意料不到的發現是蛋白結合結構域如納米抗體的用處，即其特異性結合GPCR，從而在結合后引入一定程度的結構變化，同時防止GPCR完全折疊。不同的納米抗體會產生不同的四級結構，從而為晶格形成提供新的不同界面，導致多晶體形成同時防止GPCR完全折疊。因為結晶涉及待組裝于晶格中的分子內構象熵的不利喪失，因此，降低靶標的構象熵同時仍然在溶液中的方法，應當通過降低晶格形成的凈熵罰來增強結晶的可能性。已經證明‘表面熵降低’方法是高效的(DereWenda2004)。同樣，結合伴侶，如離子、小分子配體以及肽，可以通過結合并穩定蛋白的子集構象狀態而降低構象異質性。盡管這類結合伴侶是有效的，但是并非所有蛋白都具有已知的結合伴侶，并且即使結合伴侶是已知的，其親和性、溶解性以及化學穩定性可能與結晶試驗不相容。因此，令人驚訝地發現，本發明的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，可以用作通過結合受體的具體構象最小化靶GPCR中的構象異質性而增大獲得井然有序的晶體概率的工具。用于高分辨率結構研究的GPCR結晶之所以特別困難，是因為這些膜蛋白的兩親表面。由于包埋于膜雙層中，蛋白與磷脂的酰基鏈的接觸位點是雙親的，而極性表明暴露于脂質的極性頭基，并暴露于水相。為了獲得井然有序的三維晶體一高分辨率X射線結構分析的先決條件一使GPCR在去污劑的幫助下增溶，并作為蛋白-去污劑復合體純化。去污劑去污劑膠束以帶樣方式覆蓋膜蛋白的疏水表明(Hunte and Michel2002;Ostermeier etal.1995)。GPCR-去污劑復合體形成三維晶體，其中，相鄰蛋白分子之間的接觸由從去污劑膠束突出的蛋白的極性表面產生(Day et al.2007)。顯然，去污劑膠束在晶格中需要空間。盡管膠束之間有吸引力的相互作用可能穩固晶體包裝(Rasmussen et al.2007;Dunnet al.1997)，但是這些相互作用不導致剛性晶體接觸。因為許多膜蛋白，包括GPCR，都含有相對小或高韌性親水結構域，因此增大獲得井然有序的晶體概率的策略是擴大蛋白的極性表面和/或降低它們的韌性。因此，本發明的納米抗體可以用于擴大蛋白的極性表面，從而補充可以在晶格分子之間促進直接接觸(primary contact)的蛋白表面的數量。本發明的納米抗體還可以降低其細胞外區域的韌性，從而生長井然有序的晶體。納米抗體特別適合這種目的，因為它們由單個剛性球狀結構域組成，并且缺少韌性連接區，這與常規抗體或其來源的片段如Fab不同。
在本發明的另一實施方案中，包含本發明的蛋白結合結構域和功能構象狀態、優選活性構象狀態的靶GPCR的復合體，可以利用用于膜蛋白的多種專門結晶方法中的任意方法結晶，所述方法中有許多方法在Caffrey(2003)中做了綜述。一般而言，所述方法是基于脂質的方法，其包括在結晶之前將脂質添加于GPCR納米抗體復合體。以前用這類方法結晶其他膜蛋白。這些方法，包括脂質立方相結晶方法和Bicelle結晶方法，其中有許多方法利用作為泡(泡-融合方法)、盤狀束膠(Bicelle方法)和脂質晶體或中間相(內消旋或立方相方法中)的脂質和去污劑的自發的自我組裝特性。脂質立方相結晶方法描述于例如:Landau et al.1996;Gouaux 1998; Rummel et al.1998 ;Nollert et al.2004,上述出版物通過援引并入，用于公開這些方法。Bicelle結晶方法描述于例如:Faham et al.2005;Fahamet al.2002，該出版物通過援引并入，用于公開這些方法。根據另一實施方案，本發明還包括上文所述的蛋白結合結構域解析GPCR的結構的用途。蛋白、特別是GPCR的結構，包括所述蛋白的一級結構、二級機構、三級結構以及若適用四級結構。本文所用的“解析結構”指測定蛋白的原子或原子坐標的排列，并經常通過諸如X-射線晶體學的生物物理學方法進行。在X-射線晶體學中，當適當組合時衍射數據給出了晶胞中分子電子密度的3D傅里葉變換。如果相是已知的，可以通過傅里葉綜合簡單獲得電子密度。對于蛋白復合體，當結構已知的蛋白的級分(研究模型)低(小于氨基酸含量的50%)和/或當晶體表現出有限的衍射質量時，僅由分子置換(MR)成功導出相信息是有問題的。盡管多重同晶置換(MIR)和MR定相的組合已經證明對于蛋白復合體是成功的(如Ostermeier et al.1995; Li etal.1997; Hunte et al.2000)，但是產生優良的重原子衍生物的要求幾乎總是個問題。在過去的十年中，通常利用硒代蛋氨酸(SeMet)并入(MAD或SAD)，用反常色散數據取代經典MIR方法(Hendricksonl991)。實際上，與MIR或基于模型的MR定相數據相比，利用Se-邊緣能量的反常實驗數據通常提供優越且偏愛性更少的相信息。本發明的一實施方案涉及納米抗體通過MR或MAD定相GPCR-納米抗體復合體的用途。納米抗體通常強烈表達并適合SeMet并入。通過僅在納米抗體中引入所有SeMet位點定相GPCR納米抗體避免了在GPCR中并入SeMet位點的需要。在許多情況下，獲得衍射質量晶體是解析其原子分辨率結構的主要障礙。因此，根據具體實施方案，上文所述的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，可以用于改善晶體的納米質量，以便可以解析GPCR蛋白晶體結構。對有助于指導GPCR藥物發現的結構信息有濃厚興趣。對于結構已經解析的GPCR，已經證明這些建模努力在電子藥物設計者所需的水平上是不精確的。用i32AR、P1AR以及A2A受體的非活性狀態結構，藥物化學家現在具有指導研發用于數個活性治療靶標的配體的實驗數據。然而，用于電子篩選的這些高分辨率結構的價值是有限的。利用P2AR晶體結構作為模板，最近的分子對接研究鑒定了 6個以9nM至4 μ M的親和性結合的新β 2AR配體；然而，每個化合物都表現出反向激動劑活性。除了結晶更多的GPCR外，必須研發獲得受體結構的方法，所述受體結合于不同類別的配體，包括激動劑、拮抗劑、變構調節劑和/或G蛋白。例如，激動劑結合的受體晶體可以提供GPCR活性狀態的三維表述。這些結構會有助于闡明連接配體結合和G蛋白相互作用位點的構象變化，并導致更準確的機械假說以及最終新療法。鑒于配體激活的GPCR固有的構象韌性和激動劑結合的受體表現出的更大的異質性，穩定這一狀態并不容易。這類努力可以從通過添加對受體的活性構象狀態具有特異性的蛋白結合結構域穩定激動劑結合的受體構象而獲益。特別適合的是，如本發明所提供的，表現出G蛋白樣行為并且表現出有關激動劑結合的合作特性的納米抗體(參見實施例部分)。因此，本發明還提供了測定功能構象狀態的GPCR的晶體結構的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供本發明的蛋白結合結構域、靶GPCR，以及任選存在的受體配體，和(ii)形成蛋白結合結構域、GPCR以及任選存在的受體配體的復合體，以及(iii)結晶步驟(ii)的所述復合體，從而形成晶體，其中測定功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR的晶體結構。所述測定晶體結構，可以通過諸如X-射線晶體學的生物物理學方法進行。所述方法還可以包括獲得晶體的原子坐標(如上文所限定)的步驟。
_7] 捕獲和/或純化功能構象狀態的GPCR還在另一實施方案中，本發明提供了通過利用任何上述蛋白結合結構域或包含此類蛋白結合結構域的復合體或細胞組合物捕獲和/或純化功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR的方法。根據本發明，捕獲和/或純化功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR，會允許隨后結晶、配體表征和化合物篩選、免疫等。在實踐上，這類方法和技術包括但不限于基于親和性的方法如親和層析、親和純化、免疫測定、蛋白檢測、免疫化學、表面展示等，并且是本領域技術人員熟知的。因此，在具體實施方案中，本發明涉及，本發明的蛋白結合結構域或如上文所述包含所述蛋白結構域的復合體或細胞組合物捕獲功能構象狀態的GPCR、優選捕獲活性構象狀態的GPCR的用途。任選地，但并非必需，如上文所述，捕獲功能構象狀態的GPCR可以包括捕獲與受體配體或一個或多個下游相互作用蛋白復合的功能構象狀態的GPCR。因此，本發明還提供了捕獲功能構象狀態的GPCR的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供本發明的蛋白結合結構域和靶GPCRJP(ii)形成蛋白結合結構域與GPCR的復合體，其中以功能構象狀態、優選活性構象狀態捕獲GPCR。更具體而言，本發明還考慮了捕獲功能構象狀態的GPCR的方法，所述方法包括以下步驟:(i)將含有多種構象狀態的GPCR的溶液應用于具有固定化的本發明的蛋白結合結構域的固相支持物，和(ii)形成蛋白結合結構域與GPCR的復合體，以及(iii)除去弱結合或未結合的分子，其中以功能構象狀態、優選活性構象狀態捕獲GPCR。應當認識到，任何上述方法都還可以包括純化蛋白結合結構域與功能構象狀態的GPCR的復合體的步驟。治療和i會斷應用傳統上，小分子用于研發針對GPCR的藥物，不但是因為制藥公司具有用這些小分子工作的歷史原因，而且更重要的是，由于家族IGPCR的結構限制，家族IGPCR在跨膜裂縫中具有配體結合位點(Nat Rev Drug Discov.(2004) The stateof GPCR research in2004.Nature Reviews Drug Discovery GPCR QuestionnaireParticipants3(7):575, 577-626)。由于這一原因，難以或不可能產生抗這種靶標類別的單克隆抗體。本發明的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，借助它們通過CDR環延伸到腔中結合的固有特性，可以解決這一特殊難題。因此，本發明的第五方面涉及包含治療有效量的本發明的蛋白結合結構域和至少一種藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。‘載體’或‘佐劑’、特別是‘藥學上可接受的載體’或‘藥學上可接受的佐劑’是本身不誘導對接受所述組合物的個體有害的抗體產生也不誘發保護的任何合適的賦形劑、稀釋劑、載體和/或佐劑。因此，藥學上可接受的載體是先天無毒性的且是非治療性的，并且它們是本領域技術人員已知的。合適的載體或佐劑通常包含包括于下述非詳盡清單中的一種或多種化合物:大的緩慢代謝的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物以及非活性病毒顆粒。作為非限制性實例，載體或佐劑可以是林格氏溶液、葡萄糖溶液或漢克溶液(Hank’s solution)。也可以使用非水性溶液,如不揮發油和油酸乙酯。優選的賦形劑是5%葡萄糖鹽水。賦形劑可以含有少量添加劑，如可以增強等滲性和化學穩定性的物質，包括緩沖劑和防腐劑。施用本發明的蛋白結合結構域或其藥物組合物，可以通過口服、吸入或胃腸外給藥的方式。在具體實施方案中，通過鞘內或腦室內給藥送遞蛋白結合結構域。可以單獨施用活性化合物，或優選將其配置成藥物組合物。有效治療表達所述蛋白結合結構域所識別的抗原的某些疾病或病癥的量，取決于常見因素，如正治療的病癥的屬性和嚴重性以及哺乳動物的重量。然而，單位劑量的范圍通常是0.1mg至lg、例如0.l-500mg、例如0.l_50mg或0.l_2mg蛋白結合結構域或其藥物組合物。單位劑量的給藥通常是一月一次，一周、兩周一次，一天一次或多次，例如一天2、3或4，更通常是一天1-3次。非常優選的是，蛋白結合結構域或其藥物組合物以單位劑量組合物的形式施用，例如單位劑量口服、胃腸外或吸入組合物的形式。