酵母細胞壁組分及其檢測的制作方法

專利名稱：酵母細胞壁組分及其檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物飼料添加劑及其在飼料產品中的檢測。另外，本發明涉及酵母細胞壁組分、其分離方法、以及用于其免疫學檢測的組合物和方法。
背景技術：
在動物營養領域，已采用多種添加劑和補充劑來改善牲畜性能。在一些情況下，酵母細胞壁組分可用作動物飼料添加劑。一個實例是飼料添加劑MYC0S0RB (由ALLTECH，Inc.制造)。MYC0S0RB結合食品和飼料中的真菌毒素污染物，從而將真菌毒素以不能消化的狀態隔離。這種真菌毒素污染物常常由于用作給料組分的谷物、谷物副產品以及玉米青貯飼料中田地和收割后的真菌生長而產生。雖然市售飼料原料和飼料產品組分必須經過真菌毒素監測，但沒有監測系統是100%有效的。據估計，世界范圍內所有作物的大約25 %受到真菌毒素污染的影響(Council for Agricultural Science andTechnology(1989) “Mycotoxins !Economics and Health Risks”， Task Force ReportNo. 116，Ames, IA)，因此受污染的材料進入牲畜和伴侶動物飼料供應鏈的情況的發生幾乎是不可避免的。牲畜消耗真菌毒素污染的飼料的后果包括食欲下降、生長減緩、生殖功能和乳產量降低、免疫系統受抑制、消化功能受損以及在嚴重情況下死亡。因此，真菌毒素隔離已被證明是用于降低不利地影響動物和人類健康的天然存在的毒素的危害的有用策略。用于定性和定量檢測飼料添加劑的穩健且特異的分析方法和試劑盒的開發，因為很多干擾化合物的存在以及準備供給動物消耗的飼料中使用的飼料添加劑的相對低濃度而變得復雜。發明概述本發明涉及動物飼料添加劑及其在飼料產品中的檢測。另外，本發明涉及酵母細胞壁組分、其分離方法、以及用于其免疫學檢測的組合物和方法。在一些實施方案中，提供檢測樣品(例如，飼料樣品、食品樣品、或其提取物)中酵母細胞壁組分和/或其片段的方法。這種方法可用于例如確定由酵母細胞壁組分(例如，酵母葡聚糖、酵母(I — 4)-a-D_ 葡聚糖、酵母(I — 6)-i3_D-葡聚糖、酵母(I — 4)-a-/(l — 6)-β- _ 葡聚糖、MYC0S0RB飼料添加劑、BI0M0SS飼料添加劑、ACTIGEN飼料添加劑等)構成的食品和飼料添加劑在飼料產品(例如，牲畜飼料、伴侶動物飼料、或其制備中間體)中的存在。在一些實施方案中，本發明涉及用于從飼料產品(例如，牲畜飼料、伴侶動物飼料、或其制備中間體)中提取酵母細胞壁組分(例如，酵母葡聚糖、酵母(I —4)-a_D-葡聚糖、酵母(I — 6)-β-D-葡聚糖、酵母(I — 4)-a-/(I — 6)-β-D-葡聚糖、MYC0S0RB飼料添加劑等)的方法。在一些實施方案中，本發明提供可用于產生特定酵母細胞壁組分(例如，酵母(I — 4)-a-D_葡聚糖、酵母(I — 6)-i3_D-葡聚糖、酵母(I — 4)-a-/(I —6)-i3_D-葡聚糖、和/或其綴合物)的抗體的抗原。在優選的實施方案中，這種抗原綴合至載體，例如蛋白質載體(如牛血清白蛋白(BSA))。在一些實施方案中，本發明提供用于在C6-0H位活化碳水化合物(例如，包含吡喃葡萄糖環的碳水化合物、葡聚糖、酵母(I —4)-α-/(1 —6)-i3_D-葡聚糖)的方法。在一些實施方案中，這種活化包括溫和氧化(例如，使用二甲基亞砜/乙酸酸酐)。在一些實施方案中，本發明提供能夠識別酵母細胞壁抗原的抗體(例如，能夠識別酵母(I— 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I —6)-i3_D-葡聚糖、酵母(I — 4)-α -/(I — 6)-β -D-葡聚糖、或其綴合物的單克隆或多克隆抗體；針對(I — 4)-a-D-葡聚糖/(l，6)-i3-D-葡聚糖/BSA抗原產生的單克隆抗體513Α161. I或513A431. I、針對(I — 4)-a-D_葡聚糖/(I — 6)-β-D-葡聚糖/BSA抗原產生的多克隆抗體；或其純化、稀釋、綴合、和/或單一特異性的形式)。在一些實施方案中，本發明提供包含用于檢測樣品(例如，飼料樣品、食品樣品、或其提取物)中酵母細胞壁組分(例如，酵母葡聚糖、酵母(I— 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I —6)-β-D-葡聚糖、酵母(I —4)-a-/(I — 6) - β -D-葡聚糖、MYCOSORB飼料添加劑等)的試劑的試劑盒。本發明不受用于分析的樣品的類型或性質限制。在一些優選的實施方案中，樣品為食品或飼料產品或衍生自食品或飼料產品。食品或飼料產品包含任何被消耗(例如，被動物消耗)并為飲食貢獻能量和/或營養的材料。飼料原料的實例包括但不限于全混合日·糧(TMR)、草料、粒料、濃縮物、預混物副產品、谷物、酒糟、糖蜜、纖維、飼草、牧草、干草、籽粒(kernal)、葉片、粗粉、可溶物和補充劑。飼料和飼料原料不受其物理形式限制。飼料和飼料原料可加工成較小粒度(例如，切碎的、剁碎的、研碎的、磨碎的等)；制成液體形式(例如，提取的、烹煮的、濃縮的、轉化成漿料或其他粘稠形式)；或加工成較大尺寸(例如，成捆的、固結的、壓縮的、或成形為復合形狀，例如粒狀、塊狀、方形、薄片狀等)。本發明不受用于獲得分析樣品的提取方法的類型或性質限制。在一些實施方案中，對待分析的初始材料(例如，食品或飼料產品；飼料原料)進行提取技術以獲得分析樣品。提取技術包括但不限于酸提取、堿提取、用有機溶劑提取、用緩沖液提取、用鹽提取、用洗滌劑提取、物理提取(例如，烹煮、蒸汽提取、低溫提取、研磨等)、或其組合。在一些實施方案中，使用有機溶劑和酸溶液的組合來提取待分析的材料(例如，食品或飼料產品；飼料原料)。在一些實施方案中，使用二甲基亞砜(DMSO)和鹽酸(HCl)的溶液來提取待分析的材料(例如，食品或飼料產品；飼料原料)。本發明不受存在于初始樣品中的分析物(例如，抗原、酵母細胞壁組分、酵母葡聚糖、酵母(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6)-i3-D-葡聚糖、酵母(I — 4)-a-/(I — 6) - β -D-葡聚糖、MYCOSORB飼料添加劑等)的量限制。分析物的量可小于O. 005mg、O. 005-0. 05mg、0. 05-0. 5mg、0. 5_lmg、l-5mg、5_10mg、10_25mg、25mg 或更多。本發明不受存在于初始待測材料中的分析物(例如，抗原、酵母細胞壁組分、酵母葡聚糖、酵母(I — 4) - a -D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母(I — 4) - a -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖、MYCOSORB飼料添加劑等)的量限制。檢測的分析物的量可小于0. 05千克/噸、0. 05-0. 5千克/噸、0. 5-1千克/噸、I. 0-2. O千克/噸、2. 0-3. O千克/噸、3. 0-4. O千克/噸、4. 0-5. O千克/噸、5. 0-6. O千克/噸、6. 0-10. O千克/噸、10千克/噸或更多。本發明不受用于檢測分析物(例如，如抗原、酵母細胞壁組分、酵母葡聚糖、酵母(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6)-i3-D-葡聚糖、酵母(I — 4)-a-/(l — 6)-β- _ 葡聚糖、MYCOSORB飼料添加劑等)的抗體的工作濃度限制。抗體(例如，能夠識別酵母(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6)-i3-D-葡聚糖、酵母 I — 4)-a-/(l — 6)-β- _ 葡聚糖、或其綴合物的單克隆或多克隆抗體；針對(I — 4) - a -D-葡聚糖/ (I — 6) - β -D-葡聚糖/BSA抗原產生的單克隆抗體513Α161. I或513Α431. I、針對(I — 4)-a-D-葡聚糖/(I — 6) - β-D-葡聚糖/BSA抗原產生的多克隆抗體；或其純化、稀釋、綴合、和/或單一特異性的形式)的工作稀釋度可為比I 100，OOO稀；I 50，000至I 100，000; I 20，000至I 50, 000 ；1 10，000 至 I 20, 000 ；1 5，000 至 I 10, 000 ；1 1,000 至 I 5,000;I : 500 至 I : 1，000;1 100 至 I : 500 ;1 50 至 I : 100 ; I 10-1 : 50 ;1 : I 至I : 10 ;2 : I 至 I : I ;或比 2 : I 濃。在一些實施方案中，本發明提供包含酵母細胞壁組分的免疫原性組合物。在一些實施方案中，酵母細胞壁組分包括酵母葡聚糖。在一些實施方案中，葡聚糖包括酵母(I — 4) - a -D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母(I — 4) - a -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖、或其綴合物或衍生物。在一些實施方案中，本發明提供綴合至載體(例如，蛋白質載體)的酵母(I —6)-β-D-葡聚糖、酵母(I —4)-a-/(1 — 6)-β-D-葡聚糖。載體可有利于宿主動物的免疫原性和/或穩定性。