專利名稱：通過減少反應物比例制備聚乙二醇-血紅蛋白綴合物的方法
技術領域：
本發明主要涉及通過減少反應物比例制備聚乙二醇(“PEG”)綴合的血紅蛋白(“Hb”)的方法。更具體地說，本發明涉及制備提高產率和純度的聚乙二醇綴合的血紅蛋白(“ PEG-Hb，，)的方法。
背景技術：
能夠用作氧治療的氧載體(有時稱作“攜氧血漿擴容劑(expander)”)可以分為以下三類i)基于全氟化碳的乳劑，ii)脂質體包封血紅蛋白，iii)修飾的血紅蛋白。如下所述，盡管認為包含修飾的無細胞血紅蛋白的產品是最有希望的，但均未完全成功。基于全氟化合物的乳劑溶解氧氣，而不與其結合為配基。為了用于生物系統，全氟化合物必須被脂質、一般為蛋黃磷脂乳化。盡管全氟化碳乳劑制備成本低廉，但它們不能在臨床耐受劑量下 攜帶足夠有效的氧氣。相反，已經表明脂質體包封血紅蛋白是有效的，但其極為昂貴而無法廣泛應用。(一般參見 Winslow,R. M. ,“Hemoglobin-based Red Cell Substitutes, ^JohnsHopkins University Press, Baltimore(1992))。最初的使用來自紅血球溶血產物的游離血紅蛋白作為紅細胞替代物的嘗試是不成功的。發現間質成分是有毒的，會引起凝血病和相關的腎衰竭。1967年，制備出了無基質血紅蛋白(stroma-free Hb,“SFH”)溶液(Rabiner, S. F.等，1967, J. Exp. Med. 126 1127-1142)。然而，發現它們的輸液(輸血，transfusion)半衰期僅有大約100分鐘。造成sra短暫的循環半衰期的原因歸咎于蛋白質從其四聚體解離成二聚體的能力，二聚體通過腎臟的循環被快速的過濾了。因此，已經設計出多種交聯血紅蛋白的方法和其它通過綴合大分子來增加血紅蛋白流體尺寸的方法來限制或阻止Hb的外滲。交聯sra以形成聚-血紅蛋白在美國專利4，001, 200和4，001, 401中被公開。可獲得連接亞單元之間的氨基酸殘基的內部交聯的血紅蛋白，其具有琥珀酰水楊酸(雙-3，5- 二溴水楊酸二酯)(參見美國專利4，529，719)或2-N-2-甲酰-吡哆醛-5’ -磷酸酯和硼氫化物(Benesch，R. E.等，1975,Biochem. Biophys. Res. Commun. 62 :1123-1129)。分子內交聯，其使得四聚體血紅蛋白單元的亞基化學結合在一起以阻止二聚體的形成，參見美國專利5，296，465。另夕卜，Simon, S.R.和Konigsberg，W. H.揭示了采用二-(N-甲基馬來酸)Bi ( “BME”)產生分子內交聯血紅蛋白(1966，PNAS 56 :749-56)，并報道了當其輸入鼠或狗體內時半衰期提高到四倍(Bunn, H. F.等，1969，J. Exp. Med. 129 :909-24)。然而，通過BME交聯血紅蛋白會引起血紅蛋白的氧親和力的伴隨提高，在當時它被認為會阻礙其用作潛在的基于血紅蛋白的氧載體(“HBOC”)。SFH也與其它大分子交聯，如右旋糖苷(Chang，J. E.等，1977，Can. J. Biochem. 55 398-403)，羥乙基淀粉(DE 2，161，086)，明膠(DE 2，449，885)，白蛋白(DE 2, 449, 885)和PEG (DE 3，026，398，美國專利 4，670，417，4，412，989 和 4，301，144)。這些攜氧的溶液的某些生理效應尚未完全了解。