變應原微陣列的制作方法

專利名稱：變應原微陣列的制作方法
變應原微陣列本發明涉及一種用于評估對象是否已發生哮喘、結膜炎或鼻炎或具有其發生風險的方法。本發明還涉及用于所述方法的抗原集合，所述方法包括鑒定與此類風險相關的抗原。
背景技術：
哮喘被普遍認為是一種主要的全球性健康問題。在過去的五十年中，它是影響成人和兒童的最常見的疾病之一，其導致了全世界多達3億個病例，并且令人擔憂的是它出現頻率在逐年上升。遺傳因素(細胞因子和免疫應答基因)和環境因素(如病毒性感染、變應原和職業性暴露)均與哮喘易感性、發作年齡和嚴重程度有關。但是，該疾病的發病機理還未被完全闡明。·一個主要的風險因素是發生對外源抗原的免疫應答，所述免疫應答的特征在于產生抗原-特異性IgE。此概念最先來自于下述現象，哮喘的患病率與血清IgE水平緊密相關。現在，壓倒性的證據已經確證IgE在特應性哮喘中的作用，而數個研究還揭示了 IgE和非特應性哮喘之間的關聯性。更多的爭論是抗原特異性IgE在決定疾病的發作和嚴重程度中的作用。因為發現房塵螨是灰塵中變應原的主要來源，所以數個研究將抗特異性螨變應原的血清IgE的存在與哮喘相聯系。但是，在世界范圍內有大量個體(尤其生活在美國和斯堪的納維亞的一些地區的那些)通常在他們的生活中不與螨抗原接觸。有意思的是，這些個體在哮喘的患病率和嚴重程度的方面不會顯示出任何降低。因此，很有可能另一些抗原單獨地或組合地在該疾病的發病中起重要的作用。遺憾的是，抗原接觸、IgE產生與哮喘的發生和/或嚴重程度之間的任何關聯性似乎都涉及出乎意料地大量的因素，并且接觸與應答之間似乎存在非線性關系。迄今為止，試圖確定特異性IgE和哮喘之間關聯性的研究集中在要么分析一種抗原要么同時分析少數幾種抗原，如描述房塵螨作用的那些研究。與此相反，目前尚沒有針對IgE對大抗原庫的應答和哮喘發生進行調查的研究。已知變應原的數目和已經分析的抗原的數目之間的不均衡性可很好地解釋在建立特異性IgE在哮喘的發病中作用之中所遇到的困難。例如，大多數患有哮喘的患者具有針對多于一種變應原的血清IgE，并且其每一種在疾病表現和癥狀中的相對貢獻仍然是未知的。因而，盡管通過針對常見變應原的特異性IgE的存在所定義的特應性與哮喘相關聯，但是特異性IgE的高血清水平并不總是與特應性相關聯。結果，全部的或特異性的IgE與哮喘應答模式之間的相關性仍是不清楚的。因此，盡管確定患者或對象是否顯示對特定抗原的免疫應答是相對直接的，但是并沒有簡單的方式來確定同一患者或對象是否具有發生更嚴重病癥(如哮喘、結膜炎或鼻炎)的風險。目前，本發明人出人意料地發現預測發生此類病癥的風險是可能的。

發明內容
在本發明的第一個方面中，提供鑒定生物標志物集合的方法，更特別地鑒定與哮喘、結膜炎或鼻炎顯著相關的抗原集合。所述方法包括(a)在分離自一組無癥狀對象的多個第一樣品中測量IgE對多種抗原反應性的水平，(b)在分離自一組患有哮喘、結膜炎或鼻炎的對象的多個第二樣品中測量IgE對多種抗原反應性的水平，(C)鑒定對象組之間IgE反應性水平顯示出顯著差異的所述多種抗原的子集，其中IgE對所述子集反應性的水平與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關。在某些實施方案中，盡管可對每個個體樣品分開進行評估，但基本上同時測量每個樣品內的所述多種抗原的反應性水平。 優選地，在第一和/或多個第二樣品中的樣品數目為30至800個樣品，優選為50至800個樣品。因此，樣品的數目可以是30至800之間的任何數目；例如，30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700或800，或者其中的任何范圍。優選地，所述多種抗原包含30至400種抗原，優選為50至400種抗原。因此，抗原的數目可以是30至400之間的任何數目，例如30、40、50、60、70、80、90、100、200、300或400，或者其中的任何范圍。在一些具體的實施方案中，抗原被選擇為在特定地區出現率最高的抗原。