載體的實例包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、匙孔戚 血藍蛋白(KLH)、卵清蛋白(0VA)、牛甲狀腺球蛋白(THY)和鴨乙型肝炎核心抗原(DHBcAg)(Gathuru等(2005)Vaccine 23:4727-4733)。本發明不受抗原和載體之間的連接位置限制。在一些優選的實施方案中，抗原(例如，碳水化合物抗原、葡聚糖、包含吡喃葡萄糖環的碳水化合物、酵母(I — 4) - a -D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母(I — 4) - α -/(I — 6)-β -D-葡聚糖)在一個或多個相對于抗原的0-6位綴合至載體。在一些實施方案中，所述抗原為在C6位綴合至BSA的酵母(I — 4)-α -/(I — 6)-β -D-葡聚糖。本發明的抗體不受其在其中產生的宿主物種限制。宿主物種可為大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、兔子、山羊、綿羊、雞、驢、馬、牛科動物、犬科動物、貓科動物、豬科動物、類人猿、人類、或任何其他物種。本發明的抗體不受用于產生抗體的接種方案、抗原制備方法、或抗原遞送方法限制。抗原可在存在或不存在免疫刺激劑(例如，佐劑)、緩沖液、鹽、溶劑、增溶化合物等的情況下存在。可將宿主物種使用抗原免疫一次；兩次；三次；四次；五次；5-10次；10-20次；或超過20次。本發明的抗體不受克隆性(例如，單克隆、多克隆)限制。抗體可以粗制或純化形式使用。抗體可為多特異性或單特異性的。在優選的實施方案中，抗體能夠特異性識別用于產生抗體的抗原。在一些優選的實施方案中，本發明的抗體能夠特異性識別從酵母(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))細胞壁提取的(I — 4)-a-D-葡聚糖/(I — 6)-β-D-葡聚糖。在一些優選的實施方案中，本發明的抗體包括多克隆抗體。在一些實施方案中，本發明提供能夠識別酵母(I —4)-a_D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物的單克隆或多克隆抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物結合酵母細胞壁(I —4)-a-D-葡聚糖，但不結合除含酵母細胞壁(I —4)-a-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母細胞壁(I — 4)-α-D-葡聚糖、酵母細胞壁(I — 4)-α -/(I — 6)-β _D_葡聚糖、或其片段、變體或綴合物)之外的物質中存在的含(I — 4)-a -D-葡聚糖的部分。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物結合酵母細胞壁(I — 6) - β -D-葡聚糖，但不結合除含酵母細胞壁(I — 6)-β-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母細胞壁(I — 6)-β-D-葡聚糖、酵母細胞壁(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物)以外的物質中存在的含(I — 6)-β- -葡聚糖的部分。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物結合酵母細胞壁(I — 4)-α-/(I — 6)-β-D-葡聚糖，但不結合除酵母細胞壁(例如，酵母細胞壁(I— 4)-α-/(I— 6)-β-D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物)以外的物質中存在的含(I — 4)-α-/(I — 6)-β- -葡聚糖的部分。本發明的一些抗原檢測方法包括免疫檢測方法。在一些優選的實施方案中，免疫檢測方法包括ELISA。在一些實施例中，使用衍生自待分析的初始材料(例如，食品或飼料產品；飼料原料；其提取物)的樣品和一級抗體(例如，能夠識別酵母細胞壁組分的抗體；能夠識別酵母葡聚糖的抗體；能夠識別酵母(I — 4)-a -D-葡聚糖、酵母(I — 6)-β -D-葡聚糖、和/或酵母(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖的抗體)進行ELISA。在一些實施方案中，抗體直接連接到能夠產生可檢測的信號的物質(例如，生色物質、熒光物質、放射性標記同位素等)。在一些實施方案中，抗體直接或間接與另一能夠產生可檢測的信號的試劑(例如，生色物質、熒光物質、放射性標記、同位素等)締合。在一些實施方案中，本發明提供用于檢測樣品(例如，食品或飼料產品、飼料原 料、其提取物)中分析物(例如，抗原、酵母細胞壁組分、酵母葡聚糖、酵母(I —4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、和/或酵母(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖)的試劑盒。試劑盒組分可包括但不限于試劑、提取緩沖液、溶劑、洗滌劑、封閉劑、管、抗體、標準物、說明書、及其任何組合。在一些實施方案中，本發明提供服務，其中對待分析的初始材料(例如，食品或飼料產品、飼料原料、其提取物)獲得關于分析物(例如，抗原、酵母細胞壁組分、酵母葡聚糖、酵母(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6)-i3-D-葡聚糖、和/或酵母(I — 4)-α_/(I —6)-i3_D-葡聚糖)的濃度的信息。在一些實施方案中，由最終使用者(例如，農戶、牲畜所有者、牲畜管理者、牲畜飼養者、伴侶動物所有者、伴侶動物管理者、伴侶動物飼養者、獸醫、飼料或食物產品制造商、飼料或食物產品經銷商、監管官員)進行所述分析。在一些實施方案中，由最終使用者(例如，農戶、牲畜所有者、牲畜管理者、牲畜飼養者、伴侶動物所有者、伴侶動物管理者、伴侶動物飼養者、獸醫、飼料或食物產品制造商、飼料或食物產品經銷商、監管官員)將樣品或初始材料遞交給第三方，并且第三方進行所述分析。在一些實施方案中，第三方將有關分析結果的信息傳遞給最終使用者(例如，農戶、牲畜所有者、牲畜管理者、牲畜飼養者、伴侶動物所有者、伴侶動物管理者、伴侶動物飼養者、獸醫、飼料或食物產品制造商、飼料或食物產品經銷商、監管官員)。在一些實施方案中，第三方將關于分析結果的信息傳遞給第四方。基于本文所包含的教導，其他實施方案對相關領域的技術人員而言將是顯而易見的。


圖I示出制備葡聚糖級分P1、P2、P3以及SI、S2和S3的示意圖(參見例如實施例I)。圖2示出初始兔抗血清以及親和純化的抗血清的四份上清的響應。親和純化的抗血清通過將對β_(1，6)_葡聚糖特異的(Gab 1-Gab4)抗體分離到涂覆有BSA的微孔板獲得(參見例如實施例3)。
圖3示出使用純化的抗-(I — 4)-α-/(I — 6)-β-D-葡聚糖-BSA多克隆兔抗體構建的校準曲線，所述抗體使用本文所述的方法產生(參見例如實施例2和3)。圖4示出使用乳牛飼料材料中6個MYCOSORB包含水平進行5次測定所得的平均標準曲線。第二y_軸突出顯示標準曲線的日內(％CV#)和日間(％CVlW)重復性精密度。圖5示出使用雞飼料材料中6個MYCOSORB包含水平進行5次測定所得的平均標準曲線。第二 y_軸突出顯示標準曲線的日內(% CV內)和日間(％CVlW)重復性精密度。圖6示出使用豬飼料材料中6個MYCOSORB包含水平進行5次測定所得的平均標準曲線。第二 y_軸突出顯示標準曲線的日內(% CV內)和日間(％CVlW)重復性精密度。圖7示出對于多個微量滴定板分配從雞飼料中獲得的MYCOSORB產品信號扣除的干擾產品的平均光密度讀數(Λ OD450)差值(實施例7)。除MYCOSORB產品(100%，I. Okg/T)之外，以50%、100%、200% (w/w)添加干擾產品。 圖8示出對于單個微量滴定板分配從雞飼料中獲得的MYCOSORB產品信號扣除的干擾產品的平均光密度讀數(Λ OD450)差值(實施例7)。除MYCOSORB產品(100%，I. Okg/T)之外，以50%、100%、200% (w/w)添加干擾產品。圖9示出指示濃度為I : 100(頂部)或I : 200(底部)的單克隆抗體513A161. I的交叉反應性的ELISA測定結果。圖10示出指示濃度為I : 500(頂部)或I : 1000 (底部)的單克隆抗體513A161. I的交叉反應性的ELISA測定結果。圖11示出指示濃度為I : 1500(頂部)或I : 2000 (底部)的單克隆抗體513A161. I的交叉反應性的ELISA測定結果。圖12示出指示濃度為I : 100(頂部)或I : 200 (底部)的單克隆抗體513A431. I的交叉反應性的ELISA測定結果。圖13示出指示濃度為I : 500(頂部)或I : 1000 (底部)的單克隆抗體513A431. I的交叉反應性的ELISA測定結果。圖14示出指示濃度為I : 1500(頂部)或I : 2000 (底部)的單克隆抗體513A431. I的交叉反應性的ELISA測定結果。圖15示出以未稀釋或按I : I稀釋于PBS或PBS+3%脫脂奶粉中的形式固定到板上的三種酵母細胞壁提取物標準品的平均ELISA測定吸光度讀數和標準偏差(實施例6)。圖16示出針對實施例6中所述的ELISA微板涂覆時間和孵育溫度的飼料提取物標準曲線的圖。定義為了方便理解本發明，多個術語和短語定義如下如本文所用，術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”均是指通過共價“肽鍵合”連接的氨基酸的一級序列。