人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在以人巨細(xì)胞病毒(HCMV)為病因的感染癥的血清學(xué)診斷中，通常使用病毒抗原 (天然抗原)。但在天然抗原中，不可忽視因制備方法而產(chǎn)生的批間差異。另外，由于是處理病毒本身，因此在安全性或簡(jiǎn)便性上也存在問(wèn)題。
為了實(shí)現(xiàn)HCMV血清學(xué)診斷的標(biāo)準(zhǔn)化，人們希望實(shí)現(xiàn)抗原的重組化，但在只使用重組抗原時(shí)，已知檢查的靈敏度、特異性尚不充分。這是由于難以從多個(gè)病毒抗原中選擇適合重組化的適當(dāng)?shù)目乖木壒?。除此之外，認(rèn)為使用各抗原蛋白的部分表達(dá)片段也是一個(gè)原因。
例如，作為主要的抗原而已知的ppl50是分子量為約150kDa的蛋白，因此不可能使用大腸桿菌進(jìn)行大量合成，且難以在檢查中使用全長(zhǎng)蛋白。因此，在市售的檢查試劑盒中，是將PP150的片段(代表性的是30個(gè)殘基 40個(gè)殘基左右)與其他HCMV蛋白片段適當(dāng)混合用作抗原。但 是，有報(bào)道稱(chēng)只使用部分表達(dá)片段時(shí)，檢查的靈敏度為60%左右，并不充分。
但是，還已知在采用免疫測(cè)定的血清檢查領(lǐng)域，雖然必需使用全長(zhǎng)抗原，但檢測(cè)靈敏度未必有所提高。例如，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)I中，對(duì)于HCMV的天然抗原(包含全長(zhǎng)病毒蛋白)，研究HCMV陽(yáng)性患者血清組的抗體反應(yīng)性，并給出了對(duì)于每個(gè)蛋白評(píng)價(jià)其抗體反應(yīng)性的結(jié)果，但能夠達(dá)到接近100%的檢測(cè)靈敏度的只有ppl50，根據(jù)蛋白的種類(lèi)，檢測(cè)靈敏度變得非常低，達(dá)到50%左右以下。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特表2000-514300號(hào)公報(bào)；非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Journal of Clinical Microbiology: 37(1)，第 179-188 頁(yè)，1999。 發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供可以高靈敏度地檢測(cè)HCMV感染的實(shí)用性高的新方法。
解決課題的方法本發(fā)明人等合成了 15種HCMV蛋白的全長(zhǎng)蛋白，并深入研究了其與HCMV感染患者血清的反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用PP28全長(zhǎng)蛋白作為抗原時(shí)，可以無(wú)遺漏地檢測(cè)所有的感染患者， 還可以使用大腸桿菌以重組蛋白的形式大量合成、純化PP28全長(zhǎng)蛋白，并將其作為用于檢查HCMV的抗原進(jìn)行商業(yè)利用，從而完成了本發(fā)明。
S卩，本發(fā)明提供人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括通過(guò)使用人工多肽作為抗原的免疫測(cè)定，測(cè)定從受試者中分離的樣品中所能含有的抗PP28的抗體，所述人 工多肽由與SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、且具 有與針對(duì)人巨細(xì)胞病毒所產(chǎn)生的PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行結(jié) 合的反應(yīng)性。另外，本發(fā)明還提供人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)試劑，其中包含人工多肽，所述 人工多肽由與SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、且 具有與針對(duì)人巨細(xì)胞病毒所產(chǎn)生的PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行 結(jié)合的反應(yīng)性。本發(fā)明還提供人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)試劑盒，其中包含上述本發(fā)明的檢 測(cè)試劑。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供檢測(cè)靈敏度極其優(yōu)異的HCMV感染的檢測(cè)方法。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)簡(jiǎn) 便的免疫測(cè)定，可以無(wú)遺漏地準(zhǔn)確檢測(cè)所有的HCMV感染患者。