其中，可能最有爭議的是導致血管收縮的傾向，其可能表現為動物和人體中的高血壓(Amberson, W. , 1947, Science 106 117-117) (Keipert，P.等，1993，Transfusion 33:701-708)。雙二溴水楊基-延胡酸在 α鏈間交聯的人體血紅蛋白(“a aHb”)被美軍開發出來作為模型紅細胞替代物，但在其顯示出劇烈增加肺及全身血管阻力之后被放棄了 (Hess, J.等，1991，Blood 78 :356A)。該產品的商品化形式也在令人失望的III期臨床試驗后被放棄了(Winslow，R.M. ,2000, VoxSang 79 1-20)。無細胞血紅蛋白引起血管收縮的最常見的解釋是，它易于結合內皮細胞來源的松弛因子(EDRF) —氧化氮(“NO”)。兩種分子途徑已經被發展嘗試用于克服血紅蛋白與NO之間的結合活性。第一種途徑利用重組DNA，其通過誘使未梢血紅素結合區(pocke t)的特定位點突變來降低NO與血紅蛋白的結合(Eich，R. F.等，1996，Biochem. 35 =6976-83)。第二種途徑采用化學修飾，其通過寡聚反應增大血紅蛋白的尺寸，試圖減少或可能完全抑制血紅蛋白從血管空間向間質空間的滲出(Hess, J.R.等，1978，J. Appl. Physiol. 74 1769-78 ；Muldoon, S. Μ.等，1996，J. Lab. Clin. Med. 128 :579-83 ；Macdonal, V. ff.等，1994，Biotechnology 22:565-75 ；Furchgott, R.，1984, Ann.Rev. Pharmacol. 24 :175-97 ；和 Kilbourne, R.等，1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199 :155-62)。實際上，已經制備了 NO親和力降低的重組血紅蛋白，其在最高載量的大鼠實驗中較少引起高血壓(Doherty, D. H.等，1998, Nature Biotechnology 16 :672-676 和 Lemon,D.D.等，1996，Biotech 24:378)。但是，研究提示NO結合可能并非血紅蛋白血管活性的唯一解釋。已經發現，某些大的血紅蛋白分子，例如由PEG修飾的血紅蛋白分子，實際上沒有高血壓效應，即使其NO結合速率與嚴重高血壓的a aHb相同(Rohlfs，R. J.等，1998，J Biol. Chem. 273 :12128-12134)。此外，發現在出血之前作為交換輸液給予PEG-血紅蛋白時，在防止出血后果方面格外有效(Winslow, R.M.等，1998，J. Appl. Physiol. 85 993-1003)。PEG與血紅蛋白的綴合減少了其抗原性并且延長了它的循環半衰期。然而，已有報道稱PEG的綴合反應會引起血紅蛋白四聚體解離成α β-二聚體亞單元，在交換輸血的鼠類身上接受了低于40，000道爾頓(“Da”)的PEG綴合血紅蛋白單體單元會導致顯著的血紅蛋白尿(Iwashita 和 Ajisaka Organ-Directed Toxicity Chem. Indicies Mech. ,Proc.Symp. , Brown 等 1981, Eds. Pergamon, Oxford, England 97-101 頁)。由 Enzon, Inc.(美國專利5，650，388)制備了聚環氧烷(“ΡΑ0”)綴合的血紅蛋白具有大于84，OOODa的分子量，其可以攜帶10個PEG-5000鏈通過其α和ε _氨基連接血紅蛋白的副本。