這類組合物通過混合制備，合適地適合口服、吸入或胃腸外給藥，并且因此可以采用片劑、膠囊、口服液體制劑、粉劑、顆粒、錠劑、可復水粉劑、可注射或輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣霧劑形式。用于口服給藥的片劑和膠囊通常以單位劑量的形式存在，并且含有常規賦形劑，如結合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑以及濕潤劑。可以根據本領域公知的方法涂覆片劑。供使用的合適填充劑包括纖維素、甘露醇、乳糖以及其他相似試劑。合適的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮以及淀粉衍生物，如淀粉乙醇酸鹽。合適的潤滑劑包括例如硬脂酸鎂。合適的藥學上可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鹽。這些固體口服組合物可以通過混合、填充、壓片等常規方法制備。重復的混合操作可以用于利用大量填充劑在這些組合物中分布活性劑。當然，這類操作在本領域中是常見的。口服液體制劑可以采用以下形式:例如水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或酏齊U，或可以作為在使用前用水或其他合適的媒介重構的干產品呈現。這類液體制劑可以含有常見的添加劑，如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化的食用脂肪，乳化劑，如卵磷脂、山梨醇單硬脂酸酯或阿拉伯膠；非水性媒介(其可以包括食用油)，例如杏仁油，分餾椰子油，油酯，如丙三醇、丙二醇或乙醇的酯；防腐劑，例如甲基或丙基P-羥苯酸酯或山梨酸，并且如果需要，常見的調味劑或著色劑。口服制劑還可以包括常見的緩釋制劑，如具有腸溶衣的片劑或顆粒。優選地，為了給藥，將用于吸入的組合物作為噴霧器的鼻煙、去污劑或溶液或作為用于吸入的超細粉劑，單獨或與諸如乳糖的惰性載體組合呈遞到呼吸道。在這一情況下，活性化合物的顆粒所具有的合適直徑小于50微米、優選小于10微米，例如1-5微米，如2-5微米。有利的吸入劑量的范圍為0.05-2mg，例如0.05-0.5mg、0.1-1mg或0.5_2mg。對于胃腸外給藥，制備含有本發明的化合物和無菌媒介的流體單位劑量形式。可以將活性化合物懸浮或溶解，這取決于媒介和濃度。胃腸外溶液通常以下方式制備:將化合物溶解于媒介中、過濾滅菌、填充到合適的小瓶或安瓿中并密封。有利的是，也可以將諸如局部麻醉劑、防腐劑以及緩沖劑溶解于媒介中。為了增強穩定性，在填充到小瓶中后可以將組合物冷凍，并真空除去水。以基本上相同的方式制備胃腸外懸浮液，不同之處在于，將所述化合物懸浮于媒介中，而不是在懸浮于無菌媒介前通過暴露于環氧乙烷溶解并滅菌。有利的是，將表面活性劑或濕潤劑包括于組合物內，以促進活性化合物的均勻分布。如果合適，可以包括小量支氣管擴張劑，例如擬交感胺，如異丙腎上腺素、新異丙腎上腺素、柳丁氨醇、苯腎上腺素以及麻黃堿；黃嘌呤衍生物，如茶堿和氨茶堿，和皮質類固醇，如強的松龍，以及腎上腺刺激劑如ACTH。正如常規實踐，所述組合物通常會伴隨有書面或打印的有關醫療的使用說明。將蛋白結合結構域、特別是納米抗體送遞到細胞內，可以按針對肽、多肽和蛋白所述進行。如果抗原是細胞外的或是細胞結構域，則蛋白結合結構域可以通過結合該結構域而發揮其功能，不必需要細胞內送遞。如本文所述，本發明的蛋白結合結構域可以靶向目的GPCR的細胞內構象表位。為了在細胞內作為有效且安全的治療劑使用這些蛋白結合結構域，細胞內送遞可以通過本領域已知的蛋白轉導或送遞系統來增強。蛋白轉導結構域(PTDs)在藥物送遞領域已經引起了相當大興趣，因為其能跨生物膜轉移。PTD是相對短(1-35個氨基酸)的序列，其賦予與它們綴合、復合或融合的蛋白和其他大分子貨物這種表面轉移活性(Sawant and Torchilin2010)。例如，HIV來源的 TAT 肽(YGRKKRRQRRR)已經廣泛用于各種試劑的細胞內送遞，范圍從小分子到蛋白、肽、藥用納米載體系列以及顯像劑。可選地，受體介導的內吞機制也可以用于細胞內藥物送遞。例如，運鐵蛋白受體介導的內在化通路是有效的細胞吸收通路，其已經被開發用于藥物和蛋白的位點特異性送遞(Qian etal.2002)。這通過以化學方式將運鐵蛋白與治療藥物或蛋白綴合或以基因方式將治療肽或蛋白融合于運鐵蛋白的結構中而實現。天然存在的蛋白(離子結合蛋白運鐵蛋白)在藥物靶向這一領域非常有用，因為這些蛋白是生物可降解的、無毒并且是非免疫原性的。而且，它們可以實現位點特異性靶向，由于它們的大量受體存在于細胞表面。盡管如此，其他送遞系統包括但不限于基于多聚體和脂質體的送遞系統。本發明的蛋白結合結構域和包含其的組合物的功效，可以利用任何合適的體外測定、基于細胞的測定、體內測定和/或本身已知的動物模型或上述的任何組合來測試，這取決于所涉及的具體疾病或病癥。本發明的第六方面涉及上文所述的蛋白結合結構域或藥物組合物調節GPCR信號傳導活性的用途。本文所述的本發明的蛋白結合結構域可以結合GPCR，以便激活或增強受體信號傳導；或可選地以便降低或抑制受體信號傳導。本發明的蛋白結合結構域還可以以阻擋GPCR的組成性活性的方式結合GPCR。本發明的蛋白結合結構域還可以以介導變構調節的方式(如在變構位點結合GPCR)結合GPCR。以這種方式，本發明的蛋白結合結構域可以通過結合受體的不同區域(如在變構位點)而調節受體功能。例如參考George et al.(2002)、Kenakin (2002)和Rios et al.(2001)。本發明的蛋白結合結構域還可以以延長GPCR介導的信號傳導的持續時間或通過增強受體-配體親和性增強受體信號傳導的方式結合GPCR。此外，本發明的蛋白結合結構域還可以以抑制或增強GPCR功能同聚體或異聚體組裝的方式結合GPCR。在一具體實施方案中，上文所述的蛋白結合結構域或藥物組合物阻斷G蛋白介導的信號傳導。在另一實施方案中，本發明還考慮了上文所述的蛋白結合結構域或藥物組合物，其用于治療GPCR相關疾病如癌癥、自身免疫病、傳染病、神經病、心血管疾病。某些上文所述的蛋白結合結構域可以具有治療用途并且可以給予患有疾病狀況的個體，以便治療所述個體的疾病狀況。蛋白結合結構域的治療用途可以利用所述蛋白結合結構域結合的GPCR確定，因為通過所述GPCR的信號傳導與所述疾病狀況有關。在某些情況下，通過結合配體，GPCR可以在疾病狀況中激活。在其他實施方案中，例如可以突變GPCR，從而使得其具有組成性活性。可以使用主題蛋白結合結構域治療GPCR介導的疾病狀況，如精神分裂癥、偏頭痛、反流、哮喘、支氣管痙攣、前列腺肥大、潰瘍、癲癇、心絞痛、變態反應、鼻炎、癌癥如前列腺癌、青光眼以及中風。在線人類孟德爾遺傳學數據庫的其他實例性GPCR相關疾病狀況見于NCBI的萬維網。因此，本發明的具體實施方案還考慮了蛋白結合結構域或藥物組合物用于治療GPCR相關疾病或病癥的用途。在更具體的實施方案中，蛋白結合結構域可以結合β 2-腎上腺素能受體，在這種情況下，其可以用于治療需要釋放子宮或血管系統的平滑肌的疾病狀況。因此這種蛋白結合結構域可以用于預防或緩解妊娠早產疼或治療慢性或急性哮喘、蕁麻疹、牛皮癬、鼻炎、變應性結膜炎、痤瘡疹、枯草熱或肥大細胞增多癥，上述疾病狀況都與β 2-腎上腺素能受體有關。在這些實施方案中，蛋白結合結構域可以用作共治療劑，供與其他藥物聯合使用，所述其他藥物如抗炎藥、支氣管擴張藥或抗組胺藥物，特別是用于治療氣道阻塞性或炎性疾病，如上文提到的那些，例如作為這類藥物治療活性的增效劑，或作為降低這類藥物所需的劑量給藥或潛在副作用的手段。主題蛋白結合結構域可以與其他藥物一起混合于固定型藥物組合物中，或其可以在其他藥物之前、與其同時或在其之后單獨施用。一般而言，這些規程涉及施用患有GPCR相關疾病或病癥的個體有效量的調節GPCR的蛋白結合結構域，以調節宿主的GPCR并治療所述個體的病癥。在一些實施方案中，如果期望降低某一 GPCR活性，則可以施用降低GPCR活性的一種或多種化合物，而當期望增強某一 GPCR的活性時，可以施用增強GPCR活性的一種或多種化合物。根據主題方法，許多個體是可以治療的。通常這類個體是哺乳類或哺乳動物，其中這些術語廣泛用于描述哺乳類中的有機體，包括食肉動物目(如狗和貓)、嚙齒目(如小鼠、豚鼠以及大鼠)以及靈長目(如人、黑猩猩以及猴子)。在許多實施方案中，所述個體是人。通常對患有這類病癥的個體或對期望避免這類癥狀的個體實施主題治療方法。還根據另一實施方案，本發明的蛋白結合結構域或復合體還可以用于GPCR相關疾病的診斷或預后，如癌癥、自身免疫病、傳染病、神經病、心血管疾病。選擇性靶向功能構象狀態的GPCR的化合物的鑒定在化合物篩選、先導物優化以及藥物發現過程中，要求更快速、更有效、比較便宜且信息特別豐富的篩選測定，其同時提供各種化合物特征及其它們對各種細胞通路影響的信息(即功效、特異性、毒性以及藥物代謝)。因此，需要快速且廉價地篩選大量化合物，以便鑒定目的GPCR的新的特異性配體，優選構象特異性配體，所述配體可能是潛在的新的藥物候選者。本發明通過提供蛋白結合結構域解決了這一問題，所述蛋白結合結構域穩定和/或鎖定功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR，并隨后可以用作免疫原或選擇試劑，供在多種環境中篩選之用。本發明蛋白結合結構域的主要優勢在于，可以將GPCR保持于穩定的功能構象、優選活性狀態構象中。例如，選擇性結合受體的這種活性構象的文庫化合物具有較高的舉止像激動劑的傾向，因為GPCR活性狀態的正位或變構穩定誘發生物應答。另一優勢在于，蛋白結合結構域增強GPCR活性構象的熱穩定性，因此保護GPCR防止化合物篩選和藥物發現所用的非天然條件所誘發的不可逆變性或熱變性，而不需要依賴穩定性增強的突變GPCR。本發明的構象選擇性蛋白結合結構域的另一優勢在于，它們允許快速且可靠地篩選并區分GPCR和GPCR依賴性通路的受體激動劑、反向激動劑、拮抗劑和/或調節劑以及抑制劑，從而增大鑒定具有期望的藥理特性的配體的可能性。為了進一步說明這一點，一個完全確定的概念是，當與G蛋白復合時，大多數GPCR都表現出較高的激動劑結合親和性。這歸因于激動劑占據的受體與G蛋白之間的協同相互作用(Delean et al.1980)。本發明的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，能穩定GPCR的活性構象狀態(并因此表現出G蛋白樣行為)，并使非活性構象狀態不穩定，從而增強GPCR對激動劑的親和性而降低對反向激動劑或拮抗劑的親和性。結果是，識別GPCR活性功能構象的本發明的蛋白結合結構域，如納米抗體，可有效地用于高通量篩選測定中，用來篩選激動齊U，因為相對于反向激動劑或拮抗劑它們增強受體對激動劑的親和性。穩定GPCR非活性狀態構象的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，會相互增強對反向激動劑或拮抗劑的親和性，并降低對激動劑的親和性。這類蛋白結合結構域可以例如用于篩選反向激動劑。因此蛋白結合結構域、特別是納米抗體，其識別具體具體功能構象狀態從而以互惠方式調節對激動劑和反向激動劑的親和性，形成了本發明的一部分。因此，根據優選的實施方案，本發明包括上文所述的蛋白結合結構域或復合體或細胞組合物在篩選和/或鑒定GPCR的構象特異性結合伴侶程序中的用途，這最終可能導致潛在的新藥物候選者。根據一實施方案，本發明考慮了鑒定能選擇性結合GPCR的功能構象狀態的化合物的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供本發明的GPCR和能特異性結合所述GPCR的功能構象狀態的蛋白結合結構域,和(ii)提供測試化合物，和(iii)評估測試化合物是否結合功能構象狀態的GPCR，以及(iv)選擇特異性結合功能構象狀態的GPCR的化合物。優選地，上述方法還包括形成復合體的步驟，所述復合體包含所述蛋白結合結構域和功能構象狀態、更優選活性構象狀態的GPCR。