在公知的抗體檢查方法中， 有使用PP28片段作為抗原的方法，例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)I中還記載著使用pp28的30個(gè)殘基 左右的大小的片段檢測(cè)血清中的抗HCMV抗體的方法。但是，根據(jù)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1，使用pp28 片段時(shí)，在一成以上的患者中出現(xiàn)假陰性。若出現(xiàn)假陰性，則漏掉了感染患者，因此在臨床 檢查中成為重大問(wèn)題。根據(jù)本發(fā)明的方法，不會(huì)漏掉感染患者，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測(cè)，可以 對(duì)臨床檢查作出重大貢獻(xiàn)。


圖1是通過(guò)蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)使用抗體柱純化在大腸桿菌中表達(dá)的PP28重組蛋白 的過(guò)程的結(jié)果。左部分是使用實(shí)施例中制備的抗PP28單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，右部分 是使用抗大腸桿菌抗原的抗體進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。Ma :標(biāo)記物、元柱添加前、pass :通過(guò)組 分、elute :洗脫組分、conc.:濃縮組分。
具體實(shí)施方式
pp28是作為HCMV的結(jié)構(gòu)蛋白之一的28kDa的磷蛋白，由于其編碼在UL99基因中， 所以有時(shí)還被稱(chēng)作UL99。SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列是HCMV AD169株所具有的pp28 的氨基酸序列，在GenBank中也以X17403(全基因組)等檢索號(hào)注冊(cè)。編碼SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列的病毒DNA的核苷酸序列見(jiàn)SEQ ID NO:1。
在本發(fā)明中，使用由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列構(gòu)成的人工pp28作為抗原。 或者，使用人工多肽作為抗原，所述人工多肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中有少數(shù)氨基 酸殘基被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列構(gòu)成、且具有與針對(duì)HCMV產(chǎn)生的 PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合的反應(yīng)性。后一種多肽與SEQ ID NO: 2的同源性為90%以上、優(yōu)選為95%以上、更優(yōu)選為98%以上。作為后一種多肽，還 優(yōu)選由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中有I個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被取代、缺失、插入和/或 添加而得到的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
在實(shí)施例中，只使用由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列構(gòu)成的pp28全長(zhǎng)蛋白作 為抗原，可以檢測(cè)所有的來(lái)自HCMV感染患者的100個(gè)檢體。病毒的基因組突變頻繁，關(guān)于 PP28的氨基酸序列，在臨床分離株中就發(fā)現(xiàn)了各種各樣的突變序列。因此，在采集了上述 檢體的100名感染患者中，認(rèn)為在HCMV的pp28的氨基酸序列上存在一部分差異。即使是針對(duì)由上述的各種氨基酸序列構(gòu)成的天然的PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體，也均與由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽反應(yīng)而被檢測(cè)出來(lái)，因此即使是以與SEQ ID NO: 2在氨基酸序列上存在一部分差異的多肽作為抗原的情形，認(rèn)為也同樣可以檢測(cè)抗pp28的 抗體(抗pp28抗體)。當(dāng)為與SEQ ID NO: 2的同源性足夠高的多肽時(shí)，與在HCMV感染者 體內(nèi)誘導(dǎo)的抗PP28抗體的反應(yīng)性和由原始的SEQ ID NO: 2構(gòu)成的pp28同等的幾率高。
需要說(shuō)明的是，由任意的氨基酸序列構(gòu)成的多肽是否具有與針對(duì)HCMV所產(chǎn)生的 PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合的反應(yīng)性，這例如可以通過(guò)使由 已知的HCMV感染患者分離的血清等樣品與該多肽反應(yīng)而容易地進(jìn)行確認(rèn)。如果可以確認(rèn) 存在于血清中的抗體與多肽結(jié)合，則可以判斷該多肽具有上述的反應(yīng)性。