一般來講，肽由數個氨基酸，通常2-50個氨基酸構成，并且比蛋白質短。術語“多肽”涵蓋肽和蛋白質。在一些實施方案中，肽、多肽或蛋白質是合成的，而在其他實施方案中，肽、多肽或蛋白質是重組的或天然存在的。合成肽是由體外人工方法制備的肽(即不是在體內產生的)。術語“糖蛋白”或“糖肽”是指包含一個或多個與多肽鏈共價連接的碳水化合物殘基的蛋白質或肽。術語“含硒蛋白”或“含硒肽”是指包含一個或多個硒原子的蛋白質或肽。通常，硒原子以在含硒氨基酸(包括硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸)內的形式摻入到蛋白質中。術語“含硒糖蛋白”、“含硒糖肽”或“SGP”是指摻入一個或多個硒原子的糖蛋白或糖肽。通常，“含硒糖蛋白”包含一個或多個含硒氨基酸。“含硒糖蛋白”可包含多個呈任何數量的不同形式的碳水化合物。術語“樣品”和“樣本”以其最廣泛的含義使用并且涵蓋從任何來源獲得的樣品或樣本。如本文所用，術語“樣品”用來指從動物(包括人類)獲得的生物樣品，并且涵蓋流體、固體、組織和氣體。在本發明的一些實施方案中，樣品包括包含植物來源的物質的樣品(青貯飼料、谷物、經加工的牲畜飼料、在制造中間階段的飼料產品)。然而，這些實例不應理解為限制可與本發明一起使用的樣品的類型。如本文所用，術語“酵母”和“酵母細胞”是指分類在真菌界、具有細胞壁、細胞膜 和細胞內組分的真核微生物。酵母并不形成特定的分類學或系統發育的分組。目前大約1，500個種是已知的；據估計，所有酵母種中僅有I %已進行描述。術語“酵母”經常被當作釀酒酵母的同義詞，但是酵母在子囊菌門和擔子菌門兩個門中的位置顯示了其系統發育多樣性。術語“酵母”涵蓋啤酒酵母、釀酒酵母和面包酵母。芽殖酵母(“真酵母”)被分類在酵母目。大多數酵母種通過出芽進行無性繁殖，但一些通過二分裂進行繁殖。酵母是單細胞的，但一些種通過形成連接的出芽細胞串而變為多細胞，所述連接的出芽細胞串稱為偽菌絲(pseudohyphae)或假菌絲(false hyphae)。酵母大小可根據種的不同變化很大,直徑通常測量為3-4 μ m,但一些酵母可達到超過40 μ m。如本文所用，術語“酵母細胞壁”也稱為“YCW”，是指酵母生物體的圍繞酵母的原生質膜和細胞內組分的細胞壁。酵母細胞壁包括酵母細胞壁的外層(主要是甘露聚糖)和內層(主要是葡聚糖和幾丁質)。細胞壁的作用是提供結構和保護酵母內部(其代謝活性中心)。信號傳導和識別通路位于酵母細胞壁中。酵母細胞壁的組成因菌株的不同而不同并根據酵母的生長條件變化。 如本文所用，術語“酵母細胞壁提取物”是指已經過破裂或裂解(例如，在破裂和裂解階段期間)并與酵母細胞的可溶性細胞內組分分離的酵母的酵母細胞壁。如本文所用，術語w/w (重量/重量)是指組合物中給定物質基于重量計的量。例如，包含O. 02% w/w的本發明膳食飼料補充劑的動物飼料意指該膳食飼料補充劑的質量為動物飼料的總質量的O. 02% (例如，907，200克的動物飼料中200克本發明膳食飼料補充劑組合物)。如本文所用，術語“純化的”或“以純化”是指從樣品移除一些組分。例如，通過移除非酵母細胞壁組分(例如，細胞質膜和/或酵母細胞內組分)來純化酵母細胞壁或酵母細胞壁提取物；還通過移除除酵母細胞壁之外的污染物或試劑來純化它們。移除非酵母細胞壁組分和/或非酵母細胞壁的污染物導致酵母細胞壁或其組分在樣品中的百分比增加。在分子水平上，術語“純化的”是指從其天然環境移除、分離或分隔的分子(例如，碳水化合物、糖蛋白)。因此“分離的碳水化合物”可為純化的碳水化合物。“基本上純化的”分子至少60 %、優選至少75 %、還更優選至少90 %不含有其他與其天然相關的組分。如本文所用，術語“純化的”或“以純化”還指從樣品移除污染物。移除污染蛋白質導致所關注的多肽在樣品中的百分比增加。此外，在植物、細菌、酵母或哺乳動物宿主細胞中表達并從其中純化重組多肽(例如，糖蛋白)并通過移除宿主細胞蛋白質來純化多肽；由此重組多肽在樣品中的百分比增加。如本文所用，術語“動物”是指屬于動物界的那些。這包括但不限于牲畜、農場動物、家養動物、伴侶動物或寵物、海洋和淡水動物、以及野生動物。如本文所用，術語“牲畜”也稱為“牲畜種”，還稱為“家養牲畜”，又稱為“商業飼養動物”，是指有意在農業或水產業環境下培養以生產食物或纖維、或為了獲得其勞動力或陪伴的馴養動物。如本文所用，術語“食物補充劑” “膳食補充劑” “膳食補充劑組合物”等是指配制成用作飲食的部分(例如，作為動物飼料的添加物)的膳食或營養補充劑的食物產品。本文描述了示例性膳食補充劑組合物。如本文所用，術語“試劑盒”用于指試劑和其他材料的組合。可以預想到試劑盒可包含諸如提取溶液、抗體和檢測試劑的試劑。術語“試劑盒”并不旨在限于試劑和/或其他材料的特定組合。
如本文所用，術語“毒性的”是指與在施用有毒物之前的相同細胞或組織相比對對象、細胞或組織的任何不利或有害效果。如本文所用，術語“冷凍干燥”和術語“凍干”以及術語“冷干”是指通過升華從呈凍結狀態的物質移除溶劑。這通過將待干燥的材料冷凍到其共熔點以下然后提供升華潛熱而實現。對熱輸入的精確控制允許從凍結狀態干燥而不會使產物回熔。在實際應用中，在減壓條件下加速并精確控制該過程。如本文所用，術語“自由流動干粉”是指自由流動的干粉，例如可從容器、包、器皿等傾倒而沒有大塊的阻礙的粉末。如本文所用，術語“研磨”是指通過沖擊、剪切或摩擦減小粒度。如本文所用，術語“洗滌”是指(例如，使用任何類型的溶質(例如，蒸餾水、緩沖液或溶劑)或混合物)移除或洗清制備物的雜質或不需要的可溶性組分(例如，可洗滌酵母細胞壁提取物以從樣品移除非酵母細胞壁組分；可洗滌微量滴定板的孔以移除非結合或非特異性結合的組分)。術語“抗體”或“免疫球蛋白”是指結合特異性抗原的蛋白質。免疫球蛋白包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合和人源化抗體、Fab片段、F(ab’)2片段，并且包括如下類別的免疫球蛋白186、18么、181、180、^^、以及分泌型免疫球蛋白(slg)。免疫球蛋白通常具有兩條相同的重鏈和兩條輕鏈。然而，術語“抗體”和“免疫球蛋白”也涵蓋單鏈抗體和雙鏈抗體。可由任何已知的方法制備抗體(參見例如Current Protocols in Immunology (1998)John Wiley and Sons, Inc. , N. Y.)。術語“抗原”是指可與對抗原分子的一部分特異的抗體反應的碳水化合物、蛋白質、糖蛋白、脂蛋白、脂質或其他物質。如本文所用，術語“分析物”是指原子、分子、原子和/或分子的分組、物質或化學成分。分析物本身不能進行測量，相反分析物的方面或性質(物理、化學、生物等)可使用諸如HPLC或NMR分析程序進行測定。例如，不能測量“椅子”(分析物組分)本身，但椅子的高度、寬度等可以測量。同樣，不能測量真菌毒素，但可以測量與其濃度相關的真菌毒素信號(例如，生色信號、熒光信號)。術語“免疫沉淀”、“免疫純化”和“親和純化”以及諸如動詞和形容詞的語法變型形式，是指使用抗體將其抗原或其抗原的部分與其他分子的混合物分離。
術語“免疫檢測”以及語法變型形式是指使用抗體從其他分子的混合物中鑒別抗原或其部分的存在。術語“染色”是指本領域人員已知的用于更好地顯現、辨別或鑒定材料(例如，樣品、飼料樣品、飼料樣品的提取物、細胞、細胞)的特定組分和/或特征的很多方法。術語“免疫熒光”是指用于通過本領域實施人員已知的程序鑒定、標記、標示、顯現或使易于看見的染色技術，其中配體(通常為抗體)與受體(通常為抗原)結合并且這種配體，如果為抗體，則綴合至熒光分子，或該配體然后被對該配體特異的抗體結合，并且所述抗體綴合至熒光分子，其中所述熒光分子可使用適當的儀器(例如，熒光顯微鏡)顯現。術語“抗原決定簇”是指抗原的與特定抗體接觸的那部分(例如，表位)。當蛋白質或蛋白質片段用于免疫宿主動物時，蛋白質的多個區域可引起產生與蛋白質上的給定區域或三維結構特異性結合的抗體；這些區域或結構稱為抗原決定簇。抗原決定簇可與完整抗原(用于引起免疫應答的“免疫原”)競爭與抗體結合。如本文所用，術語“免疫測定”是指旨在允許檢測樣品中抗原的定性或定量測試。·免疫測定通常利用抗原識別抗體。抗原識別抗體可直接或間接偶聯到視覺化步驟，例如生色或熒光標記或酶。免疫測定的實例包括但不限于酶聯免疫吸附測定(“ELISA”)、側向層析測試、蛋白質印跡、基于微粒的測定(例如，Luminex 測定)、磁性免疫測定、斑點印跡、酶免疫測定(EIA)、放射性免疫測定(RIA)、化學發光免疫測定(CLIA)、計數免疫測定(CIA)等。免疫測定可為競爭性或非競爭性的。如本文所用，術語“酶聯免疫吸附測定”或“ELISA”，有時稱為“夾心測定”，是指一種特定類型的免疫測定。通常，將未知量的抗原吸附或固定在固體表面上并暴露于能夠識別它的抗體。通常通過直接或間接連接到熒光或生色酶來測定結合的抗體的數量。ELISA的類型包括但不限于直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競爭性ELISA和反向ELISA。如本文所用，術語“ELISA”是指酶聯免疫吸附測定(或EIA)。多種ELISA方法和應用是本領域已知的，并且描述于很多參考文獻中(參見例如Crowther, Molecular Biomethods Handbook中“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)，，, Rapley 等(編輯)，第 595-617 頁，HumanaPress, Inc., Totowa, N. J. (1998) ；Harlow 和 Lane (編輯)，Antibodies A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) ；Ausubel 等(編輯)，CurrentProtocols in Molecular Biology,第11 章，John Wiley & Sons,Inc. ,New York(1994))。