該取代的程度被描述為可以避免臨床上與哺乳動物血紅蛋白尿有關的顯著腎毒性。然而，綴合反應引起多樣化的綴合群并且包含了其它不期望的反應物，它們必須通過柱狀色譜去除。PEG綴合通常通過活化的PEG與生物分子表面的官能團反應來進行。最普遍的官能團是賴氨酸和組氨酸殘基的氨基基團，和蛋白質的N末端；半胱氨酸殘基的巰基；和絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸殘基的羥基；以及蛋白質的C末端。PEG的活化通常是將羥基末端轉化成能夠與這些官能團在溫和的水環境中進行反應的反應性基團。最普遍的用于醫學生物藥物的綴合的單官能團PEG中的一個是甲氧基-PEG( “mPEG”)，它只有一個官能團(即羥基)，因而將與雙官能團PEG有關的交聯和聚合問題最小化。然而，由于其生產過程，mPEG經常被高分子量的雙官能團PEG(即“PEG 二醇”)污染，其范圍可以達到10至15% (DustJ. M.等，1990,Macromolecule 23:3742-3746)。該雙官能團PEG 二醇的大小約為期望的單官能團PEG的兩倍。隨著PEG分子量的增加，污染問題進一步加重。mPEG的純度在PEG化的生物治療劑的生產中是特別關鍵的，因為FDA要求生產過程的高度重現性和最終藥品產物的高質量。在氧合和脫氧的狀態下，均可使血紅蛋白與PAOs綴合。美國專利6，844，317中描述了在氧合或“R”狀態時綴合Hb，以增強生成的PEG-血紅蛋白綴合物的氧親和力。這是通過在綴合之前將血紅蛋白與大氣平衡來完成的。其它文獻描述了關于在綴合前的脫氧步驟以減少氧親和力和提高結構的穩定性使得血紅蛋白能經受得住化學修飾中的物理應力，透析過濾和/或無菌過濾和滅菌過程(美國專利5，234，903)。對于Hb的分子內交聯，建議在修飾過程之前對血紅蛋白進行脫氧可能需要使α-鏈的賴氨酸99暴露于交聯試劑中(美國專利 5，234，903)。Acharya等(美國專利7，501，499)研究了在Hb與PEG綴合之前通過亞氨基四氫噻吩(iminothiolane)對血紅蛋白進行硫醇化的反應動力學。觀察到將亞氨基四氫噻吩 的濃度從10倍(其引入了平均5個外來硫醇/四聚體)增加，增加到30倍幾乎使相對血紅蛋白的表在硫醇數量加倍。然而，甚至在雙倍的硫醇數目時PEG綴合后觀察到的尺寸增加也是微小的。這表明綴合反應在20倍摩爾過量的馬來酰亞胺基(maleimidyl)PEG-5000存在時，活性較小的硫醇覆蓋了血紅蛋白的表面引起了空間干擾，阻擋了活性較大的硫醇對Hb的進一步修飾。因此，為了獲得期望分子量的修飾血紅蛋白(即6±1PEG/Hb分子)，Acharya等采用8_15倍摩爾過量的亞氨基四氫噻吩進行血紅蛋白硫醇化，然后用16-30倍摩爾過量的馬來酰亞胺基PEG-5000與硫醇化Hb反應。然而,這些高摩爾倍數過量的反應物濃度在大規模生產時顯著增加了制備HBOC的成本。而且，這樣高的摩爾倍數過量的馬來酰亞胺基PEG-5000導致了大量不需要的反應物的產生，得到了多種不同的產物。因此，需要一種低廉的、高效率的、更少雜質和更窄分子量范圍的制備特定大小范圍PEG綴合血紅蛋白的方法。
發明內容