因此，本發明還考慮了鑒定能特異性結合功能構象狀態的GPCR的化合物的方法，所述方法包括以下步驟:⑴提供包含本發明的蛋白結合結構域和功能構象狀態的GPCR的復合體，和(ii)提供測試化合物，和(iii)評估測試化合物是否結合功能構象狀態的GPCR，以及(iv)選擇結合功能構象狀態的GPCR的化合物。優選地，任一上述方法所用的蛋白結合結構域能在結合后穩定和/或誘導GPCR的功能構象狀態。優選地，所述GPCR的功能構象狀態選自基礎構象狀態或活性構象狀態或非活性構象狀態(如上文所限定)。最優選地，所述GPCR的功能構象狀態是活性構象狀態。在一其他優選的實施方案中，任一上述篩選方法所用的蛋白結合結構域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4個構架區和3個互補決定區或其任何合適的片段。優選地，所述蛋白結合結構域來源于駱駝抗體。更優選地，所述蛋白結合結構域包含納米抗體序列或其任何合適的片段。特別是，所述納米抗體包含選自SEQ ID NO: 1-29的序列或其任何合適的片段。對于蛋白結合結構域和/或復合體的他優選選擇，如上文針對本發明的第一方面和第二方面所限定。在優選的實施方案中，提供了任一上述篩選方法所用的蛋白結合結構域、GPCR或包含蛋白結合結構域和GPCR的復合體，作為全細胞或細胞(細胞器)提取物如膜提取物或其組分，或可將它們并入脂質層或泡(包含天然和/或合成脂質)、高密度脂質粒或任何納米顆粒如納米盤，或作為VLP提供，以便保留各自蛋白充分的功能性。由膜片段或膜去污劑提取物形成的GPCR的制劑在Cooper (2004)中詳細做了綜述，其在此通過援引并入。可選地，GPCR和/或復合體還可以溶解于去污劑中。溶解的受體制劑的非限制性實例還進一步提供于實施例部分這中。高通量篩選構象特異性結合伴侶的靶GPCR是優選的。將本發明的蛋白結合結構域、功能構象狀態的GPCR或包含它們的復合體固定化于可以排列或多路復用的合適的固體表面或固相支持物，會促進這一點。合適的固相支持物的非限制性實例包括珠、柱、芯片或平板。更具體而言，固相支持物可以是顆粒(如通常用于提取柱中的珠或顆粒)或采用薄片形式(如膜或濾器，玻璃或塑料載玻片，微量滴定測定板、試紙、毛細管填充裝置等)，所述薄片可以是平的、打褶的或中空纖維或管。給出下述基材作為實例，并非限制這類實例可以包括娃石(多孔無定形娃石)，即即Biotage (Dyax Corp.的分支)供應的FLASH系列的含有60A不規則硅石的盒(32-63um或35_70um)，瓊脂糖或聚丙烯酰胺支持物，例如Amersham Pharmacia Biotech 供應的 S印harose 系列產品或Bio-Rad供應的 Aff i_GeI 支持物。另外，存在大孔多聚體，如Bio-Rad供應的壓力穩定的Aff1-Prep支持物。可以使用的其他支持物包括葡萄糖、膠原蛋白、聚苯乙烯、甲基丙烯酸酯、藻酸鈣、可控孔徑玻璃、鋁、鈦和多孔陶瓷。可選地，固體表面可以包含部分質量依賴性傳感器，例如表面等離子共振檢測器。商業上可獲得的支持物的其他實例討論于例如Protein Immobilisation, R.F.Taylored.., Marcel Dekker, Inc., New York, (1991)中。固定可以是非共價的或共價的。特別是，根據技術人員已知的標準技術，將本發明的蛋白結合結構域、GPCR或包含所述蛋白結合結構域和所述GPCR的復合體非共價固定或吸附于固體表面，可以通過用任何抗體或鏈霉親和素或親和素或金屬離子涂覆的表面發生，從而識別連接于所述蛋白結合結構域或GPCR的分子標簽(如生物素標簽、組氨酸標簽
坐')
寸/ ο特別是，本發明的蛋白結合結構域、GPCR或包含所述蛋白結合結構域和所述GPCR的復合體，可以通過共價交聯，利用常規偶聯化學，連接于固體表面。固體表面可以天然包含適合共價連接的可交聯殘基，或其可以根據本領域熟知的方法經涂覆或衍生而引入合適的可交聯基團。在一具體實施方案中，在通過不含有化學間隔臂的反應部分直接共價偶聯于期望的基材后，可以保持固定的蛋白的充分功能。有關將抗體(片段)固定化于固相支持物上的方法的其他實例和更詳細信息，討論于Jung et al.(2008);同樣，膜受體固定方法的綜述見于Cooper (2004);在此將兩者通過援引并入。分子生物學的進展，特別是通過定點誘變，能突變蛋白序列中的特定氨基酸殘基。將特定氨基酸(在具有已知的或推斷的結構的蛋白中)突變成賴氨酸或半胱氨酸(或其他期望的氨基酸)，例如，可以為共價偶聯提供特定位點。還有可能的是，再改造特定蛋白以改變參與化學偶聯的表面可用氨基酸的分布(Kallwass et al，1993)，從而有效控制或定位偶聯的蛋白。可以將相似方法應用于本發明的蛋白結合結構域以及構象穩定的GPCR，無論其是否包含在復合體中，從而提供定向固定的手段，而無需添加含有天然或非天然氨基酸的其他肽尾或結構域。在抗體或抗體片段如納米抗體的情況下，優選在構架區中引入突變，從而使對抗體(片段)抗原結合活性的破壞最小。便利的是，根據本領域常見的標準方法，通過將本發明的固定的蛋白與測試樣品接觸，可以將所述固定的蛋白用于諸如免疫測定的免疫吸附過程，例如ELISA，或免疫親和純化過程中。可選地，并且特別是對于高通量目的而言，固定的蛋白可以是排列的或多路復用的。優選地，本發明的固定的蛋白可以用于篩選和選擇特異性結合功能構象狀態的GPCR、特別是活性構象狀態的GPCR的化合物。應當認識到，可以固定蛋白結合結構域或功能構象狀態的GPCR或包含所述蛋白結合結構域和所述GPCR的復合體，這取決于應用的類型或需要進行的篩選類型。同樣，選擇GPCR穩定蛋白結合結構域(靶向GPCR的具體構象表位)，會決定GPCR的定向，并因此決定期望的化合物鑒定結果，如特異性結合所述構象穩定的GPCR的細胞外部分、膜內部分或細胞內部分的化合物。在可選的實施方案中，可以將測試化合物(或測試化合物文庫)固定化于固體表面，如芯片表面，而將蛋白結合結構域、GPCR或復合體提供于例如去污劑溶液中或膜樣制劑中。最優選地，蛋白結合結構域、GPCR、測試化合物都是不固定的，例如在溶液噬菌體展示選擇方案中或在放射性配體結合測定中。可以用各種方法測定固定的GPCR與測試化合物之間的結合，包括例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、表面等離子共振測定、基于芯片的測定、免疫熒光細胞、酵母雙雜交技術以及卩遼菌體展示，和是本領域的常規實踐，例如在Sambrook et al.(2001), MolecularCloning,A Laboratory Manual.Third Edition.Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY中。檢測測試化合物與GPCR之間結合的其他方法包括用離子噴霧質譜/HPLC方法或其他(生物)物理和分析方法進行超濾。例如，也可以使用本領域技術人員熟知的熒光能量共振轉移(FRET)方法。應當認識到，結合的測試化合物可以利用與所述化合物結合的獨特標記或標簽來檢測，所述標記或標簽如肽標記、核酸標記、化學標記、突光標記或射頻標簽，如本文進一步所述。除了建立與功能構象狀態的GPCR的結合，還期望測定化合物對GPCR的功能影響。特別是，本文所述的蛋白結合結構域或復合體或細胞組合物可以用于篩選調節(增強或降低)GPCR的生物學活性的化合物。期望的生物學活性調節會取決于所選的GPCR。待測試的化合物可以是任何小化學化合物或大分子，如蛋白、糖、核酸或脂質。通常，測試化合物會是小化學化合物、肽、抗體或其片段。應當認識到，在有些情況下，優選高通量篩選測試化合物，并且可以利用上文所述的方法作為“庫篩選”方法，其是本領域技術人員熟知的術語。因此測試化合物可以是測試化合物文庫。特別是，治療化合物，如激動劑、拮抗劑或反向激動劑和/或調節劑的高通量篩選測定，形成了本發明的一部分。出于高通量目的，可以使用化合物文庫，如變構化合物文庫、肽文庫、抗體文庫、基于片段的文庫、合成化合物文庫、天然化合物文庫、噬菌體展示文庫等。制備和篩選這類文庫的方法，在本領域中是已知的。在一優選的實施方案中，高通量篩選方法涉及提供含有大量潛在治療配體的組合化學品或肽文庫。隨后如本文所述，在一個或多個測定中篩選這類“組合文庫”或“化合物文庫”，以鑒定展示了期望的特征活性的文庫成員(具體化學種類或亞類)。“化合物文庫”是通常最后用于高通量篩選的儲存的化學品集合。“組合文庫”通過組合物許多化學“構件”如試劑、利用化學合成或生物合成所產生的多種化學化合物的集合。制備和篩選組合文庫，是本領域技術人員熟知的。由此鑒定的化合物可以作為常規的“先導化合物”或自身可以用作潛在的或實際治療劑。因此，在一深一層的實施方案中，如上文所述的篩選方法還包括，修飾已經證明結合功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR的測試化合物，并確定所述修飾的測試化合物當存在于具體構象中時是否結合GPCR。在具體實施方案中，提供測試化合物作為生物樣品。特別是，樣品可以是采集自個體的任何合適樣品。例如，樣品可以是體液樣品如血樣、血清、血漿、脊髓液。可選地，樣品是組織或細胞提取物。所述化合物可以結合靶GPCR，導致GPCR的生物功能、特別是下游受體信號傳導受到調節(激活或抑制)。GPCR信號傳導的這種調節，可以正位或變構發生。所述化合物可以結合靶GPCR，以便激活或增強受體信號傳導；或可選地以便降低或抑制受體信號傳導。所述化合物還可以以阻擋GPCR的組成性活性的方式結合靶GPCR。所述化合物還可以以介導變構調節(如在變構位點結合GPCR)的方式結合靶復合體。以這種方式，所述化合物可以通過結合GPCR的不同區域(如在變構位點)調節受體功能。例如參考George etal.(2002), Kenakin (2002)和Rios et al.(2001)。本發明的化合物還可以以延長GPCR介導的信號傳導的持續時間或以通過增強受體-配體親和性增強受體信號傳導的方式結合靶GPCR。此外，所述化合物還可以以抑制或增強GPCR功能同聚體或異聚體組裝的方式結合靶復合體。在一實施方案中，確定所述化合物是否改變了 GPCR與受體配體(如上文所限定)的結合。GPCR與其配體的結合可以利用本文所述本領域已知的標準配體結合方法測定。例如，配體可以是放射性標記的或熒光記的。可以對全細胞或或對從細胞獲得的膜或水溶解的受體用去污劑進行所述測定。所述化合物的特征是，其能改變標記的配體的結合(還參見實施例部分)。所述化合物降低GPCR與其配體之間的結合，或可以將GPCR與其配體之間的結合提高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍。因此，根據更具體的實施方案，任何上述篩選方法所用的復合體還包含受體配體。優選地，受體配體選自小分子、多肽、抗體或其來源的任何片段、天然產物等。更優選地，受體配體是上文所述的完全激動劑或部分激動劑或反向激動劑或拮抗劑。根據具體實施方案，本發明的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，還可以用于先導化合物鑒定(lead identification)和肽模擬物設計。利用生物相關肽或蛋白結構作為用于先導化合物鑒定的起始點，代表了現代藥物發現的最有效的方法之一。肽模擬物是這樣的化合物，其基本要素(藥效團)在3D空間中模擬天然肽或蛋白，并且其保留了與生物靶標相互作用并產生相同的生物作業的能力。設計肽模擬物，從而避免一些與天然肽有關的問題:例如針對蛋白水解的穩定性(活性持續時間)和拙劣的生物利用率。某些其他特性，如受體選擇性或能力，經常可以獲得實質改善。作為非限制性實例，本發明的納米抗體可以與長⑶R環結合，深入受體的核心，以發揮生物作用。納米抗體-GPCR復合體中這些臺以及它們的伴隨結構可以用作先導化合物鑒定和肽模擬物設計的起始點。因此，本發明的蛋白結合結構域，特別是納米抗體，可以用于篩選測定。用于藥物發現的篩選測定可以是固相或液相測定，如結合測定，如放射性配體結合測定。