此外，存在多種市售ELISA測試體系。如本文所用，術語“食品”、“食料”、“飼料”、“飼料產品”、“飼料原料”等是指任何被消耗(例如，被動物消耗)并為飲食貢獻能量和/或營養的材料。實例包括但不限于全混合日糧(TMR)、草料、粒料、濃縮物、預混物副產品、谷物、酒糟、糖蜜、纖維、飼草、牧草、干草、籽粒、葉片、粗粉、可溶物和補充劑。飼料原料不受其物理形式限制。飼料原料可加工成較小粒度(例如，切碎的、剁碎的、研碎的、磨碎的等)；制成液體形式(例如，提取的、烹煮的、濃縮的、轉化成漿料或其他粘稠形式)；或加工成較大尺寸(例如，成捆的、固結的、壓縮的、或成形為復合形狀，例如粒狀、塊狀、方形、薄片狀等)。如本文所用，當用作名詞時，“添加劑”或“補充劑”是指添加到或以其他方式包含到另一物質或事物中的物質或事物。另外，如本文所用，當用作名詞時，詞語“添加劑”或“補充劑”在提及在供應給動物之前混合到動物飼料中的“添加劑”或“補充劑”時可互換使用。如本文所用，術語“葡聚糖”是指任何含葡萄糖的碳水化合物聚合物。在一些實施方案中，葡聚糖為D-葡萄糖的聚合物，其聚合度沒有限制、與其他聚合物共價或非共價連接、或確切的碳水化合物組合物。在葡聚糖聚合物的整個長度上，D-葡萄糖單元可參與α -鍵合、β -鍵合、或α -鍵合和β -鍵合兩種。如本文所用，術語“碳水化合物”用于指具有通式Cm(H2O)n的有機化合物。碳水化合物僅由碳、氫和氧原子組成，從而氫原子和氧原子的原子比為2 : I。如本文所用，術語“信號”通常用于指任何可檢測的指示反應已經進行(例如，抗體與抗原結合)的過程。可以設想到，呈放射性、熒光的或比色的產物/試劑形式的信號將都可與本發明一起使用。在本發明的多個實施方案中，對信號進行定性評估，而在替代實施方案中，對信號進行定量評估。如本文所用，術語“固相支撐物”用于指諸如抗體、抗原的試劑和其他測試組分附接的任何固體或固定材料。例如，在ELISA方法中，微量滴定板的孔提供固相支撐物。固相支撐物的其他實例包括顯微鏡載玻片、蓋玻片、小珠、顆粒、細胞培養瓶、以及很多其他合適的物品。 術語“特異結合”和“特異性結合”當用于指抗體和抗原之間的相互作用時，描述依賴于抗原上的特定結構(即抗原決定簇或表位)的存在的相互作用。換句話講，抗體識別并結合抗原特有的蛋白質結構，而不是結合大體上所有蛋白質(即非特異結合)。發明詳述酵母細胞壁(YCW)具有包含兩種主要多糖組分的復雜結構(I —2) (I —3)(I — 6)-a-D-甘露聚糖和(I — 3) (I — 6)-β-D-葡聚糖。這些多糖通過O-糖苷鍵和N-糖苷鍵與YCW蛋白質連接,如最近出版的評論(Lesage等(2006)Microbiol. Mol. Biol.Rev. 70 =317-343 ;其全文以引用方式并入本文)中所討論。在工業規模上，通常通過離心和洗滌從裂解的酵母生物體分離或提取YCW，如D. A. Howes和K. E. Newman所報道的(參見例如美國專利No. 6，045，834 ;其全文以引用方式并入本文)。在這一階段，YCW不溶于水。后續酶和化學處理初級YCW修飾多糖和蛋白質的結構，從而使得這些YCW組分至少部分地溶于水和二甲基亞砜“DMS0”中。產物的可溶性和不溶性部分的組成取決于處理條件。免疫測定包括可與這種復雜、非均一的混合物一起使用的靈敏分析技術。在本發明的一些方法實施方案中，來自已用包含酵母(I — 6)-β -D-葡聚糖的抗原免疫的動物的抗體識別這種多糖，從而允許建立穩健且靈敏的免疫測定，所述酵母(I — 6)-β-D-葡聚糖使細胞壁的所有主要結構組分相互連接(參見Κο ι·等(1997) J. Biol. Chem. 272 17762-17775 ;其全文以引用方式并入本文)。在本發明的一些實施方案中，定量免疫測定(ELISA)允許分析動物飼料樣品中的YCW衍生的營養添加劑MYCOSORB (ALLTECH,Inc.)。對來自YCW的(I— 6)-β-D-葡聚糖的測定在定量YCW方面是非常特異的，因為(I — 6) - β -D-葡聚糖在植物碳水化合物中是非常罕見的。因此，針對這種YCW多糖的抗體不與存在于動物飼料中的植物多糖進行顯著相互作用，從而確保較低測定背景。另外，本發明的一些實施方案還提供用于以下的方法1)從酵母細胞壁分離可溶性(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖(參見 Kwiatkowski 等(2009) J. Instit. Brew. 115 1031和Arvindekar等(2002) Yeast 19 :131_139，各自全文均以引用方式并入本文)，例如作為用于制備識別酵母(I — 4)-α-/(1 — 6)-i3_D-葡聚糖的抗體的抗原；使用Pfizner-Moffat 試劑(參見 Pfizner 等(1963) J. Am. Chem. Soc. 85 :3027 ;其全文以引用方式并入本文)氧化這種多糖的吡喃葡萄糖環C-6位的羥基基團，以便將其轉化成醛基(參見Zekovic等(2006) Chem. Papers60 :243-248 ;其全文以引用方式并入本文)；以及將這種氧化形式的(I —4)-α-/(1 — 6)-β-D-葡聚糖用于與牛血清白蛋白(BSA)的賴氨酸殘基的還原胺化反應(參見Abdel-Magid等(1996) J. Org. Chem. 61 :3849-3862 ;其全文以引用方式并入本文)，從而產生多糖-蛋白質綴合物。在一些實施方案中，本發明提供用于分離和純化(例如，使用離子交換、DEAE纖維素和不同離子強度的Na2HPO4緩沖液)(I —4)-α -/(I — 6) - β -D-葡聚糖-BSA綴合物的方法，所述(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖-BSA綴合物被用作動物(例如兔)免疫中的可溶性免疫原(參見Howard等(2001) Basic Methodsin AntibodyProduction and Characterization,CRC Press,第 11-18 以及31-50頁)。在一些實施方案中，本發明提供BSA-涂覆的親和相樹脂的制備方法(參見Matejtschuk (1997)Affinity Separations a Practical Approach, Oxford University Press)以及其在從包含對BSA特異的抗體和對(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖特異的抗體的兔血清中吸附對BSA特異的抗體的用途。在本發明的一些實施方案中，用于將多糖綴合至蛋白質的方法可用于制備人類和動物疫苗，因為這種方法保留了多糖的初始結構并且不像通常綴合方法那樣修飾其還原端(參見美國專利No. 6，596，861 ;其全文以引用方式并入本文)。 釀酒酵母細胞壁葡聚糖葡聚糖在釀酒酵母細胞壁多糖中是普遍的(參見Kwiatkowski等(2009)J. Instit. Brew. 115 :151-158)。有文獻記錄了(I — 3) - β-D-葡聚糖在保持酵母細胞壁形狀和剛度中的作用(參見 Klis 等(2006) Yeast23 :185-202 ;Lesage 等(2006)Microbiol.Mol. Biol. Rev. 70 :317-343 ;各自全文均以引用方式并入本文)以及(I — 6)-β -D-葡聚糖作為將所有細胞壁多糖連接在一起的多糖的作用(參見Aimaniada等(2009) J. Biol.Chem. 284 :13401-13412 ；Kollar 等(1997)J. Biol. Chem. 272 :17762-1777 ；Klis 等(2002)FEMS Microbiology Rev. 26 :239-256 ;各自全文均以引用方式并入本文)。在早期酵母文獻(參見 Gunja-Smith 等(1974)Biochem. Biophys. Res. Com. 56 :588-592 ；Grba 等(1975)Appl. Microbiol. Biotechnol. 2 :29-37 ;各自全文均以引用方式并入本文)中頻繁提及有氧生長的釀酒酵母細胞中可溶性和不溶性糖原樣(I — 4)-α-D-葡萄糖的存在，并且已經鑒定兩種形式的糖原合成酶(參見Gunja-Smith等(1977) J. Bacteriol. 130 :818-825 ；Rothman-Denes等(1970)PNAS 66 :967-974 ;各自全文均以引用方式并入本文)。糖原是由釀酒酵母累積的能量儲備碳水化合物，其可在酵母饑餓階段期間動用。其為a-D-葡萄糖的聚合物，其分子量為 IO8并且其支化結構具有通過I — 4鍵合連接的10-14個a _D_葡萄糖的殘基(參見 Aklujkar 等(2008) J. Instit. Brew. 114 :205-208 ;Boulton 等(2001)The Biochemistry of Fermentation. In Brewing Yeast and Fermentation, BlackwellScience, Iowa,第89_92頁；各自全文均以引用方式并入本文)。酵母細胞壁中(I— 4)-a-D-葡聚糖含量可從少至干重的I % (參見Lille等(1980) J. Bacteriol. 143 :1384-1394)變化到多達干重的 29% (參見 Sedmak 等，美國專利申請No. 