本發明主要涉及一種制備聚乙二醇綴合血紅蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步驟將血紅蛋白(Hb)與2-亞氨基四氫噻吩(2-iminothiolane) (2-IT)在水稀釋液中混合，其中在稀釋液中2-IT的濃度相對于血紅蛋白濃度為7-8倍摩爾過量，以形成硫醇化Hb ’然后在水性稀釋液中，向硫醇化Hb加入聚乙二醇(PEG)-馬來酰亞胺(Mal)，其中在稀釋液中PEG-Mal的濃度相對于血紅蛋白濃度為9-15倍摩爾過量以形成PEG-血紅蛋白(PEG-Hb)綴合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道爾頓(Da)的平均分子量；其中得到的PEG-Hb綴合物含有平均7. 1-8. 9PEG分子/Hb。在一個實施方案中，在稀釋液中2-IT的濃度相對血紅蛋白濃度為7. 5倍摩爾過量，PEG-Mal的濃度相對血紅蛋白濃度為12倍摩爾過量，和/或PEG-Mal具有5000道爾頓的平均分子量。根據本發明的示例性方法制備的PEG-Hb綴合物在血紅蛋白50%飽和時的氧分壓(P50)比在基本相同條件下測得的從同等來源得到的天然無基質血紅蛋白的氧分壓要低。在一個實施方案中，PEG-Hb綴合物的p50低于10毫米萊柱(mmHg),例如在4-8mmHg之間。
本發明的其它方面如說明書全文所述。
圖I : β Cys93殘基和硫醇化的血紅蛋白賴氨酸被PEG化。R1, R2和R3表示血紅蛋白的主鏈；R4是烷基，“η”表示5000Da的PEG的氧乙烯單元的平均數目。發明的詳細說明本發明主要涉及通過使用降低的反應物比例制備聚乙二醇(“PEG”)綴合的血紅蛋白(“Hb”)的方法。更特別的，本發明涉及制備提高產率和純度的聚 二醇綴合的血紅蛋白(“PEG-Hb”)的方法。在下文的描述中，廣泛使用了許多分子生物學，免疫學和醫學領域的術語。為幫助清楚和一致的理解說明書和權利要求書，包括這些術語的范圍，下文提供了非限定性的定義。在公開內容中出現了術語“一個(one)”，“一(a)”，或“一(an) ”時，除非另外說明，它們表示“至少一個”或“一個或更多”。術語“活化的聚環氧烷”或“活化的ΡΑ0”在這里是指具有至少一個官能團的PAO
分子。官能團是活性基團，它與分子上的自由氨基、巰基或羧基反應使得分子與PAO綴合。舉例來說，與自由巰基反應的這樣一種官能團是馬來酰亞胺基團。相應的，與自由氨基反應的官能團是琥珀酰亞胺基團。術語“大約”在這里是指實際值在所指數值的一個范圍之內。一般而言，實際值在所指數值的10%上下(即加或者減)范圍。術語“血紅蛋白”或“Hb”在這里一般是指紅細胞內包含的輸送氧的蛋白質。每個血紅蛋白分子具有4個亞基，兩條α鏈亞基和兩條β鏈亞基，組成四聚體結構。每個亞基還包含一個血紅素基團，它是結合氧的含鐵中心。因而每個血紅蛋白分子可結合4個氧分子。術語“MalPEG-Hb”在這里是指已經綴合了馬來酰亞胺基活化的PEG的血紅蛋白。該綴合的實施是通過將MalPEG與血紅蛋白的表面巰基(在較小粒度上與氨基)反應以形成MalPEG-Hb。巰基存在于Hb的氨基酸序列的半胱氨酸殘基中，也可以通過修飾表面氨基引入疏基。術語“高鐵血紅蛋白”或“metHb”在這里是指包含三價態鐵的氧化形式的血紅蛋白。MetHb不能起氧載體作用。術語“高鐵血紅蛋白在這里是指在全部血紅蛋白中氧化的血紅蛋白的百分比。術語“甲氧基-PEG”或“mPEG”在這里是指PEG羥基末端的氫被甲基(-CH3)所取代的PEG。術語“混合物”或“混合”在這里指兩種或更多的物質混合在一起，而不發生會導致它們喪失各自性質的反應。術語“溶液”是指液體混合物，術語“水溶液”是指包括一些水的溶液，可能還包括一種或更多種其它液體物質，與水形成多組分溶液。術語“修飾血紅蛋白”或“修飾Hb”在這里指，但不限于通過化學反應改造的血紅蛋白，例如分子內或分子間交聯、重組技術，從而這種Hb不再是它的“天然”狀態。此處所用術語“血紅蛋白”或“Hb”本身是指天然未修飾的血紅蛋白以及修飾的血紅蛋白。