在高通量測定中，以96-、384-或1536-孔模式，一天篩選高達數百個不同的調節劑或配體是可能的。例如，微量滴定版的每一個孔都可以用于針對所選的潛在調節劑運行單獨的測定，或如果要觀察弄多或孵育時間影響，則每5-10個孔可以測試單個調節劑。因此單個標準微量滴定版可以測定約96個調節劑。每天測定許多平板是可能的；現今，用于高達約6.000,20.000、50.000或更多不同化合物的測定篩選是可能的。此外，本發明的蛋白結合結構域，如納米抗體，還可以用于基于細胞的測定。基于細胞的測定對于評價新生物靶標的作用機制和化學化合物的生物學活性也是關鍵的。目前用于GPCR的基于細胞 的測定包括，測量通路激活(Ca2+釋放、cAMP產生或轉錄活性)；用6 標記GPCR和下游元件，測量蛋白運輸；以及利用F0rster共振能量轉移(FRET)、生物發光共振能量轉移(BRET)或酵母雙雜交方法，直接測量蛋白之間的相互作用。通過本領域熟知且常用的任何方式，在細胞內，將本發明的蛋白結合結構域、特別是納米抗體引入所述細胞的相關區域(compartment)(細胞內或細胞外)可以產生新的或更好的基于細胞的測定。特別是，需要使其天然激活配體還未得到鑒定的GPCR “去孤兒化(de-orphanise) ”。利用本發明的蛋白結合結構域穩定功能構象狀態的GPCR,能使在天然配體未知的情況下用于鑒定“孤兒”GPCR的配體的篩選方法成為可能。孤兒GPCR的配體可以從生物樣品中鑒定，如血樣或組織提取物，或從配體文庫中鑒定。例如，已經采用了各種“去孤兒化”方法，包括針對已知配體家族的陣列-測定。可以利用本身已知的任何合適的體外測定、基于細胞的測定、體內測定和/或動物模型或上述的任何組合，測試化合物和/或包含其的組合物的功效，這取決于所涉及的具體疾病或病癥。因此，在一具體實施方案中，因此提供了用于任何上述篩選方法的固相支持物，所述支持物固定有本發明的蛋白結合結構域和/或包含本發明的蛋白結合結構域和功能構象狀態的GPCR的復合體。在一實施方案中，任何上述篩選方法所用的測試化合物選自上文所限定的多肽、肽、小分子、天然產物、肽模擬物、核酸、脂質、脂質肽、碳水化合物、抗體或其來源的任何片段如Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fv(dsFv)和包含VL或VH結構域的片段、重鏈抗體(hcAb)、單結構域抗體(sdAb)、微型抗體、來源于駱駝重鏈抗體的可變結構域(VHH或納米抗體)、來源于鯊魚抗體的新抗原受體的可變結構域(VNAR)、蛋白支架，包括α體、蛋白Α、蛋白G，設計的錨蛋白-重復結構域(DARPins)、纖連蛋白III型重復、抗運載蛋白、打結素、工程化CH2結構域(納米抗體)。測試化合物可以任選地共價或非共價連接于可檢測標記。合適的可檢測標記及其連接、使用和檢測技術，對技術人員而言是清楚的，并包括但不限于光譜、光化學、生化、免疫化學、電氣、光學或化學手段可檢測的任何組合物。有用的標記包括磁珠(如免疫磁珠(dynabead))、突光染料(如所有Alexa Fluor染料、突光素異硫氰酸鹽、德克薩斯紅、若丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性標記(如3H、1251、35S、14C或32P)、酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)以及比色標記，如膠體金或有色玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。檢測這類標記的方式是本領域技術人員熟知的。因此，例如，可以利用感光膠片或閃爍計算器檢測放射性標記，熒光標記可以利用光檢測器檢測發射的照度來檢測。酶標記通常通過以下方式檢測:提供酶與底物，并檢測酶在底物上的作用所產生的反應產物，而比色標記可以通過使有色標記可視而檢測。其他合適的可檢測標記更早地描述于本發明有關蛋白結合結構域的第一方面的內容中。在優選的實施方案中，測試化合物是上文所述的抗體或其來源的任何片段，包括納米抗體。例如但并非限制目的，測試化合物可以是針對包含本發明的蛋白結合結構域和功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR(包括變體，如上文所述)的復合體而產生的抗體(如本文以其最廣泛的含義所限定)。體內產生抗體的方法是本領域已知的。優選地，以與本文以前所述相似的方式(在存在受體配體的情況下，用GPCR進行免疫；還參見實施例部分)，在存在功能構象狀態穩定的蛋白結合結構域、更優選活性狀態穩定的蛋白結合結構域的情況下，用GPCR免疫動物。本發明還涉及用于選擇對功能構象狀態、優選活性構象狀態的GPCR具有特異性的抗體的方法涉及，篩選編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫，所述基因在細菌、酵母、絲狀噬菌體、核糖體或核糖體亞基或其他展示系統中在含有GPCR和穩定GPCR的功能構象狀態的蛋白結合結構域的復合體內表達。本發明的第七方面涉及包含本發明的蛋白結合結構域或本發明的復合體或本發明的細胞組合。所述試劑盒還包含試劑的組合，如緩沖液、分子標簽、構建體、參照樣品材料以及何時的固相支持物。這類試劑盒可以用于本文所述的本發明的任何應用。例如，所述試劑盒可以包含可用于化合物篩選應用的測試化合物(文庫)。最后，本發明的最后一個方面是，用途任何本發明的蛋白結合結構域分離負責特異性結合GPCR的功能構象狀態、特別是GPCR活性構象狀態的構象表位的氨基酸序列，并基于所述氨基酸序列構建人工蛋白結合結構域。應當認識到，本發明的蛋白結合結構域、構架區以及互補決定區是已知的，并且結合GPCR的功能構象狀態、特別是GPCR的活性構象狀態的相同構象表位的蛋白結合結構域衍生物的研究，會允許推導出參與結合所述構象表位的必需氨基酸。所述知識可以用于構建最小蛋白結合結構域，并產生其衍生物，這可以利用本領域技術人員已知的技術常規進行。下述實施例意圖促進對本發明的進一步了解。盡管參考說明性實施方案對本發明進行了描述，但是應當理解到，本發明并不限于此。具有本領域普通技術并且接觸所述教導的人應當認識本發明范圍內的其他修飾和實施方案。因此，本發明僅受本文所附的權利要求的限制。
實施例穩定人I^AR的功能構象狀態的蛋白結合結構域實施例1.免疫、文庫構建以及最初篩選為了體內獲得成熟的針對i32AR的納米抗體，用在Gly365(i32AR_365)處截短的重組β 2AR免疫美洲騎(無峰駱騎(Llama glama)),以排除對羧基末端的免疫應答。將i32AR-365在昆蟲細胞中表達，并按以前所述(Day et al, 2007)重構抗原。施用重構的截短激動劑結合受體6周后，從免疫的美洲駝的血液分離淋巴細胞，并如實施例的材料和方法中所述，制備并篩選噬菌體文庫(見下文)。兩次篩選鑒定了識別天然32AR而不是變性受體的構象納米抗體。實施例2.利用ELISA選擇構象特異性納米抗體在第一次篩選中，我們在ELISA中比較納米抗體對天然和熱變性β 2AR抗原的結合。對于每一抗體，用含有激動劑結合的β 2AR_365的磷脂泡涂覆一個孔(0.1 μ g蛋白/孔)。結下來，將這種平板在80° C下孵育2hr (小時)。接著，在不加熱的情況下，用含有激動劑結合的β 2AR-365的磷脂泡涂覆同一平板的另一孔(0，I μ g蛋白/孔)。所有納米抗體都能選擇性結合天然受體，而不結合熱失活的受體，這表明16種粘合劑識別構象表位。實施例3.利用斑點印跡選擇構象特異性納米抗體在下一篩選中，相比天然反向激動劑結合的受體、SDS變性的受體，我們利用斑點印跡分析，比較納米抗體對天然激動劑結合的P2AR受體的特異性。所述篩選鑒定了 16種不同的構象納米抗體，其識別天然激動劑結合的i32AR-365，但不識別反向激動劑或熱變性受體(圖2(斑點印跡))。實施例4.選擇具有G蛋白樣行為的納米抗體最初的篩選鑒定了 16種識別天然激動劑結合的β 2AR、但不識別變性受體的克隆。我們的下一目是，鑒定具有G蛋白樣行為的納米抗體。β 2AR優選與Gs偶聯，并且激動劑結合增強G蛋白相互作用。而且，在存在Gs的情況下，P2AR以較高的親和性結合激動劑。因此，我們(1)利用尺寸排阻層析研究了激動劑對結合P2AR的納米抗體的影響，(2)在膜中納米抗體對β Ar激動劑結合親和性的影響，以及⑶納米抗體對構象變化的影響，這可以通過環境敏感的mono-bromo bimane (mBBr)突光團監測。實施例5.具有G蛋白樣行為的納米抗體特異性結合純化的激動劑結合的受體在存在穩定非活性構象的激動劑或反向激動劑的情況下，將純化的納米抗體與純化的去污劑增溶的P2AR受體一起孵育。隨后利用基于大小分離蛋白的尺寸排阻層析(SEC)分析混合物。在存在激動劑且不存在反向激動劑的情況下，僅7種納米抗體結合i32AR，并且作為復合體在SEC上遷移(實施例顯示于圖1A、圖3以及圖4中)。剩余的納米抗體不以足夠高的親和性結合，以改變β 2AR在SEC上的移動性。
實施例6.具有G蛋白樣行為的納米抗體增強β 2AR對激動劑的親和性當與G蛋白復合時，許多GPCR都表現出較高的激動劑結合親和性。這歸因于激動劑占據的受體與G蛋白之間的協同相互作用。我們的SEC實驗提供了 7種納米抗體優先結合激動劑占據的P2AR并因此可以以與G蛋白Gs相似的方式穩定活性狀態的證據。在存在和不存在這7種納米抗體的情況下，進行激動劑競爭結合實驗。在存在納米抗體65、67、69、71、72、80以及84的情況下，P2AR對激動劑(異丙腎上腺素)的親和性增強了 2_30倍(圖1B和表I)。相比之下，NbSO并不增強i32AR或β 2AR - T4L對反向激動劑IC1-118、551 (ICI)的親和性(圖15)。實施例7.Nb80和G蛋白在TM6的細胞質結構域處誘導相似的構象改變最近視蛋白的晶體結構以及對視紫紅質(Park et al.2008)和β 2AR(Yao etal.2009)的生物物理研究表明，跨膜節段6 (TM6)的細胞質端，在激動劑結合后經歷了需要G蛋白偶聯的構象變化。為了研究納米抗體對TM6細胞質結構域運動的影響，我們用mono-bromo bimane在C265處標記純化的β 2AR(mBB- β 2AR)。我們以前證明，激動劑結合和G蛋白偶聯兩者都誘導與TM6的向外運動相容的mBB-132AR的熒光變化(Yao et al.2008)，這正如在視蛋白晶體結構中所觀察的(Park et al.2008)。在mBB-β 2AR中，添加激動劑與G蛋白，導致比單獨的激動劑或G蛋白大的熒光變化。這與在激動劑競爭結合測定中所觀察到的協同相互作用一致(Yao et al.2009) 0同樣，在添加僅激動劑異丙腎上腺素或僅Nb80的情況下，在mBB-β 2AR中觀察到熒光的相對小的變化；然而，當一起添加激動劑和納米抗體時，觀察到更大的變化(圖1C)。觀察了納米抗體65、67、69、71、72以及84的可比較的結果(圖5)。實施例8.納米抗體穩定的^2AR活性狀態的表征我們隨后比較NbSO與Gs對β 2AR結構和激動劑結合親和性的影響。用m__brom。bimane在TM6細胞質端在C265處標記β 2AR，并將其重構到HDL顆粒中。在激動劑激活后，TM6相對于TM3和TM5移動(圖6A)，并且我們以前已經證明，共價連接于C265的Bimane周圍的環境隨著激動劑結合和G蛋白偶聯而改變，從而導致Bimane強度降低和λ _的紅移(Yaoet al.2009)。Bimane熒光的變化與TM6的運動一致，這與在視紫紅質中通過DEER光譜和在低PH視蛋白的結構中所觀察的相似。如圖6B所示，兒茶酚胺激動劑異丙腎上腺素和Gs都穩定活性樣構象，但是Gs的影響在存在異丙腎上腺素的情況下更大，這與激動劑和Gs對^2AR結構的協同相互作用一致。單獨的Nb80對無配體的β 2AR的Bimane熒光和λ _具有影響，這與Gs的相似(圖6C)。在結合反向激動劑IC1-118，551的β 2AR中并未觀察到這種影響。在存在10 μ M異丙腎上腺素時，NbSO的影響增強。