2006/0263415 ;其全文以引用方式并入本文)，取決于細胞的營養狀態、分離方法、環境條件以及收獲細胞的時間(參見Lille等(1980) J. Bacteriol. 143 :1384-1394)。工業上產生的啤酒酵母細胞(參見Sedmak等，美國專利申請No. 2006/0263415 ;其全文以引用方式并入本文)包含28.9%干重(d.w.)濃度的葡聚糖，其包括12.4% d. w.的(I — 4)-a-D-葡聚糖。當使用堿性蛋白酶處理這些細胞時，水不溶性的細胞壁組分包含54.5% d. w.的葡聚糖和超過該重量一半的(I —4)-a-D-葡聚糖(29. 2% d. w.)。在2002 年，Arvindekar 和 Patil (參見 Arvindekar 等(2002) Yeast 19:131-139;其全文以引用方式并入本文)基于其如下發現(I — 4) - a -D-葡聚糖與(I — 6) - β -D-葡聚糖共價連接，提出了關于酵母細胞壁內存在已被其他人定義為“難以洗滌掉的”酵母糖原(參見Fleet等(1976)J. Gen. Microbiol. 94 :180-192 ;其全文以引用方式并入本文)的不溶性部分的解釋。然而，這與Kollar和合作者發表的1997論文(參見Kollcir等(1997) J. Biol. Chem. 272 :17762-17775 ;其全文以引用方式并入本文)并且與Aimaniada和合作者發表的關于(I —6)-i3-D-葡聚糖在酵母細胞壁內的作用和結構的工作(參見Aimaniada 等(2009) J. Biol. Chem. 184 :13401-13412 ;其全文以引用方式并入本文)不一致。值得注意的是，Arvindekar和Patil的發現需要結構驗證,因為作者使用來自酵母細胞壁的酶水解的微小片段進行研究，并且未使用NMR對其分離的產物進行定量或結構歸屬。在開發本發明實施方案的過程中進行的實驗中，開發了大規模分離方法以從釀酒酵母細胞壁分離混合(I — 4) - a -D-葡聚糖/ (I — 6) - β -D-葡聚糖多糖，并且使用核磁共振(NMR) 光譜法確定該產物的結構。動物食物和飼料動物飼料是特別地用于喂養馴養牲畜(例如，牛、山羊、綿羊、馬、家禽、野牛、羊駝、美洲駝、驢、騾、兔、雞、鵝、火雞和豬)的任何食料。動物飼料通常包括干草、稻草、青貯飼料、壓縮和顆粒飼料、油類和混合日糧、以及發芽谷物和豆類。2006年全世界的動物飼料行業消耗635百萬噸飼料，年增長率為約2%。使用農用地來種植飼料而不是人類食物可為具有爭議的；一些類型的飼料如玉米(corn)(玉米(maize))也可用作人類食物,而諸如牧草的其他飼料不能。除了給動物提供能量源，動物飼料還提供身體利用的營養素(例如，硒)。動物飼料通常在供給動物之前與補充劑和/或添加劑(例如，MYCOSORB)混合。免疫檢測方法本發明提供用于檢測樣品中物質的方法，這種方法包括免疫檢測測定或免疫測定。免疫測定(免疫檢測測定、免疫檢測方法)涉及使用用于檢測(視覺化、定性鑒定、定量檢測)與抗體結合的物質(例如，抗原)的抗體。被抗體識別的抗原可為大分子或其片段(例如，聚合物、碳水化合物、糖蛋白、蛋白質、其部分或單體)。例如，本發明的一些方法可用于檢測酵母細胞壁葡聚糖(例如，(I —4)-a-D-葡聚糖、(I — 6)-β-D-葡聚糖、和/或(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖)。多種免疫測定可用于定性或定量檢測物質(例如，以低濃度存在的物質、存在于復雜混合物中的物質、碳水化合物物質、酵母(I —4)-a-D-葡聚糖、酵母(I —6)-β-D-葡聚糖、酵母(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖)。免疫測定的類型包括但不限于酶聯免疫吸附測定(ELISA)、側向層析測試、蛋白質印跡、基于微粒的測定(例如，Luminex 測定)、磁性免疫測定、斑點印跡、酶免疫測定(EIA)、放射性免疫測定(RIA)、化學發光免疫測定(CLIA)、計數免疫測定(CIA)等(參見例如 Wild 等(2005) “The Immunoassay Handbook,第3版”，Elsevier Ltd.，Oxford, UK)。免疫測定可為競爭性或非競爭性的。酶聯免疫吸附測定(ELISA)酶聯免疫吸附測定，“ELISA”已經用作醫學和植物病理學、以及各行業中質量管理檢驗中的診斷工具。在一個實例中，典型的ELISA包括首先固定在聚苯乙烯微板或其他表面上的探針分子。然后施加諸如BSA的封閉劑并孵育。使包含未知濃度的特定目標分子(通常為蛋白質)的生物樣品或其他樣品與固定的探針分子接觸。如果存在，目標分子被探針捕獲，并與目標分子的濃度成比例。然后，通常使用溫和洗滌劑溶液洗滌表面以移除任何不是特異性結合的分子。然后，施加諸如第二抗體的另外的分子，從而形成具有捕獲探針、目標分子和標記的檢測探針的“夾心”復合物。第二分子通常稱為檢測探針或檢測抗體，并且一般與酶、半抗原或其他標記分子共價連接。在最終洗滌步驟之后，通過添加與標記的檢測抗體結合并包含酶底物、熒光標記的檢測試劑、或多種其他報告物的綴合物來使板顯影。所述報告物產生與樣品中目標抗原的量成比例的可檢測信號。通常，使用比色或熒光讀板儀讀取ELISA讀數，并且每個孔產生單個目標分析物測量結果。ELISA測定的其他變型形式包括但不限于間接、競爭性、或反向ELISA (參見例如 Crowther 等(2008) “The ELISA Guidebook,第 2 版”，Humana Press)。
在很多情況下，在制成用于匹配使得可以通過自動化儀器實現處理的標準化格式的微板中進行ELISA。這些標準由生物分子科學學會(SBS)建立并被稱為SBS標準。根據SBS標準，多孔板的“覆蓋區”為大約85mmX 125mm，其中孔以根據孔總數的特定位置格式設置。美國國家標準協會(ANSI)已公布微板的SBS標準為“覆蓋區域尺寸”(ANSI/SBS1-2004)、“高度尺寸”(ANSI/SBS 2-2004)、“底部外緣尺寸”(ANSI/SBS 3-2004)以及“孔尺寸”(ANSI/SBS 4-2004)。最常見地，ELISA使用者在單個板中采用96-孔。作為另外一種選擇，當測定中需要少于96-孔，可采用最多12個8-孔“條”從而使得一次僅使用96-孔的一部分。測試服務在一些實施方案中，使用基于計算機的分析程序來將測定(例如，免疫測定、ELISA)產生的原始數據(例如，抗原的存在、不存在、或量)(例如，酵母(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖)轉化成對最終使用者(例如，牲畜或伴侶動物飼養者或管理者、獸醫、農戶、消費者)而言具有預測價值的數據。最終使用者可使用任何合適的方式訪問預測數據。因此，在一些實施方案中，本發明提供進一步的有益效果，即不大可能受過免疫測定分析訓練的最終使用者不需要理解原始數據。數據直接以其最有用的形式呈現給最終使用者。然后最終使用者能夠立即利用該信息以便優化對對象(例如，牲畜或伴侶動物)的護理。本發明設想到任何能夠接收、處理和與進行測定的實驗室來回傳遞有關樣品的信息的方法。例如，在本發明的一些實施方案中，獲得樣品(例如，飼料樣品、飼料樣品的提取物)并遞交給位于世界的任何地方(例如，在對象所在的國家或最終使用信息的國家相一致或不同的國家)的分析服務機構(例如，實驗室等)以產生原始數據。最終使用者可讓第三方獲得樣品(例如，飼料提取物)并遞送至分析中心(profiling center),或者對象可自行收集樣品并直接將其遞送至分析中心。當樣品包含此前確定的信息時，最終使用者可將該信息直接遞送至分析服務機構(例如，可通過計算機掃描包含所述信息的信息卡片并使用電子通信系統將數據傳送至分析中心的計算機)。一旦被分析服務機構接收，就對樣品進行處理并產生特定于最終使用者所需的診斷或預后信息的特征圖(例如，抗原含量)。然后將特征圖數據準備成適于最終使用者解讀的格式。例如，與提供原始數據相反，準備的格式可向最終使用者體現風險評估(例如，抗原存在的可能性)，同時為特定牲畜護理選擇提供建議。數據可通過任何合適的方法展示給最終使用者。例如，在一些實施方案中，分析服務機構產生可為最終使用者打印(例如，在接觸的地點、在牲畜護理的地點)的報告或可在計算機顯示器上展示給最終使用者的報告。在一些實施方案中，首先在牲畜護理的地點或在地區設施處分析信息。然后將原始數據遞送至中央處理設施以進行進一步的分析和/或將原始數據轉化成最終使用者或其他感興趣的相關方可用的信息。中央處理設施提供隱私(所有數據均以統一的安全協議保存在中央設施中)、速度和數據分析的一致性的優點。然后中央處理設施在與最終使用者通信后可控制數據的命運。例如，使用電子通信系統，中央設施可將數據提供給最終使用者。在一些實施方案中，最終使用者能夠使用電子通信系統直接訪問數據。最終使用者可基于結果尋求進一步的建議。在一些實施方案中，數據用于研究用途。例如，數據可用于進一步優化牲畜或伴侶動物的營養方案。 組合物和試劑盒用于(例如，足夠用于、必要用于、或可用于)本發明的一些實施方案的方法中的組合物包含用于檢測特定抗原(例如，酵母(I —4)-a-D-葡聚糖、酵母(I —6)-β-D-葡聚糖、酵母(I —4)-α-/(1 —6)-β_ -葡聚糖)的存在與否的試劑。這些組合物中的任何者，單獨或與本發明的其他組合物組合，可以試劑盒的形式提供。試劑盒可另外包含適當的對照和/或檢測試劑。抗原-載體綴合在一些實施方案中，本發明提供可用于分析(例如，免疫學分析；用于抗體制備)酵母細胞壁物質的組合物(例如，抗原)。