在一個實施方案中，通過將所述多種抗原與分離自所述對象組的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測定與每種抗原結合的IgE的量來確定IgE反應性的水平。在一些具體的實施方案中，所述抗IgE抗體是帶標記的抗體。在另一些實施方案中，所述抗IgE抗體是未標記的并且通過使用帶標記的抗體進行檢測。所述帶標記的抗體可包含熒光標記。在一些優選的實施方案中，通過使用熒光檢測來確定與每個抗原結合的IgE的量。在某些實施方案中，所述多種抗原結合于至少一個具有多個地址的固體支持物，其中每個地址具有一種獨特的抗原布置于其上。在一個實施方案中，所述固體支持物包含多個可分開識別的珠子(separately identifiable bead)。在另一個實施方案中，所述固體支持物是微陣列。當所述固體支持物是微陣列時，抗原的點樣濃度為O. 008mg/ml至3mg/ml ο在第二個方面中，本發明提供用于評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險的方法。在某些實施方案中，所述方法包括測量在分離自對象的樣品中IgE對生物標志物集合的反應性水平。優選地，所述生物標志物是預先確定與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關聯的抗原，例如通過本發明的第一個方面預先確定的。在一些具體的實施方案中，IgE對生物標志物集合中的至少75%的反應性水平高于3. 511U/ml，這表明該對象可能發生或已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎。在某些實施方案中，所述生物標志物集合包含9至51種抗原。在一些具體的實施方案中，所述生物標志物集合選自以下抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、EU E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。在一個實施方案中，通過將所述多種抗原與分離自所述對象的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測定與每種抗原結合的IgE的量來確定IgE反應性的水平。在某些實施方案中，所述抗IgE抗體是帶標記的抗體。在另一些實施方案中，所述抗IgE抗體是未標記的并且通過使用帶標記的抗體對其進行檢測。所述帶標記的抗體可包含熒光標記并且通過熒光檢測確定與每種抗原結合的IgE的量。在一些優選的實施方案中，所述抗原與固體支持物結合。在一個實施方案中，所述固體支持物是微陣列。在某些實施方案中，所述抗原的點樣濃度為O. 008mg/ml至3mg/ml。優選地，基本上同時測量與生物標志物集合中每種抗原結合的IgE的量。在第三個方面中，本發明提供用于診斷哮喘、結膜炎或鼻炎或者確定其發生風險的抗原微陣列。所述微陣列包含與哮喘、結膜炎或鼻炎相關聯的生物標志物集合。在某些實施方案中，所述微陣列包含抗原F95、Gl、G3、G4、G12、G14、G15和G18以及任選地一種或更多種選自以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907 和 Χ910。 在本發明的第四個方面中，提供用于確定發生哮喘、結膜炎或鼻炎的風險的試劑盒。在另一些實施方案中，所述試劑盒可用于診斷哮喘、結膜炎或鼻炎。此類試劑盒可包含⑴抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18，(ii)任選地一種或更多種以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、