這些結果表明，NbSO不識別β 2AR的非活性構象，但是有效結合激動劑占據的β 2AR，并產生不能與在存在Gs和異丙腎上腺素時所觀察的Bimane熒光區分的Bimane熒光。圖6D和6E表示Gs和Nb80對β 2AR的激動劑親和性的影響。將β 2AR重構到HDL顆粒中，并在不存在或存在Nb80和Gs的情況下進行激動劑競爭結合實驗。在不存在任一種蛋白的情況下，異丙腎上腺素的抑制常數(Ki)為107nM。在存在Gs的情況下，觀察到兩種親和狀態，因為并不是所有P2AR都與Gs偶聯。在Gs偶聯的狀態下，異丙腎上腺素的親和性增加了 100倍(Ki=l.07nM)(圖6D和表4)。同樣，在存在Nb80的情況下，異丙腎上腺素的親和性增加了 95倍(Ki=l.13nM)(圖6E和表4)。這些結合數據表明，NbSO穩定WT β 2AR的構象，其與Gs穩定的非常相似，從而激動劑和Gs結合的有力偶聯被Nb80忠實地模擬。用i32AR_T4L融合蛋白，獲得β 2AR非活性狀態的高分辨率結構。我們以前證明，32八1^1禮比11^41 對異丙腎上腺素(Rosenbaum et al.2007)具有更高的親和性。然而在存在Nb80的情況下，親和性增加了 60倍，從而導致與結合Nb80的WT β 2AR的親和性可比較的親和性(Ki=0.56nM)(圖6F和表4)。盡管由于T4L所致的空間位阻我們未能研究β 2AR-T4L中的G蛋白偶聯，但是結果表明，T4L不防止Nb80的結合，并且在存在Nb80的情況下，對結合野生型β 2AR和β 2AR-T4L的激動劑的相同的Ki值表明，Nb80在這兩種蛋白中穩定相似的構象。實施例9.納米抗體促進激動劑結合的β 2AR的結晶最初利用兩種不同的方法使結合反向激動劑卡拉洛爾的P2AR結晶。第一種晶體由結合Fab片斷的β 2AR獲得，所述Fab片段識別由連接TMs5和6的第三細胞內環的氨基或羧基末端構成的表位(Rasmussen et al.2007)。在第二種方法中，第三細胞內環被T4溶菌酶取代(β 2AR_T4L) (Rosenbaum et al.2007)。使β 2AR_Fab復合體和結合不同激動劑的32AR-T4L結晶的努力，未能產生用于結構測定的充分質量的晶體。我們因此試圖使與Nb80復合的激動劑結合的β 2AR和β 2AR_T4L結晶。盡管在脂質Bicelle和脂質立方相(LCP)中獲得兩種復合體的晶體，但是從在LCP中生長的β 2AR-T4L-Nb80的晶體，獲得高分辨率衍射。這些晶體于pH8.0下生長于39_44%PEG400、IOOmM Tris、4%DMS0 以及 1%1，2，3-heptanetriol 中。實 施例10.Nb80有助于β 2AR在晶格中的包裝從生長于LCP的β 2AR-T4L-Nb80獲得高分辨率衍射。這些晶體于pH8.0生長于39-44%PEG400、IOOmM Tris、4%DMS0 以及 1%1，2，3-heptanetriol 中。由23個晶體于3.5 A獲得一組合并的數據(表5)。利用卡拉洛爾結合的β 2AR和納米抗體作為研究模型，通過分子取代系解析結構。圖7表示β 2AR-T4L-Nb80復合體在晶格中的包裝。Nb80結合P2AR的細胞質端，并且，第三互補決定區(OTR)環突出到受體的核心。P2AR納米抗體復合體以脂質雙層近似平行于晶體的be平面的方式排列。雙面對稱相關納米抗體分子沿a軸相互作用，從而在該方向產生緊密包裝的晶格。在雙層內，受體分子以反平行排列的方式相互作用，并且一個P2AR分子的TM1、2、3以及4靠著相鄰分子的TM4和5包裝。沿著b軸在平行晶格鄰居的螺旋8與TM5之間，和在TMl的細胞外部分與第三反平行鄰居TM6的細胞質端之間，進行接觸。沿著c軸，包裝最弱，這可能部分歸因于T4L與相鄰受體和/或納米抗體分子的非特異性相互作用。不存在可解釋的T4L電子密度，但是考慮到TM5和TM6的可視末端，T4L的位置受到高度限制。推測T4L相對于受體采用許多定向和可能由于其鉸鏈運動而導致的一系列內部構象(Zhang et al.1995)，所述內部構象最終平均了其密度。然而，T4L可能有助于晶體的結構，因為我們不能在這些條件下產生天然β 2AR-納米抗體復合體的晶體，盡管可能的是，在天然受體中連接TM5和TM6的韌性環，防止晶格形成。實施例11.β 2AR的納米抗體穩定的活性狀態的結構圖8比較了非活性β 2AR結構(來自卡拉洛爾結合的β 2AR-T4L結構)與β 2AR的活性狀態。在受體的細胞質面，發現了最大差異，同時在P2AR-T4L-Nb80復合體中，相對于非活性結構，TM5和TM6向外位移且TM7和TM3向內運動(圖8A、B)。在細胞外表面，變化相對較小(圖8C)。TM3與TM4之間的第二細胞內環(ICL2)采用兩輪α螺旋，這與在火雞^1AR結構中所觀察到的相似(Warne et al.2008)。這種螺旋在非活性β 2AR結構中不存在，可能反映了有關ICL2的晶格接觸。圖9A-C更詳細地顯示了 Nb80與β 2AR的細胞質側的相互作用。⑶R3的8氨基酸序列刺入TM節段3、5、6以及7的氨基酸所形成的疏水口袋。⑶Rl的4氨基酸序列提供了與TM節段5和6的其他穩定相互作用。圖9D比較了 β 2AR活性和非活性構象的細胞質表面。在視蛋白中，⑶R3占據的位置與轉導蛋白的羧基末端肽相似(Scheerer et al.2008)(圖10)。Nb80與P2AR之間的大多數相互作用都受疏水接觸的介導。當比較活性和非活性結構時，在TM6中觀察到最大變化，在Glu2686 3°(離子鎖的一部分)(在該形式中上標表示保守的GPCR殘基的Ballesteros - Weinstein編號(Ballesteros and Wei nsteinl995)處具有11.4.A的軸運動(圖9D)。這一大變化由居于保守Pro2886 5°之前的轉角中TM6的小的順時針旋轉而實現，所述順時針旋轉是由脯氨酸處主鏈氫鍵的中斷和Phe2826 44的重新包裝(參見下文)從而使螺旋向外旋轉而造成。活性β 2AR-T4L-Nb80相對于非活性的卡拉洛爾結合的β 2AR_T4L的變化，與在視紫紅質和視蛋白之間觀察到的變化非常相似(Scheerer et al.2008;Park et al.2008)(圖9E，圖10)。高度保守的Argl313 5°與Asp/Glul3 0 3 49之間的離子鎖中的鹽橋斷裂。在視蛋白中，Argl353 5°與TM5的Tyr2235 58和轉導蛋白肽的主鏈羰基相互作用。P2AR的Argl313.50同樣與Nb80的CDR3的主鏈羰基相互作用。然而，Nb80妨礙了 Argl313 5°與Tyr2195.58之間的相互作用，即使酪氨酸占據了視蛋白和β 2AR_T4L_Nb80活性構象中的相似位置。與在視蛋白中一樣，高度保守的NPxxY序列的Tyr3267 53運動到非活性狀態的TM6所占據的空間中。在非活性的卡拉洛爾結合的i32AR-T4L中，我們觀察到涉及TM1、2、6以及7中高度保守的氨基酸和數個水分子的氫鍵相互作用的網絡(Rosenbaum et al.2007)。盡管β 2AR-T4L-Nb80的分辨率不足以檢測水，但是顯然，我們觀察到的結構變化會實質上改變這種網絡。與在β 2AR-T4L_Nb80的細胞質結構域所觀察到的相對大的變化相比，激動劑結合口袋中的變化相當小。Trp6 48在家族A GPCRs中高度保守，并且認為其旋轉異構體狀態在GPCR激活中發揮作用(旋轉異構體切換開關)(Shi et al.2002)。我們在TM6中的Trp2866.48的側鏈旋轉異構體中未觀察到變化，Trp2866.48位于配體結合口袋的底部附近，盡管其位置由于附近殘基Ilel213 4°和Phe2826 44的重排而稍微移位。盡管在激活視紫紅質后，存在Trp6 48環境變化的光譜證據(Ahuja et al.2009)，但是在視紫紅質和低pH視蛋白的晶體結構中，并未觀察到旋轉異構體變化。此外，最近有關組胺受體的誘變實驗證明，Trp6_48不是血清素激活5HT4受體所需的(Pellissier et al.2009)。有意思的是，推測激動劑結合口袋周圍的小變化如何與促進Nb80和Gs結合的TMs5、6以及7的細胞質區域中大得多的結構變化偶聯。圖11顯示了潛在的構象連接。激動劑相互作用可以穩定活性受體構象，其包括相對于非活性結構，2075_46位置處的TM5向內運動2.1 A和保守的Pro2115 5°向內運動1.4 A。在非活性狀態，Pro2115.50、Ilel213.40、Phe2826.44以及Asn3 1 8 7 45之間的相互作用穩定TM5、TM3、TM6以及TM7的相對位置。在活性狀態中觀察到的Pro2115 5°的位置與這種相互作用的網絡不一致，并且Ilel213 4°和Phe2826 44被重新定位，同時TM6圍繞Phe2826 44旋轉，這導致TM6的細胞質端向外運動。
盡管在P2AR-T4L_Nb80復合體的細胞質結構域中所觀察到的一些結構變化是由與Nb80的特異性相互作用引起的，但是，Nb80和Gs在β 2AR中誘導或穩定相似的結構變化這一事實表明，Nb80和Gs識別相似的激動劑穩定的構象，所述變化可以由熒光光譜和激動劑結合親和性測定。視紫紅質和P2AR的細胞質結構域在激活后經歷相似的結構變化，這一觀察結果進一步提供了支持，即激動劑結合的β 2AR-T4L-Nb80代表活性構象并且與G蛋白激活的保守機制一致。然而，激動劑誘導或穩定這些構象變化的機制可能因不同的配體和不同的GPCR而不同。視紫紅質與P2AR的構象平衡的不同，如以下事實所證明，即視紫紅質在缺少G蛋白的情況下可以采用完全的活性構象而P2AR不能這樣。因此，激活能量和構象取樣在不同GPCR之間可以不同，這可能引起這些配體所展示的配體功效的多樣性。激動劑僅需要破壞穩定非活性狀態所需的一個關鍵的分子內相互作用，因為組成性受體活性可以來自GPCR不同區域氨基酸的單個突變(Parnot et al.2002)。因此，激動劑或突變破壞這些穩定相互作用，降低了分割非活性和活性狀態的能障，并增大受體可以與G蛋白相互作用的可能性。總之，上述這些結果表明能產生識別和穩定GPCR的激動劑結合的狀態的納米抗體。在β 2AR的情況下，這種納米抗體穩定的狀態在功能上與G蛋白Gs穩定的狀態相似。最后，納米抗體促進衍射質量的晶體的形成。現在將這種方法應用于其他GPCR和其他膜蛋白。實施例12.Nb80穩定腎上腺素能受體家族成員的活性構象狀態與相關受體交叉反應的激活狀態穩定納米抗體，可以用作穩定那些相關受體構象狀態的工具。為了說明這一原理，我們分析NbSO是否選擇性結合人P1AR受體的活性構象。@#1 和P2AR是密切相關的腎上腺素能受體。利用PISA服務器(Krissinel&Henrick, 2007)，并基于 Nb80_P 2AR 復合體的晶體結構，鑒定了與 β 2AR-Nb80界面中的Nb80相互作用的30個i32AR AA殘基在。氨基酸序列比對(圖17)表明，參與Nb80相互作用的這30個殘基中有28個殘基在P1AR和P2AR中是保守的。剩余的界面殘基是i32AR中的賴氨酸，并且已經被對應于保守取代的PlAR中的精氨酸取代(如圖17中灰色框所示)。因此，看起來兩種受體共享非常相似的NbSO的結合位點。基于這一分析，我們還測量了 Nb80對激動劑異丙腎上腺素和反向激動劑CGP20712A(圖18)的P1AR親和性的影響。對于β 2AR, Nb80也誘導異丙腎上腺素對β ,AR親和性的增強(圖18，圖版A和C)。Nb80不改變拮抗劑CGP20712A的親和性(圖18，圖版D)，這證明Nb80選擇性穩定β 的活性狀態構象。在不相關受體，如多巴胺Dl受體匯總觀察到NbSO的這種作用(數據未顯示)O實施例13.β 2AR活性狀態穩定納米抗體是改善激動劑篩選的極好工具當與G蛋白復合時，許多GPCR都表現出更高的激動劑結合親和性。這歸因于激動劑占據的受體與G蛋白之間的協同相互作用。具有G蛋白樣行為的納米抗體，可能增強i32AR對激動劑的親和性 (參閱實施例6)。這種行為在新激動劑發現中具有重要影響。例如，與拮抗劑相比，具有G蛋白樣行為的Nbs可以增強GPCR對激動劑的表觀親和性。