這里，氨基酸序列的“同源性”是指，將應(yīng)該進(jìn)行比較的兩個(gè)氨基酸序列排列整齊， 使這兩個(gè)氨基酸序列的氨基酸殘基盡可能多地一致，用一致的氨基酸殘基數(shù)除以總氨基酸 殘基數(shù)，所得的值用百分率表示，即為同源性的值。進(jìn)行上述排比時(shí)，根據(jù)需要，在進(jìn)行比 較的兩個(gè)序列的一方或雙方中插入適當(dāng)?shù)拈g隙。關(guān)于這樣的序列的排比化，例如可以使用 BLAST、FASTA、CLUSTAL W等眾所周知的程序容易地進(jìn)行。插入間隙時(shí)，上述總氨基酸殘基 數(shù)是指將I個(gè)間隙作為I個(gè)氨基酸殘基來(lái)計(jì)數(shù)的殘基數(shù)。如此計(jì)數(shù)的總氨基酸殘基數(shù)在進(jìn) 行比較的兩個(gè)序列間不同時(shí)，同源性(%)用一致的氨基酸殘基數(shù)除以長(zhǎng)的序列的總氨基酸 殘基數(shù)來(lái)計(jì)算。
需要說(shuō)明的是，已知構(gòu)成天然蛋白的20種氨基酸可以分成具有類(lèi)似性質(zhì)的組，如 具有低極性側(cè)鏈的中性氨基酸(Gly、Ile、Val、Leu、Ala、Met、Pr0)、具有親水性側(cè)鏈的中性 氨基酸(Asn、Gln、Thr、Ser、Tyr、Cys)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、堿性氨基酸(Arg、Lys、His)、 芳族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)，當(dāng)為這些組間的取代時(shí)，多肽的性質(zhì)往往不會(huì)發(fā)生變化。因此， 當(dāng)SEQ ID NO: 2的少數(shù)氨基酸殘基在上述各組內(nèi)被取代時(shí)，與針對(duì)HCMV所產(chǎn)生的pp28而 在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體的反應(yīng)性、與由原始的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽同等 的可能性特別高。在本發(fā)明中用作抗原的多肽中，由如此取代的氨基酸序列構(gòu)成的多肽是 由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的一個(gè)優(yōu)選例子。
“人工多肽”是指，通過(guò)化學(xué)合成、基因工程學(xué)方法及其他方法人工制造的多肽，不 包含對(duì)在感染了 HCMV的細(xì)胞內(nèi)由HCMV基因組表達(dá)產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行回收而得到的多肽。如 上所述，PP28的氨基酸序列和編碼該氨基酸序列的核苷酸序列注冊(cè)在數(shù)據(jù)庫(kù)中并眾所周 知，本申請(qǐng)序列表中也有記載。另外，編碼各氨基酸的密碼子是公知的，因此可以容易地鑒 定編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列。因此，即使是由不同于SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，也可以容易地鑒定編碼該多肽的多核苷酸的核苷酸序列。根據(jù) 上述序列信息，本發(fā)明中用作抗原的多肽可以通過(guò)任一種方法來(lái)制造。
作為化學(xué)合成法的具體例子，例如可以列舉Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法 (叔丁氧羰基法)等。另外，還可以利用各種市售的肽合成儀按照常規(guī)方法進(jìn)行合成。進(jìn)行 化學(xué)合成時(shí)，只根據(jù)氨基酸序列，即可合成所期望的多肽。
利用基因工程學(xué)方法來(lái)制作多肽的方法也眾所周知，簡(jiǎn)而言之，制備編碼上述多 肽的多核苷酸，將該多核苷酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，再使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)使之表達(dá)并 回收、純化，從而可以以重組多肽的形式得到目標(biāo)抗原多肽。本發(fā)明中用作抗原的多肽具有 百數(shù)十殘基以上的大小，因此為了以低成本進(jìn)行大量合成，優(yōu)選利用基因工程學(xué)方法，使用大腸桿菌等宿主細(xì)胞制作重組多肽。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞的種類(lèi)，重組多肽可以接受各種 翻譯后修飾(N末端甲硫氨酸的脫離、N末端乙?；⑻砑犹擎?、在細(xì)胞內(nèi)利用蛋白酶進(jìn)行的 有限分解、肉豆蘧?；愇於┗?、磷酸化等)，但這樣的翻譯后被修飾的形態(tài)的多肽，只 要其具有與針對(duì)HCMV所產(chǎn)生的pp28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體的反應(yīng)性，在本發(fā)明的方法 中也可用作抗原。