16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910，(iii)抗 IgE 抗體。在一些具體的實施方案中，所述試劑盒可包含在微陣列上的抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、El、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。在本發明的第五個方面中，提供根據第一個或第二個方面的方法、根據第三個方面的微陣列或根據第四個方面的試劑盒用于評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險的用途。在本發明的第六個方面中，提供前述方面的方法、微陣列或試劑盒用于篩選可用于治療哮喘、結膜炎或鼻炎的化合物的用途。


圖I :表I列出了 103種抗原，它們排列成陣列并用作第一抗原集合以用于篩選。抗原標示符與ImiliunoCAPi^應原產品貨號相對應，例如可得自Phadia AB。圖2 :表2舉例說明了根據年齡、性別和包括哮喘在內的多種特應性疾病的發生對實施例中所述研究群體的分層。圖3 :表3例證了對103種變應原的聚類反應性特征譜的相關性分析。分析了三個聚類在性別頻率、結膜炎、濕疹、鼻炎、哮喘以及哮喘持續性、哮喘嚴重程度和發作年齡上的差異。通過在SPSS中使用X 2檢驗，或者對于發作年齡，通過使用平等性(equality)的Kruskal-Wallis秩和檢驗評估相關性。圖4 :表4列出了排成陣列的變應原子集，當在Mann-Whitney檢驗中比較哮喘的和非哮喘的個體時，其顯示IgE血清反應性上的最高差異。
圖5 :針對排成陣列的103種變應原(行)的872個血清(列)的血清反應性特征譜的K-均值聚類分析。顯現出每個聚類(節點)中的特異性血清反應性模式，圖5a——節點O、圖5b——節點I和圖5c——節點2 ;將個體變應原的血清反應性特征譜分類為陽性(白框——分類得分I 5)和陰性(黑框——分類得分O)。圖6 :針對排成陣列的顯著的所選擇的51個變應原(行)的872個血清(列)的血清反應性特征譜的K-均值聚類分析。顯現出每個聚類(節點)中的特異性血清反應性模式，圖6a——節點3、圖6b——節點4和圖6c——節點5。將個體變應原的血清反應性特征譜分類為陽性(白框——分類得分I 5)和陰性(黑框——分類得分O)。圖7 :在對多個比較進行Bonferroni校正后，使用皮爾遜(Pearson' s) x 2試驗評估聚類和變量之間的相關性。圖7a列出了所有103種抗原的結果，圖7b列出了 51種抗原子集的結果。
圖8 :示例了基于RBF的ANN哮喘分類器的廣義結構和性能。RBF網絡由三層組成，分別為輸入層(框I 51)、隱層(圈I 8)和輸出層(黑框中的哮喘分類)。圖9a ANN的預測-觀察性能圖表。框圖代表了 RFB輸出種類的預測假概率；對于合并的訓練和測試樣品，針對已知臨床狀況的哮喘患者(I)哮喘患者(2)繪制的哮喘(灰色)和非哮喘(白色)圖。圖％ :對合并的訓練和測試樣品計算ROC曲線，哮喘(黑色)，非哮喘(灰色)。圖10示例了 ANN哮喘分類器的一致性性能。針對所選個體之已知的臨床狀況，基于皮爾遜X 2檢驗評估盲性樣品的ANN預測的哮喘狀況。發明詳述本發明人已發現對象將發生或已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎的傾向性或可能性可能與來自該對象的針對特定抗原和抗原集合的特異性IgE的存在和/或結合水平相關聯。所述抗原是可用于預測、診斷或確定治療有效性的生物標志物。這個發現是出人意料的，因為在無癥狀對象組和有癥狀對象組之間以及在每個組內個體之間特異性IgE結合程度存在非常大的變異性。該發現是哮喘、結膜炎和鼻炎的治療和診斷中的顯著進步。本發明公開了用于鑒定診斷性生物標志物的方法，所述生物標志物與這些臨床狀況具有統計學上顯著的相關性。所述方法鑒定了無癥狀患者和有癥狀患者之間的差異，從而揭示出臨床癥狀與特異性IgE的存在或缺乏之間之前不為所知的相關性。因此，可產生疾病特異性模式并將其用于篩選或診斷。為了鑒定疾病特異性模式，首先需要獲得來自至少兩組對象的樣品一第一組為健康的、無癥狀的對象以及第二組為有癥狀的對象。優選地，有癥狀的對象已被臨床診斷為哮喘、結膜炎、鼻炎或這些的組合。但是，顯然對本領域技術人員而言，本發明的方法也可施用于其他的(尤其是變應性的)病癥或疾病，如皮炎、濕疹、炎癥、蕁麻疹、支氣管狹窄等。