當篩選針對這類GPCR-Nb復合體的化合物文庫時,這可能引起搜索中(among the hits)的激動劑偏愛性。為了評估這種方法的實用性，我們在競爭性放射性配體結合實驗中分析了 P2AR活性狀態穩定納米抗體Nb80對P2AR與數個熟知的P2AR配體的相互作用的影響(參見材料和方法)。測試了 10種激動劑和5種拮抗劑:㈠異丙腎上腺素HCl (激動劑)、(-)-阿普洛爾(拮抗劑)、柳丁氨醇(部分激動劑)、ICI118551 (反向激動劑)、卡維地洛(拮抗劑)、CGP12177A(拮抗劑)、昔萘酸沙美特羅(完全激動劑)、特布他林半硫酸鹽(部分激動劑)、鹽酸多巴酚丁胺(部分激動劑)、奧西那林半硫酸鹽(激動劑)、鹽酸丙卡特羅(激動劑)、鹽酸芐羥麻黃堿(激動劑)、氫溴酸非諾特羅(完全激動劑)、富馬酸福莫特羅二水化物(formoterol fumarate dehydrate,激動劑)以及馬來酸噻嗎洛爾鹽(timolol maleatesal,拮抗劑)，所有都通過Sigma Aldrich購買。在存在和不存在500nM Nb80的情況下，對含有全長人β 2AR的商業膜，進行配體競爭結合實驗。用3H-二氫阿普洛爾(DHA)作為競爭性放射性配體。配體競爭結合實驗的代表性實例顯示于圖16中。對于所有化合物而言，在存在過量Nb80的情況下獲得IC50值，并將其與在存在不相關納米抗體的情況下獲得的IC50值(陰性對照)進行比較(表6)。與實施例6、8以及12 —致，我們觀察到，當β 2AR與Nb80復合時，所有激動劑的潛能增加。未觀察到拮抗劑或反向激動劑的這一作用。實施例14.利用β 2AR活性狀態穩定納米抗體進行化合物文庫篩選在旨在鑒定針對具體構象即所謂“藥物可控制的”靶構象的化合物的篩選測定中，鎖定所述具體構象的GPCR具有優于利用非構象穩定的靶標(代表構象庫)的優勢。構象選擇性NbSO允許使用野生型受體，因此使優于定點誘變所致的人工構象變化的潛在風險最小化。為了證明NbSO是否促進鑒定選擇性結合活性構象的β 2AR的配體，利用放射性配體結合測定，對由約1500個不同的低分子量化合物(<300Da)組成的片段文庫進行激動劑篩選。對于這個測定，將含有全長β 2AR的膜與NbSO或不相關Nb (陰性對照)一起預孵育，并添加于含有文庫化合物和2nM3H- 二氫阿普洛爾(DHA)放射性配體的96孔板(參見材料和方法)。文庫化合物，與含有不相關納米抗體的樣品相比，其明顯取代含有與Nb80復合的β 2AR的樣品中放射性配體，是是優先結合受體的活性構象的化合物。選擇性結合受體的活性構象的文庫化合物，具有行為如同激動劑的高傾向性，因為GPCR活性構象的正位或變構穩定誘發生物應答。所選的文庫化合物必須通過G蛋白偶聯、下游信號傳導事件或生理輸出進行測量而進一步篩選其激動作用。實施例15:用納米抗體熱穩定β 2AR受體對膜本體蛋白的結合和功能研究，已經受到它們在去污劑中不穩定性的阻礙。盡管出現了允許產生毫克數量的表達和純化方法，但是用這些分子實現穩定性，或許是最難以克服的障礙。純化必須通過去污劑增溶從脂質雙層釋放膜蛋白，這是蛋白的疏水表面涂覆表面活性劑單體從而形成蛋白-去污劑復合體的過程。然而，在蛋白周圍形成的去污劑帶，是脂質雙層的拙劣取代物。因此，膜蛋白的溶解經常導致去穩定、解折疊以及隨后聚集。通過定點誘變可以實現膜蛋白的熱穩定(Zhou&Bowie, 2000;Magnini et al.，2008)。在此，我們證明，構象選擇性納米抗體的結合代表了用于去污劑增溶的GPCR的熱穩定的創新可選方案。利用熒光熱穩定測定(圖13)和尺寸排阻層析(圖14)，分析構象選擇性納米抗體對i32AR受體熱穩定性和隨后聚集的影響。對于這些實驗，將重組P2AR表達于Sf9昆蟲細胞，溶解于1%十二烷基麥芽糖苷、IOOmM NaCl、20mM Hepes pH7.5和蛋白酶抑制劑中，并通過MlFLAG親和性層析進行純化(參見實施例的材料和方法)。突光熱穩定性測定利用硫醇特異性突光染料N-[4_ (7_ 二乙氨基_4_甲基_3_香豆素基)苯基]馬來酰亞胺(CPM)測量包埋于蛋白內部作為膜蛋白折疊狀態整體完整性的傳感器的天然半胱氨酸的化學反應性(Alexandrov et al.，2008)。對于突光熱穩定性測定，將去污劑增溶的受體(在0.1%十二烷基麥芽糖苷、IOOmM NaCl以及20mM Hepes pH7.5中)與異丙腎上腺素(10 μ M)在存在或不存在2:1摩爾過量Nb80的情況下于RT(室溫)下預孵育lh。隨后將樣品與CPM熒光團混合，于10° C-94° C溫度下孵育2min (分鐘)，并收集熒光發射。實驗一式三份進行，并導致與獲得的GPCR APJ的穩定性譜相似的熔解曲線(Alexandrov et al.，2008)。解折疊轉變可以由簡單雙態模型來描述,包括代表熔解曲線下限和上限的天然(折疊)狀態和變性狀態。激動劑結合受體的熔解曲線與與NbSO復合的激動劑結合受體的熔解曲線的比較表明，納米抗體通過將激動劑結合受體的解鏈溫度(Tm)提聞12° C而穩定的活性構象。我們還通過尺寸排阻層析(SEC)分析了 NbSO對激動劑結合的受體的熱解折疊和聚集的影響。對于該實驗，將十二烷基麥芽糖苷增溶的受體與異丙腎上腺素(ΙΟμΜ)儀器在存在或不存在2:1摩爾過量Nb80的情況下于RT預孵育45分鐘。接下來，在溫度增加的情況下將樣品孵育10分鐘，并隨后通過SEC分析(圖14)。不同層析的比較表明，NbSO保護激動劑結合的受體避免溫度誘發的聚集。蛋白結合結構域穩定大鼠血■管'緊張素IIla型受體(ATlaR)的功能構象狀態實施例16.免疫、文庫構建以及初始篩選為了體內獲得成熟的抗大鼠ATlaR納米抗體，將兩個美洲駝(無峰駱駝)用在Lys318之后截短以排除針對羧基末端的免疫應答的重組ATlaR-T4溶菌酶(T4L)融合物免疫。在昆蟲細胞中表達ATlaR(Shluka et al.2006)，并按以前所述，將抗原重構于脂質泡(Day et al, 2007 )中。一個美洲駝用血管緊張素(無偏愛激動劑)結合受體免疫，一個美洲駝用結合于受體的抑制蛋白偏愛性配體TRV023 (Violin et al.2010)免疫。在施用重構的、截短的激動劑結合的受體6周后，從免疫的美洲駝的血液分離淋巴細胞，并按實施例的材料和方法所述，制備和篩選噬菌體文庫。固相ELISA鑒定了識別ATla受體的納米抗體。實施例17.利用ELISA選擇構象特異性納米抗體在第一此篩選中，我們在ELISA中比較了純化的納米抗體在天然和熱變性大鼠ATlaR抗原上的結合。對于每一納米抗體，用受體涂覆一個孔。接下來將這個平板于80° C孵育2hr。隨后，用受體涂覆同一平板的另一空孔，但不加熱。能選擇性結合天然受體但不結合熱失活的受體的納米抗體識別構象表位。實施例18.通過斑點印跡選擇構象狀態特異性納米抗體在下一篩選中，我們利用斑點印跡分析比較了與拮抗劑結合的受體相比將構象表位結合于激動劑結合的ATlaR受體的納米抗體的結合。與拮抗劑結合的(非活性狀態)的受體相比，這種篩選鑒定了選擇性識別激動劑結合的(活性狀態)的受體的構象的納米抗體。實施例19.篩選選擇性穩定受體的活性構象的ATlaR納米抗體除了用于ATlaR特異性的結合測定(ELISA)夕卜，在與實施例6、12和13所述的放射性配體測定相似的放射性配體競爭實驗中，評估純化的納米抗體。增強ATlaR對激動劑親和性的納米抗體被認為穩定受體的活性構象。蛋白結合結構域穩定大鼠M3毒蕈堿受體的功能構象狀態實施例20.免疫、文庫構建以及初始篩選為了體內獲得成熟的抗大鼠M3R的納米抗體，將美洲駝(無峰駱駝)用在N和C末端位點截短以排除針對末端的免疫應答的重組M3R-T4溶菌酶(M3R-T4L)融合物免疫。在M3R-T4L中，第三細胞內環被T4溶菌酶替代。在昆蟲細胞中表達M3R-T4L，并按以前所述，重構抗原(Day et al, 2007) 在施用重構的拮抗劑(噻托溴銨)結合的受體6周后，從免疫的美洲駝的血液分離淋巴細胞，并入實施例的材料和方法所述，制備并篩選噬菌體文庫。實施例21.利用ELISA選擇構象特異性納米抗體在第一次篩選中，我們在ELISA中比較純化的納米抗體在天然和熱變性大鼠M3R抗原上的結合。對于每一納米抗體，用受體涂覆每一孔。接下來，將該平板于80° C下孵育2hr。隨后，用受體涂覆同一平板的另空孔，但不加熱。能選擇性結合天然受體但不結合熱失活的受體的納米抗體識別構象表位。實施例22.利用斑點印跡選擇構象狀態特異性納米抗體在下一篩選中，我們利用斑點印跡分析比較了與拮抗劑結合的受體相比將構象表位結合于激動劑結合的M3受體的納米抗體的結合。與拮抗劑結合的(非活性狀態)受體相比，該篩選鑒定了選擇性識別激動劑結合的(活性狀態)受體的構象的納米抗體。實施例23.篩選選擇性穩定受體的活性構象的M3R納米抗體。除了用于M3R特異性的結合測定(ELISA)之外，在與實施例6、12和13所述的放射性配體測定相似的放射 性配體競爭實驗中，評估純化的納米抗體。增強M3R對激動劑親和性的納米抗體被認為穩定受體的活性構象。實施例的材料和方法β 2AR 制備在氨基酸365之后截短的i32AR(i32AR_365)具有氨基末端Flag表位標簽，按以前所述(Kobilkal995)，將其在Sf9昆蟲細胞中表達并通過順序Ml抗體和阿普洛爾親和層析純化。將純化的 β 2AR_365 固定化于 Flag 柱(Sigma)上，并用 5mg/ml DOPC (Avanti PolarLipids)與 0.5mg/ml 脂質 A(Sigma)在 l%(w/v)辛基葡糖苷(Anatrace) > IOOmM NaCl、20mMHepes pH7.5、2mMCaC12以及I μ M激動劑(如異丙腎上腺素)中的10柱體積的混合物平衡。隨后在含有EDTA的相同緩沖液中洗脫i32AR。將洗脫的P2AR的濃度調整到5mg/ml。這經常涉及用相同的緩沖液稀釋蛋白，但是偶爾需要用Amicon超濾單元(IOOkDa孔)將蛋白濃縮高達2倍。然后于4° C用含有I μ M激動劑的磷酸緩沖鹽水透析蛋白，以除去去污齊U。在用于免疫前，將重構的蛋白儲存于-80° C。ATlaR 制備將在第三環中具有Τ4溶菌酶的ATlaR在氨基酸318之后截短(ATlaR-318)。這種構建體具有氨基末端Flag表位標簽和10個組氨酸的C末端標簽。在Tni昆蟲細胞中表達ATlaR-318，并于室溫下在20mM Hepes, pH7.4UM NaCl和0.5%MNG中溶解2h。利用順序 N1-NTA 和 FLAG-M1 抗體親和層析純化受體。在 5mg/ml DOPC (Avanti Polar Lipids)與 0.5mg/ml 脂質 A(Sigma)在 l%(w/v)辛基葡糖苷(Anatrace) >IOOmM NaCl、20mM HepespH7.5以及100 μ M激動劑(如血管緊張素II)的混合物中重構純化的ATlaR。將洗脫的AtlaR的濃度調整至l_2mg/ml。隨后于4° C用含有100 μ M激動劑的磷酸緩沖鹽水透析蛋白，以除去去污劑。在用于免疫前，將重構的蛋白儲存于-80° C。M3受體制備在存在I μ M阿托品的情況下，在Sf9昆蟲細胞中表達具有氨基末端FLAG表位標簽和羰基末端六聚組氨酸標簽的M3毒蕈堿受體(Vasudevan et al.1995)。受體的細胞內環3或者缺失(M3RA i3)或者被T4溶菌酶取代(M3R-T4L)。離心細胞，隨后通過滲透休克裂解，并將蛋白溶解于1%十二烷基麥芽糖苷、0.1%膽固醇半琥珀酸酯、750mM氯化鈉、20mMHEPES pH7.5中。然后利用鎳親和層析、隨后FLAG親和層析純化溶解的受體。接著利用尺寸排阻層析分離純化的蛋白，以選擇按所述(Day et al, 2007)重構的單體受體。抗β 2AR的納米抗體的選擇單個美洲駝接受6周的重構截短的β 2AR給藥。從免疫的美洲駝的血液分離淋巴細胞，并從這些細胞制備總RNA。利用RT-PCR擴增納米抗體庫的編碼序列，并將其克隆到曬菌體展示載體pMES4(genbank GQ907248) (Conrath et al.2001)中。