在一些實施方案中，本發明提供用于以下的方法從酵母細胞壁分離可溶性(I — 4)-α -/(I — 6)-β -D-葡聚糖(參見Kwiatkowski等(2009) J. Instit. Brew. 115 :1031 ;Arvindekar 等(2002) Yeast 19 :131-139 ;各自全文均以引用方式并入本文)作為酵母(I — 6)-β -D-葡聚糖的抗原；使用Pfizner-Moffat試劑(參見Pfizner等(1963) J. Am. Chem. Soc. 85 :3027 ;其全文以引用方式并入本文)氧化這種多糖的吡喃葡萄糖環C-6位的羥基基團，以便將其轉化成醛基(參見Zekovic等(2006)Chem. Papers 60 :243-248 ;其全文以引用方式并入本文)；以及將這種氧化形式的(I —4)-α-/(1 — 6)-β-D-葡聚糖用于與載體(例如，載體蛋白質如BSA)的賴氨酸殘基的還原胺化(參見Abdel-Magid等(1996) J. Org. Chem. 61 =3849-3862 ;其全文以引用方式并入本文)反應，從而產生多糖-載體綴合物。在一些實施方案中，本發明涉及應用分離技術(例如，離子交換、DEAE纖維素和不同離子強度的Na2HPO4緩沖液)分離純抗原(例如，(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖-BSA綴合物)，該純抗原被用作免疫動物(例如，免疫兔)的可溶性免疫原(參見 Howard 等(2001) “Basic Methods in Antibody Productionand Characterization”，CRC Press,第 11-18 以及 31-50 頁)。在一些實施方案中，本發明還涉及制備 BSA 涂覆的親和相(參見 Matejtschuk(1997) “AffinitySeparations APractical Approach”,Oxford University Press)以及其在從包含載體(例如，BSA)抗體和抗原(例如，(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-匍聚糖)抗體的抗血清(例如，兔抗血清)中吸附對載體特異的(例如，對BSA特異的)抗體從而有利于所得抗體制品的特異性的用途。在本發明的一些實施方案中，用于將多糖綴合至載體(例如，蛋白質載體如BSA)的方法可用于制備人類和動物疫苗，因為這種方法保留多糖結構，而不是如典型綴合方法那樣引起還原端修飾(參見Moreau等，美國專利No. 6，596，861 ;其全文以引用方式并入本文)。在多糖或寡糖用作抗原之前，其弱抗原性通常需要改性。在本發明的一些實施方案中，開發出合成方法，其中將多糖抗原(包含(I —6)-β-D-葡聚糖)綴合至源于或來源于與用于免疫的物種不同的動物物種的載體(例如，蛋白質載體如BSA)(參見Howard等(2001) “Basic Methods in Antibody Production and Characterization，，，CRCPress,第 11-18 頁及 31-50 頁；Matejtschuk(1997) “Affinity Separations A PracticalApproach”，Oxford University Press)。雖然本發明不受所用載體的性質或類型限制,但BSA因為其商業可得性和存在五個賴氨酸殘基而是有利的，所述五個賴氨酸殘基中的每一個均具有可通過多種化學方法與多糖或寡糖綴合的單個游離氨基基團(參見Abdel-Magid等(1996)J. Org. Chem. 61 :3849-3862 ；Lees 等(1996)Vaccine 14 190-198 ；Pawlowski 等(1999) Vaccine 17 :1474-1483 ;各自全文均以引用方式并入本文)。在一些優選實施方案中，抗原的碳水化合物部分和將用于綴合的載體均為水溶性的。在一些實施方案中，抗原 (例如，(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖多糖)的碳水化合物部分的還原端醛基并不用于直接綴合至載體(例如，BSA)，因為那樣做將顯著改變多糖抗原的結構和結合容量。在一些實施方案中，本發明通過應用乙酸酸酐/ 二甲基亞砜(Ac20/DMS0)體系(參見Zekovic等(2006)Chem. Papers 60 :243-248 ;其全文以引用方式并入本文)在除C3之外的位置氧化使得最大程度地保留碳水化合物部分的結構。在一些實施方案中，本發明提供使用酵母細胞壁組分(例如，來自釀酒酵母細胞壁的可溶性(I — 4)-α-/(1 — 6)-i3_D-葡聚糖)合成將用于制備抗體(例如，多克隆抗體)的抗原(例如，(I —4)-a-/(l —6)-i3_D-葡聚糖_BSA(牛血清白蛋白))綴合物的方法。在一些實施方案中，本發明提供免疫原性組合物，該組合物包含(I —4)-α_/(I — 6) - β -D-葡聚糖和/或包含(I — 4) - α _/ (I — 6) - β _D_葡聚糖的綴合物(例如，蛋白質或糖綴合物)。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物可用于檢測所關注樣品(例如，動物飼料樣品或其衍生物、部分或提取物)中酵母細胞壁產物。在一些實施方案中，本發明的組合物是通過例如酸性提取(參見Kwiatkowsk等(2009) J. Instit. Brew. 115 :1031 ；其全文以引用方式并入本文)從富含葡聚糖的材料或富含葡聚糖的產品(GEM，ALLTECH,Inc. ,Nicholasville,KY,USA)提取的。在一些實施方案中，使用二甲基亞砜(DMSO)/乙酸酸酐(Ac2O)混合物(參見Pfizner等(1963) J. Am. Chem. Soc. 85 :3027 ;其全文以引用方式并入本文)在卩比喃匍萄糖環的C_6位溫和氧化多糖(例如，(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-匍聚糖)將C-6羥基亞甲基(-CH2OH)基團轉化成醛(-CH = 0)基(參見Zekovic等(20060Chem. Papers 60 :243-248 ;其全文以引用方式并入本文)，并使得氧化形式的抗原(例如，(I — 4)_ α -/(I — 6)-β -D-葡聚糖)能夠進入與載體(例如，BSA)的還原胺化(參見Moreau 等，美國專利 No. 6，596,861 ;Abdel_Magid 等(1996) J. Org. Chem. 61 :3849-3862 ;各自全文均以引用方式并入本文)。本發明的綴合方法(例如，包括在C6-0H的多糖活化)提供完全保守的多糖部分初始結構，并且因而有利于抗原制備。包括但不限于高碘酸鹽氧化(參見Hay等(1973)Methods Carb. Chem. 5 :357-370 ;其全文以引用方式并入本文)或CDAP活化(參見Lees等(1996)Vaccine 14:190-198)的多糖或寡糖活化替代方法產生顯著改性的多糖，從而損害其作為抗原的實用性。抗體本發明的另一個方面是制備用于檢測酵母細胞壁組分(例如，酵母(I — 4) - a -D-葡聚糖、酵母(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖)的測定中的免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步驟用酵母細胞壁組分(例如，酵母(I —4)-a-D-葡聚糖、酵母(I —6)-β-D-葡聚糖、酵母(I — 4) - α-/(I — 6) - β-D-葡聚糖、(I — 4)-α -/(I — 6)-β -D-葡聚糖-BSA、或其其他片段、變體或綴合物)免疫對象和從接受者分離免疫球蛋白。通過這種方法制備的免疫球蛋白是本發明的另一個方面。用于多克隆抗體制備的接種物通常通過以下方式來制備將抗原組合物分散于諸如鹽水或其他佐劑的生理上可耐受的稀釋劑中以形成水性組合物。將免疫刺激量的接種物施用給對象，然后使接種的對象保持足以使抗原組合物引起保護性抗體的時間。 抗體可以諸如親和色譜法(參見例如Harlow和Lane, Antibodies ;a LaboratoryManual (1988)Cold Springs Harbor Laboratory Press)的熟知技術所需的程度進行分離。抗體包括來自多種常用動物(例如，山羊、靈長類、兔、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人)的抗血清制劑。從動物取血并回收血清。根據本發明制備的免疫球蛋白可包括完整抗體、抗體片段或亞片段。抗體可為任何類別的完整免疫球蛋白例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、嵌合抗體或對本發明的兩種或更多種抗原具有雙特異性的雜合抗體。它們也可為片段，例如F (ab’)2、Fab’、Fab、Fv等，包括雜合片段。或者，可以使用本領域已知的方法改變描述用于制備單鏈抗體的技術以適合制備特異性結合特定抗原的單鏈抗體。具有相關特異性但具有不同個體基因型組成的抗體可通過從隨機組合免疫球蛋白文庫進行鏈改組而產生(參見例如Burton, Proc. Natl. Acad.Sci.88,1112023,1991)。單鏈抗體也可使用雜交瘤cDNA作為模板、使用諸如PCR的DNA擴增方法來構建(參見例如Thirion等，1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11)。單鏈抗體可為單特異性或雙特異性的，并且可為二價或四價的。四價、雙特異性單鏈抗體的構建在例如Co I oma&Morr i son, 1997, Nat. Biotechnol. 