通過(guò)基因工程學(xué)方法制作由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽時(shí)，編碼 該多肽的多核苷酸(SEQ ID NO:1)可以如下制備用具有由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 構(gòu)成的PP28的HCMV(AD169株等)感染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，從該感染細(xì)胞中提取病毒DNA，再 通過(guò)PCR合成DNA，即可制得。關(guān)于PCR中使用的引物，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列可以容易地進(jìn)行設(shè)計(jì)、制備，例如可以使用實(shí)施例中使用的由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列構(gòu)成的引物。使用表達(dá)由其他的氨基酸序列構(gòu)成 的pp28的HCMV株時(shí)，可以制備編碼由不同于SEQ ID NO: 2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的多 核苷酸。另外，關(guān)于編碼由所期望的氨基酸序列構(gòu)成的多肽的多核苷酸，可以使用市售的核 酸合成儀、或者如上所述利用常規(guī)方法向已制備的DNA中導(dǎo)入適當(dāng)?shù)耐蛔兌玫?。將制?的多核苷酸插入適當(dāng)?shù)妮d體中，使其在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，再將其回收、純化，從而可 以得到所期望的多肽。使用的載體或各種表達(dá)系統(tǒng)(細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺 乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等)也眾所周知，各種載體或宿 主細(xì)胞、試劑類(lèi)、試劑盒均有銷(xiāo)售，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇使用。HCMV株也有市 售，另外還可以從感染患者中分離得到，因此容易獲取。病毒DNA的提取、PCR、向載體中插 入DNA、向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入載體、所表達(dá)的多肽的回收、純化等方法本身均為眾所周知的常 規(guī)方法。
如下述實(shí)施例中具體所述，由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列構(gòu)成的重組多肽可 以使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，該已表達(dá)的多肽例如可以使用固定有與PP28特異性 結(jié)合的單克隆抗體的抗體柱簡(jiǎn)便地進(jìn)行純化。若使用如此操作而得到的重組多肽作為免疫 測(cè)定的抗原，則可以無(wú)遺漏地檢測(cè)所有的HCMV感染患者。需要說(shuō)明的是，單克隆抗體的制 作方法是眾所周知的常規(guī)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行制作。例如，如下述實(shí)施例 中也記載的那樣，用滅活病毒對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，再?gòu)脑搫?dòng)物中采集脾細(xì)胞等產(chǎn)生抗體的細(xì) 胞，使其與骨髓瘤細(xì)胞融合制作雜交瘤，再選擇產(chǎn)生具有所期望的結(jié)合性的抗體的雜交瘤 使之增殖，從而可以從培養(yǎng)上清中回收與PP28進(jìn)行特異性結(jié)合的單克隆抗體。
免疫測(cè)定本身在該領(lǐng)域眾所周知。若將免疫測(cè)定按照反應(yīng)方式進(jìn)行分類(lèi)，則分成 夾層法、競(jìng)爭(zhēng)法、凝聚法、免疫層析法、蛋白質(zhì)印跡法等；若按照標(biāo)記進(jìn)行分類(lèi)，則分成放射 免疫測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定(EIA)、生物素免疫測(cè)定等。另外，使用抗原的抗體檢 查方法也已知有各種方法，作為具體例子并不限于這些，可以列舉EIA(ELISA、CLEIA(化 學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法)、蛋白質(zhì)印跡等)、凝聚法(乳膠凝聚法等)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)(CF)等。 按照本發(fā)明的方法測(cè)定樣品中的抗PP28抗體時(shí)，可以采用公知的任一種免疫測(cè)定法。需要 說(shuō)明的是，在本發(fā)明中，“測(cè)定” 一詞包含檢測(cè)、定量和半定量。