通過在土涂覆了重構的β 2AR-365受體的Maxisorp (Nunc) 96孔平板上進行體外選擇，富集β 2AR特異性卩遼菌體。用三乙胺pHll從抗原涂覆的孔回收抗原結合的噬菌體，并用Tris-HCl pH7或通過添加新鮮生長的TG1E.col細胞中和。在兩輪生物淘篩后，隨機挑選96個個體菌落，并在TGl細胞的周質中產生納米抗體作為可溶的HIS標記的蛋白。固相ELISA鑒定了識別天然激動劑結合的P2AR-365但不結合熱變性的受體的16個不同的構象納米抗體。抗ATlaR的納米抗體的選擇一個單個美洲駝接受6周結合激動劑血管緊張素的重構的ATlaR-318給藥。另一單個美洲駝接受6周結合偏愛性激動劑TRV023的ATlaR-318給藥。在免疫后，從每一美洲駝的單獨血液分離淋巴細胞。從這些細胞制備總RNA。利用RT-PCR從每一樣品擴增納米抗體庫的編碼序列，并將其單獨克隆(Conrath et al.2001)到曬菌體展示載體pMESy4_載體中，從而產生2個獨立的文庫。pMESy4是攜帶C末端His6標簽、隨后是氨基酸EPEA的pMES4 (genbank GQ907248)的衍生物(De Genst et al.2010.J.Mol.Biol402:326-343)。通過在Maxisorp (Nunc) 96孔板上進行體外選擇，富集ATlaR特異性曬菌體,所述96孔板涂覆了分別結合血管緊張素或TRV023的重構的、截短的ATlaR受體(重組受體的變體，但沒有T4L插入)。利用胰蛋白酶消化，從抗原涂覆的孔回收抗原結合的噬菌體。在兩輪生物淘篩后，隨機挑選92個個體菌落(46位于ATlaR-血管緊張素上，46位于ATlaR-TRV023上)，并在TGl細胞的周至中產生納米抗體，作為可溶的HisIS-EPEA-標記的蛋白。抗M3R的納米抗體的選擇一個單個美洲駝接受6周結合拮抗劑噻托溴銨的重構的、截短的M3R-T4L給藥。在免疫后，從所述美洲駝的血液分離淋巴細胞，并從這些細胞制備總RNA。利用RT-PCR擴增納米抗體庫的編碼序列，并將其克隆(Conrath et al.2001)到曬菌體展示載體pMESy4_載體中。為了富集M3R特異性噬菌體，在存在激動劑卡巴膽堿或拮抗劑奎寧環基苯甲酸(QNB)的情況下，利用不同形式的抗原，進行不同的體外選擇策略。抗原形式包括攜帶大鼠M3RAi3受體(即在第三細胞內環中具有缺失的M3受體)、含有M3R(Perkin Elmer)的人CHO細胞的膜、重組重構的M3R-T4L或重組重構的M3RA i3的病毒樣顆粒(VLPs)。任選地，利用涂覆于Maxisorp (Nunc) 96孔板上的麥胚凝集素，捕獲攜帶大鼠M3R Λ i3受體或人M3R膜的VLP。利用胰蛋白酶消化，從抗原涂覆的孔回收抗原結合的噬菌體。可選地，利用過量拮抗劑，洗脫選擇于激動劑結合的抗原上的噬菌體，反之亦然。在兩輪生物淘篩之后，隨機挑選180個菌落，并在TGl細胞的周質中產生納米抗體，作為可溶的His-EPEA標記的蛋白。在M3R-T4L受體上，與ATlaR_T4L受體相比，可比較的固相ELISA產生66個M3R特異性納米抗體。用于生化表征的納米抗體純化在WK6E.coli細胞質中，表達HIS-標記的或HIS-EPEA標記的納米抗體。使周質提取物在硫酸鎳(II)快流速瓊脂糖(GE Healthcare)上進行固定的金屬親和層析。在IOOmMMES pH6.5、100mM NaCl緩沖液中，過夜透析IMAC蛋白級分。通過陽離子交換層析(具有Mono S10/100GL柱的ΑΚΤΑ FPLC )，進一步純化透析的納米抗體。尺寸排阻層析在缺少或存在40 μ M納米抗體的情況下，于RT下將20 μ M激動劑或反向激動劑(卡拉洛爾)結合的i32AR-365N孵育Ihr后，利用尺寸排阻層析鑒定激動劑選擇性納米抗體。在存在I μ M各自配體的情況下，利用具有Superdex20010/300GL柱的AKTAFPLC，在 0.l%DDM、20mM HEPES pH7.5、100mM NaCl 中，進行層析。在來自昆蟲細胞的膜制劑中，配體結合于截短的P2AR受體在缺少或存在I μ M納米抗體的情況下，于RT、在含有0.5ηΜ[3Η] - 二氫阿普洛爾和濃度范圍為IO-11M至KT4M的(-)_異丙腎上腺素的結合緩沖液(75mM Tris ρΗ7.5,12.5mMMgCl2UmM EDTA、0.05%BSA 和 10 μ MGTP γ S)中，對表達于 Sf9 昆蟲細胞膜中的 P2AR_365 進行90min競爭結合實驗。利用Br andel采集機,在Whatman GF/B濾器上,分離結合的放射性配體與未結合的放射性配體。數據是一式三份進行的兩個獨立實驗的平均值土S.E.。Bimane 突光使純化的β 2AR與在IOOmM NaCl、20mM HEPES、pH7.5，0.1%十二烷基麥芽糖苷中的1:1當量的mono-bromo bimane (mBBr, Invitrogen)反應，并在冰上避光孵育過夜。通過在用相同緩沖液平衡的脫鹽柱上進行凝膠過濾，在使用前，適當純化熒光團標記的受體。在Spex FluoroMax-3分光突光計(Jobin Yvon Inc, NJ)上，以光子計數模式,利用4nm的激發和發射帶通，進行熒光光譜實驗。在25° C進行所有實驗。對于發射掃描，將激發設定在370nm，并且以ls/nm的積分時間，測量由430_530nm的發射。為了測定納米抗體和配體的作用，將3個個體標記蛋白樣品與I μΜ納米抗體或10 μ M異丙腎上腺素或兩者一起孵育。孵育I小時后，采集樣品的發射光譜。在所有實驗中，針對來自緩沖液和配體的背景熒光，校正熒光強度。數據是一式三份進行的兩個獨立實驗的平均值土S.E.。制備用于晶體學的β 2AR_T4L和納米抗體-80在感染了 β 2AR_T4L桿狀病毒的Sf-9昆蟲細胞培養物中表達β 2AR_T4L，并根據以前所述方法(Kobilkal995)使其溶解。在阿普洛爾-瓊脂糖層析(Kobilkal995)之前和之后，通過MlFLAG親和層析(Sigma)獲得功能蛋白。在第二 Ml層析步驟中，用受體結合的阿普洛爾交換高親和性激動劑，并用十二烷基麥芽糖苷交換MNG-3兩親物，用于增強受體穩定性(Chae and Gellman,未發表)。在 IOmM HEPES pH7.5、100mM NaCl、0.02%MNG_3 以及10 μ M激動劑中洗脫激動劑結合的和去污劑交換的β 2AR-T4L，隨后通過用PNGaseF(NEB)處理除去N-連接的糖基化。用IOOkDa分子量截止Vivaspin濃縮器(Vivascience),將蛋白濃縮為約50mg/ml。在用IPGT誘導后，在大腸桿菌菌株WK6的周質中表達攜帶C末端His6標簽的的納米抗體-80 (Nb80)。在含有0.1%葡萄糖、2mM MgCl2以及50 μ g/ml氨芐青霉素的TB培養基中，于37° C，將0.6L的培養物生長至0D_=0.7。于28° C將誘導的培養物生長過夜。通過離心收獲細胞，并在冰冷緩沖液(50mM Tris pH8.0、12.5mM EDTA以及0.125M蔗糖)中裂解，隨后離心，以除去細胞碎片。利用鎳親和層析純化Nb80、用緩沖液(IOmM HEPES pH7.5、IOOmM NaCl)透析并旋轉離心至約120mg/ml。結晶將激動劑結合的β 2AR-T4L和納米抗體(如Nb80)以1: 1.2摩爾比混合，于RT孵育2小時后，與含有10%膽固醇(C8667，Sigma)的液化的單油酸甘油酯(M7765，Sigma)以 1:1.5 蛋白與脂質比(w/w)，利用 Martin Caffrey (Caffrey and Cherezov2009)所發明的雙注射器混合方法混合。最初的結晶先導(crystallization lead)利用內部篩選鑒定，并在24孔玻璃夾心平板中利用50nL蛋白:脂質小滴優化，所述小滴手動送遞、在每一孔中用0.8μ I沉淀溶液覆蓋并用玻璃蓋片密封。利用0.8μ I在Mill1-Q水中稀釋 2-4 倍的儲備溶液(reservoir solution, 36-44%PEG400UOOmM Tris ρΗ8.0、4%DMS0、l%l，2，3-h印tanetriol)，通過懸滴蒸汽擴散，于20° C生長用于數據收集的晶體。在7-10天，晶體生長至實際大小。以儲備溶液作為冷凍保護劑，將晶體閃凍并儲存于液氮中。微觀結晶學數據收集和處理以先進光子源(Advanced Photon Source)的光束線23-1D,利用10 μ m直徑光束，測量衍射數據。用低劑量的1.0°旋轉圖像定位并集中用于數據收集的晶體。以1.0°的框、通常為5-10秒的曝光時間、5x的衰減光束，測量數據。在發射明顯的輻射損傷前，僅能測量5-10°的數據。整合數據，并以HKL2000包進行標定(Otwinowski 1997)。結構解析和精化(refinement) 用Phaser程序(McCoy2007)，獲得分子取代相。研究模型為I)高分辨率卡拉洛爾結合的P2AR結構，PDB id2RHl，但是除去了 T4L和所有的水、配體和脂質分子)和納米抗體(PDB id3DWT，除去了水分子)，作為研究模型。在放置β 2AR模型后，旋轉和平移函數Z得分為8.7和9.0，隨后放置的納米抗體模型的旋轉和平移函數Z得分為3.5和11.5。利用組B因素模型，一個B用于主鏈原子，一個B用于側鏈原子，在Phenix (Afonine2005)和Buster (Blanc2004)中精化模型。表5給出了精化統計。不管強各向異性如何(表5)，對于側鏈的布局而言，電子密度都是清楚的。配體結合于在HDL顆粒中重構的截短的P2AR受體在競爭結合實驗中，比較Nb80和Gs對激動劑的受體親和性的影響。根據以前公開的方法(Whorton et al.2007),在高密度脂蛋白(HDL)顆粒中重構按以前所述(Rosenbaumet al.2007; Rasmussen et al.2007)純化的 β 2AR 和 β 2AR_T4L (兩者都在位置 365 處截短)，然后將Gs重構到含有β 2AR的HDL顆粒中。用0.6nM[3H] - 二氫阿普洛爾(3H-DHA)作為放射性配體，并用濃度為10_12-10_4M的(-)_異丙腎上腺素(ISO)作為競爭劑。使用IyM的 Nb80。使用 10 μ M 的 GTP Y S。使用含有 0.1%BSA 的 TBS (50mM Tris ρΗ7.4，150mM NaCl)作為結合緩沖液。通過穿過Whatman GF/B濾器(預浸于具有0.3%聚乙烯亞胺的TBS中)，在Brandel采集機上分離結合的3H-DHA與未結合的3H-DHA,并在冷TBS中洗滌。在BeckmanLS6000閃爍計數器中測量放射性配體結合。利用GraphPad Prism軟件，由飽和結合曲線，測定DHA的配體結合(Kd)。利用公式Ki=IC50/(1+[L]/Kd)，由IC50值，測定ISO的結合親和性(Ki值，在表4中制成表)。配體結合于在來自昆蟲細胞的膜提取物中的全長β 2AR受體上，用于改善激動劑鑒定基本上按Seifert 和其合作者所述(Seifert et al.1998.Eur.J.Biochem.255:369-382)，對膜提取物進行競爭放射性配體結合實驗。將來自昆蟲細胞的含有人 β 2AR (Perkin Elmer, cat nr6110106400UA)的 10 μ g 均質膜提取物與 Nb80 或非相關納米抗體(陰性對照；Irr Nb) 一起,于37° C、在24孔板(Corning Costar)中的在孵育緩沖液(75禮 Tris-HCl,12, 5mM MgC12UmM EDTA 以及 0，2%w/v BSA)中孵育 lh。以 5OOnM的終濃度，應用納米抗體，相比腎上腺素能受體，所述濃度對應于3000倍過量的納米抗體。隨后，將所研究的適當稀釋度系列的配體以及2nM3H-DHA放射性配體(Perkin Elmer catnr NET720001MC;特異性活性為104.4Ci/mmol)添加于納米抗體結合的膜提取物。用孵育緩沖液將每孔的總體積調整為500 μ 1，并且于37° C將反應混合物在水浴中進一步再孵育I小時。