15,159-63 中提出。二價、雙特異性單鏈抗體的構建在例如 Mallender & Voss, 1994，J. Biol. Chem. 269，199-206 中提出。可使用人工或自動化核苷酸合成構建編碼單鏈抗體的核苷酸序列，使用標準重組DNA方法克隆到表達構建體中，并導入細胞中以表達所述編碼序列，如下所述。或者，單鏈抗體可使用例如絲狀卩遼菌體技術(參見例如Verhaar等，1995, Int. J. Cancer 61,497-501 ；Nicholls 等，1993, J. Immunol. Meth. 165,81-91)直接制備。特異性結合特定抗原的抗體也可以通過以下方式來制備誘導淋巴細胞群中的體內產生或篩選免疫球蛋白文庫或高度特異性結合反應物的組，如文獻(參見例如Orlandi等，Proc. Natl. Acad. Sci. 86，38333837，1989 ;Winter 等，Nature 349,293 299，1991)中所公開的。嵌合抗體可如WO 93/03151中所公開的來構建。還可以制備衍生自免疫球蛋白并且為多價和多特異性的結合蛋白，諸如W094/13804中所述的“雙抗體”。可通過本領域熟知的方法純化抗體。例如，可通過使抗體通過結合有相關抗原的柱來親和純化所述抗體。然后可使用具有高鹽濃度的緩沖液從柱上洗脫結合的抗體。可將本發明的免疫原性組合物施用給對象，該對象然后充當免疫球蛋白源，所述免疫球蛋白響應于特定免疫原性組合物的激發而產生。如此處理的對象將提供血漿，通過常規血漿分級分離方法將從該血漿中獲得超免疫球蛋白。本發明的組合物包括但不限于可為任何類別的完整免疫球蛋白(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、嵌合抗體)的抗體(例如,單克隆和/或多克隆抗體)或對本發明的兩種或更多種抗原具有特異性的雜合抗體。它們也可為片段，例如F (ab’)2、Fab’、Fab、Fv等，包括雜合片段。制備單克隆抗體的方法是本領域熟知的并且可包括融合脾細胞與骨髓瘤細胞(參見例如 Kohler 和 Milstein 1975 Nature 256 ;495 ;Harlow 和 Lane, Antibodies ;aLaboratory Manual (1988) Cold Springs Harbor Laboratory Press)。或者，可通過篩 選合適的曬菌體展示文庫而獲得單克隆Fv片段(參見例如Vaughan TJ等1998 NatureBiotechnology 16 ;535)。單克隆抗體可通過已知方法進行人源化或部分人源化。在本發明的一些實施方案中，抗體組合物能夠識別酵母細胞壁抗原(例如，能夠識別酵母(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母(I — 6)-i3_D-葡聚糖、酵母(I — 4)-α-/(I — 6)_β -D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物的單克隆或多克隆抗體)。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物結合酵母細胞壁(I — 4) - a -D-葡聚糖，但不結合除含酵母細胞壁(I — 4)-a-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母細胞壁(I — 4)-a-D-葡聚糖、酵母細胞壁(I —4)-α-/(1 — 6)-β-D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物)之外的物質中存在的含(I — 4) - a -D-葡聚糖的部分。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物結合酵母細胞壁(I— 6)-β-D-葡聚糖，但不結合除含酵母細胞壁(I— 6)-β-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母細胞壁(I — 6) - β -D-葡聚糖、酵母細胞壁(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物)以外的物質中存在的含(I — 6)-β- -葡聚糖的部分。在一些實施方案中，本發明的抗體組合物結合酵母細胞壁(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖，但不結合除酵母細胞壁(例如，酵母細胞壁(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖、或其片段、變體或綴合物)以外的物質中存在的含(I — 4)-α-/(I — 6)-β-D-葡聚糖的部分。
實施例提供以下實施例是為了展示和進一步說明本發明的某些優選實施方案和方面，而不應理解為限制本發明的范圍。實施例I從食品級釀酒酵母酵母細胞壁β_葡聚糖中提取(I —4)_ α-/(1 — 6)-β-D-葡聚糖酵母細胞壁葡聚糖制備使用去離子水將通過酶/堿性/熱處理由釀酒酵母制備的工業級(I — 6)-β-D-葡聚糖(ALL-BGY, ALLTECH, Inc.，Nicholasville, KY, USA)洗滌四次以移除任何可溶性殘余物。在冷凍干燥之后，獲得“富含葡聚糖的材料”(“GEM”)。酵母細胞壁葡聚糖的酸性消化
圖I 不出各種級分的制備。如 Kwiatkowski 等(2009) J. Instit. Brew. 115 151-158(其全文以引用方式并入本文)中所述進行酵母細胞壁葡聚糖的酸性消化。在80°C下將“富含葡聚糖的材料” (“GEM”)(70g)用700mL的IOOmM HCl (pH 2. 2)進行水解6h。這之后，將混合物以13，500Xg/10°C /IOmin離心并收集上清液。將沉淀物用150ml去離子水提取兩次并凍干，獲得57. 9g的白色無定形產物(Pl)。將兩次洗滌物與初始上清液合并并用2N NaOH中和至pH 7.0。通過離心收集形成的沉淀(沉淀物Pl/7)(凍干后1.82g)并且在低于37°C的溫度下使用Buchi真空旋轉蒸發器將上清液濃縮至450ml體積。使用5kDa AMICON 15超濾離心裝置(MilliporeCorporation,Delaware USA)將該溶液進一步濃縮。通過使用兩份等體積的去離子水并使用相同的超濾裝置離心兩次來洗滌濃縮物( 150mL)，以移除鹽和酸水解所產生的低分子量組分。將經洗滌的濃縮物(SI)凍干，獲得7. 5g的白色無定形產物。使用與第一次O. INHCl提取中相同比率的試劑和條件對沉淀物Pl的一部分進行第二次提取。將這些產物凍干從而獲得P2和S2。使用O. IN HCl的第二次提取在對上清液進行中和之后并未產生沉淀。使用與第一次O. IN HCl提取中相同比率的試劑和條件對沉淀物P2的一部分進行第三次提取，并且將產物凍干從而獲得P3和S3。使用O. IN HCl的第三次提取在對上清液進行中和·之后并未產生沉淀。通過使用1H NMR光譜學確定來自O. IN HCl提取的可溶性和不可溶性級分的碳水化合物組成和多糖結構。使用H2SO4-HPLC組成分析(參見Dallies等(1998)Yeast 14 =1297-1306 ;其全文以引用方式并入本文)分析樣品中的甘露糖和葡萄糖含量。使用LECO燃燒分析并通過將氮含量乘以因子6. 25來計算蛋白質含量的估計量。實施例2抗原制備(I — 4)-α-/(I — 6) - β _D_ 葡聚糖制劑的 Ac20/DMS0 氧化將580毫克‘可溶性’葡聚糖放置在配備有磁力攪拌棒并用橡膠隔片密封的22ml玻璃小瓶中。在室溫下并在攪拌下，使用玻璃注射器向該小瓶中添加IOml無水DMSO和110 μ I乙酸酸酐。在20°C下，葡聚糖懸浮液在4h攪拌內完全溶解。繼續攪拌混合物24h，在這之后，用40ml水稀釋反應混合物。使用30kDa Amicon 15超濾離心裝置濃縮所得澄清溶液，并將過濾器上的殘余物洗滌五次，每次使用12ml去離子水，從而從溶劑和反應物中分離和純化氧化產物。所有離心均以4，750Xg/30min/10°C進行。收集過濾器上的最終殘余物并冷凍干燥，從而獲得502mg白色粉末形式的氧化的(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖。該產物部分溶于水中并完全溶于DMSO中。元素分析氧化的葡聚糖的實測值C_40.05%；H-6. 61%。C6H8O5X H2O 的計算值C_40. 48%；H-5. 66%氧化的(I— 4)-α-/(I— 6)-β-D-葡聚糖與BSA的還原胺化將412mg氧化的(I — 4) - α-/(I — 6) - β-D-葡聚糖樣品溶解于20ml去離子水中，然后在磁力攪拌下與256mg BSA于2ml去離子水中的溶液混合。然后使用60mg氰基硼氫化鈉固體處理該混合物。將反應小瓶用橡膠隔片密封，并將混合物在20°C下攪拌24h。這之后，添加IOOmg硼氫化鈉并將混合物再攪拌22h。然后通過30kDaAmicon 15超濾離心裝置以4，750Xg/30min/10°C過濾該澄清溶液。在過濾器上洗滌殘余物四次，每次使用12ml水，并將最終濃縮物凍干，從而獲得573mg白色粉末。元素分析C 45. 01%、H 6. 40%、N 2. 11%。(I — 4) - α -/ (I — 6) - β D-葡聚糖-BSA綴合物的DEAE纖維素離子交換色譜分離將400mg粗制綴合物于5ml的5mM Na2HPO4中的溶液引入至2 X 55cm玻璃色譜柱頂部，該色譜柱包含于5mM Na2HPO4中的50gDEAE纖維素。使用不同濃度的Na2HPO4洗脫以下物質40. Img(I — 4)-α-/(1 — 6)-β_ -葡聚糖(220ml, 5mM) ;132.3mg 純(I — 4)-α-/(I — 6) - β -D-葡聚糖-BSA 綴合物(280ml，55mM);和 96. 7mgBSA (80ml，IOOmM)。使用 30kDaAMIC0N15超濾離心裝置將純(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-葡聚糖-BSA綴合物溶液濃縮至2ml體積,使用去離子水洗滌并凍干,從而獲得132. 3mg(24. 4%的總產率)白色粉末樣產物。凝膠電泳產生通過使用考馬斯藍和PAS染色揭示的寬帶，其中央位于 170kDa處。在電泳圖中未檢測到游離BSA或任何其他雜質。元素分析C 40. 11%, H 6. 23%, N 3. 06%, (20. 44w% BSA) 計算的 β -葡聚糖BSA 的比率為4 I。實施例3多克隆抗體制備和純化抗原制備和兔免疫將IOmg如實施例2中所述制備的BSA-綴合的抗原凍干，保存在4°C下，并用于免疫三只兔(每次免疫200 μ g抗原)。免疫方案如表I中所列。表I.用于在兔中產生抗-(I— 4)-α-/(I— 6)-β-D-葡聚糖-BSA多克隆抗體的免疫方案。