用于免疫測(cè)定時(shí)，上述的人工多肽抗原可以以在單末端或兩末端添加有任意的氨 基酸序列的形態(tài)(作為由包含這樣的添加序列的氨基酸序列構(gòu)成的多肽)進(jìn)行使用。在該 領(lǐng)域，即使是與不同的蛋白融合而得到的融合蛋白，也可以使用識(shí)別一方的蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)，這是廣為人知的事實(shí)。因此，即使以這樣的形態(tài)使用上述人工多肽，也可以對(duì)樣品 中的抗PP28抗體進(jìn)行免疫測(cè)定。例如，即使是以與其他蛋白的融合蛋白的形態(tài)進(jìn)行使用的 情形，在該融合蛋白中發(fā)揮抗PP28抗體的抗原的功能的也是上述的人工多肽部分，因此包 含在“使用人工多肽作為抗原”中。如上所述，將上述人工多肽抗原以在單末端或兩末端添 加有任意的氨基酸序列的形態(tài)進(jìn)行使用的情形也包含在本發(fā)明的方法中。上述人工多肽中 所添加的氨基酸序列可以是構(gòu)成任何的功能性蛋白或其功能性片段的氨基酸序列，也可以 是接頭等不具有生理活性的序列。當(dāng)為重組多肽時(shí)，有時(shí)在制造步驟中添加GST或His等 標(biāo)記序列，但即使是添加有這樣的標(biāo)記序列的狀態(tài)，也可以直接用作抗原。
例如，進(jìn)行ELISA或CLEIA時(shí)，將上述人工多肽抗原分別在板或顆粒等上固化，使 其與樣品反應(yīng)，將樣品中的抗PP28抗體捕集到固相上，進(jìn)行清洗，之后與酶標(biāo)記的抗IgG抗 體和/或抗IgM抗體反應(yīng)，再進(jìn)行清洗，之后添加底物。根據(jù)酶反應(yīng)量，可以測(cè)定捕集到固相 上的抗PP28抗體。進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡時(shí)，將上述人工多肽抗原電泳后轉(zhuǎn)移到薄膜上，使該薄 膜與樣品反應(yīng)，之后與上述同樣地與酶標(biāo)記的抗IgG抗體和/或抗IgM抗體反應(yīng)即可。當(dāng) 為凝聚法時(shí)，例如將上述人工多肽抗原固定在乳膠顆粒等上，使其與樣品反應(yīng)，再根據(jù)吸光 度等測(cè)定顆粒的凝聚量即可。
在生物體內(nèi)針對(duì)HCMV而誘導(dǎo)的抗體主要是IgG和IgM。初感染時(shí)，首先IgM上升， 感染數(shù)天后達(dá)到最大值，之后減少，IgG在感染后I周左右開(kāi)始上升，以后長(zhǎng)期持續(xù)。因此， 當(dāng)為可以將樣品中的抗PP28抗體分為IgG和IgM進(jìn)行檢測(cè)的方法時(shí)(例如上述的ELISA 或蛋白質(zhì)印跡等)，從準(zhǔn)確檢測(cè)HCMV感染的角度考慮，在用抗原補(bǔ)足的抗pp28抗體的檢測(cè) 中，優(yōu)選使用抗IgG抗體和抗IgM抗體兩者。
本發(fā)明的方法所適用的樣品為從受試者體內(nèi)分離的樣品，優(yōu)選為血液樣品(全 血、血漿、血清等)。
實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，可以同時(shí)使用上述人工多肽以外的HCMV抗原蛋白或其片 段。例如，進(jìn)行ELISA時(shí)，將所有的抗原混合固化在板上、或者分別固化在分開(kāi)的孔中，使其 與樣品反應(yīng)即可。進(jìn)行CLEIA時(shí)，將所有的抗原混合固化在顆粒上，使其與樣品反應(yīng)即可。 進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡時(shí)，例如將所有的抗原混合進(jìn)行電泳，之后轉(zhuǎn)移到薄膜上，使其與樣品反應(yīng) 即可。進(jìn)行凝聚法時(shí)，將已混合的抗原固定在顆粒上，或者將抗原各自單獨(dú)固定的顆?；?合，使該顆粒與樣品反應(yīng)即可。
上述的人工多肽可以作為HCMV感染的檢測(cè)試劑來(lái)提供。該試劑可以?xún)H含有上述 的多肽，也可以進(jìn)一步含有PP28以外的一種以上的抗原蛋白或其片段。另外，還可以進(jìn)一 步含有對(duì)這些多肽的穩(wěn)定化等有用的其他成分。另外，還可以以抗原多肽被固定在板或顆 粒等固相上的形態(tài)來(lái)提供。
上述檢測(cè)試劑可以與其他的試劑類(lèi)等適當(dāng)組合，以HCMV感染的檢測(cè)試劑盒的形 式來(lái)提供。免疫測(cè)定所必需的其他試劑類(lèi)眾所周知。例如，在本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中，除上 述的檢測(cè)試劑外，還可以包含可用作樣品稀釋液或清洗液等的緩沖液、用于檢測(cè)與抗原多 肽結(jié)合的抗體的標(biāo)記抗免疫球蛋白抗體等。實(shí)施例