在用細胞采集機(Inotech)將膜提取物收獲到玻璃纖維濾器(Whatmann GF/B濾紙)上后，用冰冷的洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl pH7, 4)洗滌濾器，并且將風干的濾器部分轉移到含有3.5ml Optiphase ‘Hisafe2’閃爍液體的閃爍管(Perkin Elmer)中。于室溫下孵育I小時后，在LKB Wallace閃爍計數器中測量放射性。化合物文庫篩選利用競爭放射性配體結合測定，對化合物文庫進行激動劑篩選。為此，將10μ g來自表達(表達水平為約lOpmol/mg膜蛋白)人β 2AR的HEK293T細胞的內部制備的膜提取物，與Nb80或非相關納米抗體(陰性對照)，于30° C、在孵育緩沖液(50mM Hepes pH7.4、ImM CaCl2、5mM MgCl2UOOmM NaCl 以及 0，5%w/v BSA)中預孵育 lh。以 500nM 的終濃度應用納米抗體，與P2AR相比，其大約對應于3000倍過量的納米抗體。隨后，將裝載納米抗體的膜添加于含有文庫化合物和2nM3H-二氫阿普洛爾(DHA)放射性配體的96孔板中。用孵育緩沖液，將每孔總體積調整為100 μ 1，并且將反應幻化為于30° C進一步再孵育I小時。隨后，利用在0.3%聚乙烯亞胺中預浸的GF/B玻璃纖維96孔過濾板(Perkin Elmer)，收獲膜結合的放射性配體。將過濾板用冰冷的洗滌緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.4)洗滌，并于50° C 干燥 30 分鐘。在添加 25 μ I 閃爍流體 MicroScint -0，Perkin Elmer)后，在 WallacMicroBeta TriLux閃爍計數器中測量放射性(cpm)。在HDL顆粒中重構的β 2AR的Bimane熒光光譜為了比較Gs和Nb80結合對受體構象的影響，用環境敏感的熒光探針mono-bromobimane (Invitrogen)、在位于TM6的細胞質端的半胱氨酸265處標記純化的β 2AR,并將其重構到HDL顆粒(mBB-132AR/HDL)中。在獲得熒光發射光譜之前，于RT、在緩沖液(20mM HEPES pH7.5, IOOmM NaCl)中，在缺少或存在10 μ M IS0、lyM反向激動劑IC1-118, 551 (ICI)、300nM Gs 異三聚體或 300nM Nb80 或 ISO 與 Gs 組合、ISO 與 Nb80 組合以及 ICI 與 Nb80 組合的情況下，將 IOnM mBB- β 2AR/HDL 孵育 30min。在 Spex FluoroMax-3分光焚光計(Jobin Yvon Inc.)上、以光子計數模式、利用5nm的激發和發射帶通，進行焚光光譜。將激發設定在370nm，并且以Inm增量、0.3sec/nm積分時間，從415-35nm收集發射。針對來自緩沖液和配體的背景熒光，校正熒光強度。表1.β 2AR特異性納米抗體的列表
權利要求
1.蛋白結合結構域，其能特異性結合GPCR的功能構象狀態。
2.權利要求1的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域在結合后能穩定GPCR的功能構象狀態。
3.權利要求1-2中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域在結合后能在GPCR中誘導功能構象狀態。
4.權利要求1-3中任一項的蛋白結合結構域，其中所述GPCR的功能構象狀態選自基礎構象狀態或活性構象狀態或非活性構象狀態。
5.權利要求1-4中任一項的蛋白結合結構域，其中所述GPCR的功能構象狀態是活性構象狀態。
6.權利要求1-5中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域能特異性結合與激動劑結合的GPCR和/或增強GPCR對激動劑的親和性。
7.權利要求1-6中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域在結合后能增強GPCR的功能構象狀 態的熱穩定性。
8.權利要求1-7中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域能特異性結合所述GPCR的功能構象狀態的構象表位。
9.權利要求8的蛋白結合結構域，其中所述構象表位是細胞內表位。
10.權利要求8-9中任一項的蛋白結合結構域，其中所述構象表位包含于用于下游信號傳導蛋白的結合位點中。
11.權利要求8-10中任一項的蛋白結合結構域，其中所述構象表位包含于G蛋白結合位點中。
12.權利要求1-11中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含4個構架區和3個互補決定區或其任何合適的片段。
13.權利要求1-12中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域來源于駱駝抗體。
14.權利要求1-13中任一項的蛋白結合結構域，其中所述蛋白結合結構域包含納米抗體序列或其任何合適的片段。
15.權利要求14的蛋白結合結構域，其中所述納米抗體包含選自SEQID ΝΟ:1_29的序列或其任何合適的片段。
16.權利要求1-15中任一項的蛋白結合結構域，其中所述GPCR是哺乳動物蛋白或植物蛋白或微生物蛋白或病毒蛋白或昆蟲蛋白。
17.權利要求16的蛋白結合結構域，其中所述哺乳動物蛋白是人蛋白。
18.權利要求1-17中任一項的蛋白結合結構域，其中所述GPCR選自GPCR谷氨酸家族的GPCR、GPCR視紫紅質家族的GPCR、GPCR粘附家族的GPCR、GPCR Frizzled/Taste2家族的GPCR以及GPCR分泌素家族的GPCR。
19.權利要求1-18中任一項的蛋白結合結構域，其中所述GPCR是腎上腺素能受體，如α腎上腺素能受體或β -腎上腺素能受體，或其中所述GPCR是毒蕈堿受體,如Ml毒蕈堿受體或M2毒蕈堿受體或M3毒蕈堿受體或Μ4毒蕈堿受體或Μ5毒蕈堿受體,或其中所述GPCR是血管緊張素受體，如血管緊張素IIl型受體或血管緊張素Π2型受體。
20.復合體，包含(i)蛋白結合結構域，(ii)功能構象狀態的GPCR，以及(iii)任選存在的受體配體。
21.權利要求20的復合體，包含(i)權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域，(ii)功能構象狀態的GPCR，以及(iii)任選存在的受體配體。
22.權利要求20-21中任一項的復合體，其中所述受體配體選自小分子、蛋白、肽、蛋白支架、核酸、離子、碳水化合物或抗體或其任何合適的片段。
23.權利要求20-22中任一項的復合體，其中所述復合體采用溶解的形式或固定化于固相支持物。
24.權利要求20-23中任一項的復合體，其中所述復合體是晶體。
25.晶體形式的復合體，包含⑴蛋白結合結構域，(ii)功能構象狀態的GPCR，以及(iii)任選存在的受體配體，其中所述晶體形式是通過使用權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域獲得的。
26.細胞組合物，包含權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域和/或權利要求20-24中任一項的復合體。
27.權利要求26的細胞組合物，其中所述蛋白結合結構域在GPCR結合所述蛋白結合結構域后能穩定和/或誘導所述GPCR的功能構象狀態。
28.權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域或權利要求20-24中任一項的復合體或權利要求26-27中任一項的細胞組合物用于穩定和/或誘導GPCR的功能構象狀態的用途。
29.權利要求28的用途，用于結晶和/或解析功能構象狀態的GPCR的結構。
30.權利要求1-19 中任一項的蛋白結合結構域或權利要求20-24中任一項的復合體或權利要求26-27中任一項的細胞組合物用于捕獲功能構象狀態的GPCR的用途。
31.權利要求30的用途，用于捕獲與受體配體復合或與一個或多個下游相互作用蛋白復合的功能構象狀態的GPCR。
32.權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域或權利要求20-24中任一項的復合體在GPCR相關疾病如癌癥、自身免疫病、傳染病、神經病、心血管疾病的診斷或預后中的用途。
33.測定功能構象狀態的GPCR的晶體結構的方法，所述方法包括以下步驟: (i)提供權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域、靶GPCR以及任選存在的受體配體，和 (ii)形成所述蛋白結合結構域、所述GPCR以及任選存在的所述受體配體的復合體，以及 (iii)結晶步驟(ii)的所述復合體，從而形成晶體， 其中測定功能構象狀態的GPCR晶體結構。
34.權利要求33的方法，其中所述方法還包括從所述晶體獲得原子坐標的步驟。
35.捕獲功能構象狀態的GPCR的方法，所述方法包括以下步驟: a.提供權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域和靶GPCRjP b.形成所述蛋白結合結構域與所述GPCR的復合體， 其中捕獲功能構象狀態的GPCR。
36.捕獲功能構象狀態的GPCR的方法，所述方法包括以下步驟: a.將含有多種構象狀態的GPCR的溶液應用于具有固定化的權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域的固相支持物，和b.形成所述蛋白結合結構域與所述GPCR的復合體，以及 c.除去弱結合或未結合的分子， 其中，捕獲功能構象狀態的GPCR。
37.權利要求35-36中任一項的方法，其中所述方法還包括純化所述復合體的步驟。
38.藥物組合 物，包含治療有效量的權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域和至少一種藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑。
39.權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域或權利要求38的藥物組合物用于調節GPCR信號傳導活性的用途。
40.權利要求39的用途，用于阻斷G蛋白介導的信號傳導。
41.權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域或權利要求38的藥物組合物，用于治療GPCR相關疾病如癌癥、自身免疫病、傳染病、神經病、心血管疾病。
42.試劑盒，包含權利要求1-19中任一項的蛋白結合結構域或權利要求20-24中任一項的復合體或權利要求任一項的細胞組合物。
全文摘要
本發明涉及GPCR結構生物學和信號傳導領域。具體而言，本發明涉及針對或能特異性結合G蛋白偶聯受體(GPCR)的功能構象狀態的蛋白結合結構域。更具體地，本發明提供能增強GPCR的功能構象狀態的穩定性、特別是能增強活性構象狀態的GPCR的穩定性的蛋白結合結構域。本發明的蛋白結合結構域可以用作對結合各種天然和合成配體的G蛋白偶聯受體進行結構和功能表征的工具，以及用于以GPCR為目標的篩選和藥物發現工作的工具。此外，本發明還包括這些蛋白結合結構域用于GPCR相關疾病的診斷、預后以及治療的用途。
文檔編號G01N33/543GK103180734SQ201180044888
公開日2013年6月26日 申請日期2011年7月18日 優先權日2010年7月16日
發明者J·斯泰亞特, E·帕爾東, S·拉斯穆森, J·馮, B·科比爾卡, T·萊里曼斯 申請人:弗拉芒區生物技術研究所, 布魯塞爾自由大學, 利蘭斯坦福初級大學董事會