權利要求
1.一種用于檢測樣品中酵母細胞壁的方法，包括 -提供樣品； _將所述樣品暴露于能夠結合選自(I — 4) - a-D-匍聚糖、(I — 6) - β-D-匍聚糖和(I — 4)-α-/(I — 6) - β -D-葡聚糖的抗原的一級抗體，從而形成一級抗體-抗原復合物；和 -使用二級抗體檢測所述一級抗體和所述抗原之間的結合程度。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述樣品衍生自選自以下的物質牲畜飼料、伴侶動物飼料、飼料原料、全混合日糧(TMR)、草料、飼料顆粒、飼料濃縮物、飼料預混物副產品、谷物、酒糟、糖蜜、纖維、飼草、牧草、干草、籽粒、葉片、粗粉、可溶性飼料、飼料補充劑、以及其制備中間體。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述衍生通過提取所述物質以獲得所述樣品而實現。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述提取使用選自以下的步驟進行酸提取、堿提取、有機提取、物理加工、及其組合。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述提取使用有機溶劑和酸進行。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述提取使用二甲基亞砜和鹽酸進行。
7.根據權利要求4所述的方法，其中所述提取步驟還包括在高于室溫的溫度下孵育。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述孵育在75°C和85°C之間進行。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述一級抗體對所述抗原單特異的。
10.根據權利要求I所述的方法，其中所述一級抗體為多克隆抗體。
11.根據權利要求I所述的方法，其中檢測所述抗體和所述抗原之間的所述結合程度在二級抗體的輔助下進行，所述二級抗體綴合至選自酶、熒光材料、生色材料、和放射性標記同位素的物質。
12.根據權利要求I所述的方法，其中所述二級抗體能夠與所述一級抗體形成復合物。
13.根據權利要求I所述的方法，其中所述樣品固定在剛性支撐物上。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述剛性支撐物包括多層板的孔。
15.根據權利要求I所述的方法，其中所述一級抗體和所述抗原之間的結合的所述檢測通過確定與所述樣品中結合所述一級抗體-抗原復合物的所述二級抗體的存在相對應的信號的水平而實現。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述信號選自生色信號、熒光信號、基于尺寸檢測的分子、基于吸光度檢測的分子、輻射、和同位素信號。
17.根據權利要求I所述的方法，其中所述檢測使用ELISA免疫測定進行。
18.一種用于制備包含酵母細胞壁碳水化合物的免疫原性組合物的方法，包括 -提供包含酵母細胞壁的樣品； -使用選自酸處理、堿處理和物理處理的動作從所述樣品中提取所述酵母細胞壁碳水化合物；和 -從所述樣品分離所述酵母細胞壁碳水化合物，其中所述酵母細胞壁碳水化合物為選自(I — 4) - a -D-匍聚糖、(I — 6) - β -D-匍聚糖和(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-匍聚糖的碳水化合物。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述提取使用酸處理進行。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述酸為鹽酸。
21.根據權利要求18所述的方法，還包括純化所述分離的酵母細胞壁碳水化合物。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述純化通過選自以下的步驟而實現基于尺寸分離、基于電荷分離、基于疏水性分離、基于對結合分子的親和力分離、以及基于分子構象分離。
23.根據權利要求18所述的方法，還包括混合氧化所述分離的酵母細胞壁碳水化合物。
24.根據權利要求23所述的方法，其中所述溫和氧化通過使用氧化劑處理而實現。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述溫和氧化通過使用二甲基亞砜和乙酸酸酐處理所述酵母細胞壁碳水化合物而實現。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述溫和氧化導致活化所述酵母細胞壁碳水化合物。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述活化在所述酵母細胞壁碳水化合物的C6位進行。
28.根據權利要求26所述的方法，其中所述活化導致形成醛基。
29.根據權利要求26所述的方法，還包括將所述活化的酵母細胞壁碳水化合物暴露于選自以下的載體分子牛血清白蛋白、匙孔戚血藍蛋白、卵清蛋白、和牛甲狀腺球蛋白。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述載體分子為牛血清白蛋白。
31.一種免疫原性組合物，包含與蛋白質共價連接的(I —4)-α-/(1 — 6)-β-D-葡聚糖。
32.根據權利要求31所述的免疫原性組合物，其中所述組合物由釀酒酵母生物體產生。
33.根據權利要求31所述的免疫原性組合物，其中所述共價鍵合通過所述碳水化合物的C6原子發生。
34.一種組合物，包含能夠結合選自(I — 4)-a-D-葡聚糖、(I — 6) - β-D-葡聚糖和(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖的酵母細胞壁碳水化合物的抗體。
35.根據權利要求34所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
36.根據權利要求34所述的抗體，其中所述抗體為多克隆抗體。
37.根據權利要求34所述的抗體，其中所述抗體能夠結合(I— 4)-a -D-葡聚糖。
38.根據權利要求34所述的抗體，其中所述抗體能夠結合(I— 6) - β -D-葡聚糖。
39.一種用于制備用來檢測樣品中酵母細胞壁的方法，包括使用根據權利要求31所述的免疫原性組合物免疫宿主動物。
40.一種用于檢測樣品中酵母細胞壁的試劑盒，包含 -用于提取步驟的試劑，所述提取步驟導致釋放選自(I — 4)-a_D-葡聚糖、(I — 6) - β -D-葡聚糖和(I — 4) - α _/ (I — 6) - β -D-葡聚糖的酵母細胞壁碳水化合物；和-能夠結合在所述提取步驟提取的所述酵母細胞壁碳水化合物從而形成一級抗體-抗原復合物的一級抗體；和 -能夠附接到所述一級抗體-抗原復合物從而形成一級抗體-抗原-二價抗體復合物的二級抗體。
41.根據權利要求40所述的試劑盒，由此所述二級抗體綴合到選自酶、熒光材料、生色材料和放射性標記同位素的物質。
42.一種用于確定樣品中酵母細胞壁組分的存在的方法，所述方法包括 -提供樣品； -對所述樣品進行免疫學測定，其中所述測定檢測選自(I — 4)-a_D-葡聚糖、(I — 6) - β -D-匍聚糖和(I — 4) - α -/ (I — 6) - β -D-匍聚糖的化合物的所述存在；和-傳遞所述測定的結果。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述樣品衍生自選自以下的物質牲畜飼料、伴侶動物飼料、飼料原料、全混合日糧(TMR)、草料、飼料顆粒、飼料濃縮物、飼料預混物副產品、谷物、酒糟、糖蜜、纖維、飼草、牧草、干草、籽粒、葉片、粗粉、可溶性飼料、飼料補充劑、以及其制備中間體。
全文摘要
本發明涉及動物飼料添加劑及其在飼料產品中的檢測。另外，本發明涉及酵母細胞壁組分、其分離方法、以及用于其免疫學檢測的組合物和方法。
文檔編號G01N33/53GK102939537SQ201180029236
公開日2013年2月20日 申請日期2011年5月13日 優先權日2010年5月14日
發明者考姆·莫蘭, 斯蒂凡·奎特闊斯基, 亞歷克桑德斯·伊安尼克里斯, 厄休拉·安妮·蒂埃倫 申請人:全技術公司