術語“氧親和力”在這里是指氧載體(例如血紅蛋白)結合分子氧的親和力。該特征由關于血紅蛋白分子氧飽和度(Y軸)與氧分壓(X軸)的氧平衡曲線定義。該曲線的位置由氧載體被氧半飽和時的氧分壓P50值表示，它與氧親和力逆相關。因此，P50越低，氧親和力越高。可以利用本領域已知的多種方法測定全血(以及全血的組分諸如紅細胞和血紅蛋白)的氧親和力。(參見例如 Winslow，R.M.等，J. Biol. Chem. 1977，252 :2331-37)。也可使用市售的ΗΕΜ0Χ 分析儀(TCS Scientific Corporation,New Hope,PA)測定氧親和力。(參見例如 Vandegriff 和 Shrager 的“Methods in Enzymology”(Everse 等編著)232 :460(1994))。術語“全氟化碳”在這里是指包含氟原子的合成的惰性分子，以及完全由鹵素(Br，F，C1)和碳原子組成的惰性分子。其乳劑形式比等量的血漿或水能夠多溶解很多倍的氧氣，因而正開發為血液物質。 術語“聚乙二醇”或“PEG”在這里是指具有化學通式H(0CH2CH2)n0H(也稱為α-氫-ω-羥基-聚(氧-1，2-亞乙基))的液體、固體或聚合物，其中“η”大于或等于4。該術語包括任何PEG試劑、取代或未取代的形式。市售PEG有多種形式(例如，Carbowax (DowChemical, Midland, MI)，Poly- (ArchChemicals, Norwalk, CT),和 Solbase)。術語“聚乙二醇綴合血紅蛋白”或“PEG-Hb綴合物”在這里是指血紅蛋白上面共價結合有PEG。術語“無基質血紅蛋白”或“sra”在這里是指已經從中去除所有紅細胞膜的血紅蛋白。術語“表面修飾血紅蛋白”在這里指已經連接化學基團(通常為聚合物)的血紅蛋白，諸如葡聚糖或聚環氧烷的血紅蛋白。術語“表面修飾氧合血紅蛋白”是指表面修飾時處于“R”狀態的血紅蛋白。有機聚合物在之前的研究中，發現了表面修飾血紅蛋白的分子應足夠大以避免被腎臟清除并達到理想的循環半衰期。Blumenstein, J.等人確定,分子量為84，000道爾頓(“Da”)或以上能夠達到以上目的(“Blood Substitutes and Plasma Expanders”，Alan R. Liss,editors, NewYork, N. Y.，205_212頁(1978))。在該研究中，作者將血紅蛋白與不同分子量的葡聚糖綴合。他們報道了，血紅蛋白(分子量64，OOODa)和葡聚糖(分子量20，OOODa)的綴合物“被緩慢從循環中清除、由腎臟清除的幾乎可忽略”。此外，還觀察到提高分子量至84，OOODa以上并未明顯改變這些清除曲線。本發明提供了綴合PAO到Hb的方法，其中可以得到至少84，OOODa的分子量。適合的聚環氧烷聚合物包括，聚環氧乙烷(-(CH2CH2O)n-)、聚環氧丙烷(-(CH(CH3)CH2O)n-)和聚環氧乙烷/聚環氧丙烷共聚物(-(CH2CH2O)n-(CH (CH3) CH2O) n-)。適于實施本發明的其它直、支鏈以及任意取代的合成聚合物為醫學領域所公知。因為其藥物可接受性以及商業可利用性，最常見的用于修飾血紅蛋白表面的PAO是PEG。另外，PEG根據其分子中環氧乙烷(即-OCH2CH2-)亞單元的重復的數目可以得到多種分子量。PEG試劑通常后接一個對應其平均分子量的數字。例如，PEG-200的平均分子量為200Da，可能的分子量范圍是190-210Da。血紅蛋白的修飾