以下，根據(jù)實(shí)施例來(lái)更具體地說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。
1.候選抗原的選擇利用小麥胚芽無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)合成HCMV蛋白中的15種(下述表I)蛋白的全長(zhǎng)蛋白。 合成中使用七A 7 U一寸^工> 7公司的Protemist DT。載體中所插入的插入DNA可以如下獲得用HCMV AD169株(從理研A 4才丨— 7七>夕一購(gòu)入)感染MRC-5細(xì)胞，從該感染細(xì)胞中提取病毒DNA，通過(guò)使用市售試劑盒的PCR擴(kuò)增編碼各全長(zhǎng)蛋白的DNA即可得到。將各DNA克隆到包含SP6啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體中，使用所得的質(zhì)粒DNA，利用5mL的反應(yīng)系統(tǒng)(25// g質(zhì)粒DNA)進(jìn)行37°C、6小時(shí)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和15°C、20小時(shí)的翻譯，合成各全長(zhǎng)蛋白。需要說(shuō)明的是，在PP28的DNA的擴(kuò)增中，使用由SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列構(gòu)成的引物(分別包含BamHI識(shí)別序列和NotI識(shí)別序列)，并使用Pfu Ultra DNA聚合酶(Agilent Technologies公司)在95°C 2分鐘的變性處理、30個(gè)循環(huán)的95°C 20秒一 55°C 20秒一 72°C I分鐘、最后72°C 3分鐘的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。
[表 I]
權(quán)利要求
1.人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法包括通過(guò)使用人工多肽作為抗原的免疫測(cè)定，測(cè)定從受試者中分離的樣品中所能含有的抗PP28的抗體，所述人工多肽由與SEQID NO: 2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有與針對(duì)人巨細(xì)胞病毒所產(chǎn)生的PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合的反應(yīng)性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，上述人工多肽由SEQID NO: 2所示的氨基酸序列或該氨基酸序列中有I個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、缺失、插入和/或添加而得到的氨基酸序列構(gòu)成。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中，上述人工多肽由SEQID NO: 2所示的氨基酸序列構(gòu)成。
4.權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述人工多肽是利用基因工程學(xué)方法制作的重組多肽。
5.人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)試劑，其中包含人工多肽，所述人工多肽由與SEQID NO:2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有與針對(duì)人巨細(xì)胞病毒所產(chǎn)生的PP28而在生物體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合的反應(yīng)性。
6.人巨細(xì)胞病毒感染的檢測(cè)試劑盒，其中包含權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了可以高靈敏度地檢測(cè)HCMV感染的實(shí)用性高的新方法。本申請(qǐng)的發(fā)明人合成了15種HCMV蛋白的全長(zhǎng)蛋白，對(duì)其與HCMV感染患者血清的反應(yīng)性進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用pp28全長(zhǎng)蛋白作為抗原時(shí)，可以無(wú)遺漏地檢測(cè)所有的感染患者?？梢允褂么竽c桿菌以重組蛋白的形式大量合成、純化pp28全長(zhǎng)蛋白，并可以將其作為用于檢查HCMV的抗原進(jìn)行商業(yè)利用。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103003694SQ201180033738
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者藤井信之, 本多秀夫, 內(nèi)田好昭, 小見(jiàn)和也 申請(qǐng)人:富士瑞必歐株式會(huì)社