在本發明方法中使用的血紅蛋白不限來源并且可以從人或動物身上獲得，或從基因重組技術中得到。它可以是天然(未修飾)的或修飾過的，或經過重組改造的。人α-和β -球蛋白基因均已克隆并測序(Liebhaber S. Α.等，PNAS，1980，77 :7054-7058 ；Marotta,C.A.等，J. Biol. Chem. 1977，353 :5040-5053 ( β -球蛋白 cDNA))。此外，如今使用定位誘變已經制備了許多重組的修飾血紅蛋白，盡管據報道這些“突變”血紅蛋白變體具有并不理想的高氧親和力(參見例如Nagai，K.等PNAS1985，82 :7252-7255)。優選的，血紅蛋白是無基質和無內毒素的。用于增加血紅蛋白上可綴合位點的數目的方法是通過引入巰基(“-SH”)，巰基比自由氨基更易于與PEG-Mal反應。本領域已知有多種方法可以對蛋白質硫醇化。它們包括，例如，通過與琥珀酰亞胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯反應以硫醇化蛋白質中含自由氨基的殘基，然后用二硫蘇糖醇(“DTT”)或三(2-羧乙基)磷酸(“TCEP”)還原3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基綴合物。氨基也可以直接通過與琥珀酰亞胺乙酰硫代乙酸酯反應進行硫醇化，接著用50mM羥胺或聯胺在近中性pH下去除乙酰基。此外，2-亞氨基四氫噻吩(2-IT)可以用于將自由氨基轉換為巰基。
天然人體血紅蛋白具有固定數量的氨基酸殘基側鏈，可以硫醇化后與馬來酰亞胺活化的PAO分子進行綴合。這些在下表中列出
權利要求
1.一種制備聚乙二醇綴合血紅蛋白(PEG-Hb)的方法，包括如下步驟 a)將血紅蛋白(Hb)與2-亞氨基四氫噻吩(2-IT)在水稀釋液中混合，其中在稀釋液中2-IT的濃度相對血紅蛋白濃度為7-8倍摩爾過量，以形成硫醇化血紅蛋白；以及 b)在硫醇化血紅蛋白的水稀釋液中加入聚乙二醇(PEG)-馬來酰亞胺(Mal)，其中在釋釋液中PEG-Mal的濃度相對血紅蛋白濃度為9-15倍摩爾過量以形成PEG-Hb綴合物，其中PEG-Mal具有4000-6000道爾頓(Da)的平均分子量； 其中PEG-Hb綴合物含有平均7. 1-8. 9PEG分子/Hb。
2.根據權利要求I的方法，其中稀釋液中2-IT的濃度相對血紅蛋白濃度為7.5倍摩爾過量。
3.根據權利要求I的方法，其中稀釋液中PEG-Mal的濃度相對血紅蛋白濃度為12倍摩爾過量。
4.根據權利要求I的方法，其中PEG-MaI具有5000道爾頓的平均分子量。
5.根據權利要求I的方法，其中PEG-Hb綴合物在血紅蛋白50%飽和時的氧分壓(p50)低于基本相同條件下測得的從同等來源得到的天然無基質血紅蛋白的氧分壓。
6.根據權利要求5的方法，其中PEG-Hb綴合物的p50低于10毫米汞柱(mmHg)。
7.根據權利要求5的方法，其中PEG-Hb綴合物的p50在4和8mmHg之間。
8.根據權利要求5的方法，其中步驟a)在pH7-9進行。
全文摘要
本發明主要涉及通過減少反應物比例制備聚乙二醇(“PEG”)綴合血紅蛋白(“Hb”)的方法。更具體地說，本發明涉及制備增加產率和純度的PEG綴合Hb(“PEG-Hb”)的方法。
文檔編號G01N33/72GK102859364SQ201180011267
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月23日 優先權日2010年2月25日
發明者A·馬拉瓦立, K·D·梵德格里夫 申請人:桑格特公司