為了獲得結果或數據，通常，任何樣品一般包含或期望包含一種或更多種免疫球蛋白E抗體(IgE)或其結合片段。分離自患者或對象的樣品優選為全血樣品。此類全血樣品可以是，例如靜脈或毛細血管樣品，或者可以是此類樣品的級分(例如血漿或血清)。溶血樣品、脂血癥樣品或黃疸樣品或者包含添加劑的樣品也被設想適于使用，所述添加劑常見于用以收集血液的管中，如EDTA、肝素和檸檬酸鹽。也可使用其他體液(bodily fluid),如淋巴液、初乳、乳汁、唾液、眼淚、尿液或這些流體的級分。在另一些實施方案中，樣品可來源于細胞培養物、細胞培養液或上清液或者液化的固體樣品，例如來源于組織活檢。所述患者或對象是哺乳動物以及可以是人或下列動物，例如但不限于，貓、狗、兔、小鼠、豚鼠、雪貂、猴、馬、奶牛或駱駝。在該方法的第一個步驟中，在分離自每組中對象的樣品中測量IgE對多種抗原的反應性水平。例如，為了避免統計學或系統偏差，對象可在分析之前分配至特定的組(即有癥狀的或無癥狀的)或者可在測試后分配至特定的組。正常情況下，在來自對象的樣品中檢測不到針對特異性變應原的免疫球蛋白E (IgE)，只有當對象變得對該變應原致敏時才會產生所述IgE。針對特定抗原并且只與該抗原反應的IgE通常被稱為特異性IgE(SlgE)。對象可具有針對多于一種變應原的特異性 IgE0反應性用來表示特定抗體與其配體之間相結合從而形成免疫復合物的結合水平。在本發明的背景下，抗體是特異性IgE，配體是抗原。通常，特異性IgE與特定抗原結合。反應性的水平可定義為IU/ml，或者可替代地，可定義為分配為分類得分值的范圍。例如，分類O為少于O. 35IU/ml ;分類I為O. 35至O. 7IU/ml ;分類2為O. 71至3. 5IU/ml ;分類3為
3.51 至 17. 5IU/ml ;分類 4 為 17. 51 至 50IU/ml 和分類 5 為 50. 01 至 100IU/ml。或者，IgE對特定抗原的反應性可被認為是陽性/存在或者是陰性/缺乏，例如低于閾值時，應答被視為陰性/缺乏；高于閾值時，應答是陽性/存在。通常，水平> (大于)0. 35IU/ml表明陽性結果，換言之，特異性IgE與其配體結合。事實上，使用合適的測定對樣品中特異性IgE與其配體(在本發明情況下為抗原)之間的相互作用形成的抗體-抗原復合物進行測定。在本發明的背景下，術語變應原意指可觸發由IgE抗體介導的變應性反應的特定抗原類型。本發明的方法和制備延展至此類變應原及變應原片段或充當變應原的半抗原的廣義類別。這些可包括可在變應對象中引起IgE介導應答的所有特異性過變應原。變應原可以是重組的或制備自天然來源的，并且其可包含單一表位或者具有兩個或更多個表位的更復雜的混合物，所述兩個或更多個表位來自單一抗原或者兩種或更多種變應原個體。術語“變應原”和“抗原”通常可互換。本文所使用的術語“多個”定義為兩個或多于兩個。在本發明的第一個方面的背景中，所用樣品的數目應是足以產生統計學顯著性結果的數目。對于特定的抗原，該結果應確定所述抗原與來自有癥狀對象的特異性IgE之間沒有相關性，或者確定所述抗原與來自有癥狀對象的特異性IgE之間有相關性；換言之，確定特定抗原與哮喘、結膜炎或鼻炎的存在之間是否有關聯性。 優選地，為了鑒定任何相關性，應測試大量的個體對象，例如總計30至1000個，優選為總計50至1000個。通常，在每個實驗或研究中只分析來自每個個體對象的一個樣品。取自每組的樣品數可大致相等，即當總共使用了 1000個樣品時，500個來自無癥狀的對象，而500個來自有癥狀的對象。但是,對本領域技術人員而言很清楚,對象和樣品的數目可根據許多因素(如患者招募)的不同而不同，并且不一定相等。因此，所用對象和樣品的數目應是足以精確地建立相關性的數目。優選地，所述多種抗原將是包含大量抗原的集合，例如大于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 種，更具體地，大于 150、200、250、300、350、400、450 或 500 種。通過使每個個體樣品(包含特異性IgE)分開地與多種抗原基本上平行地相接觸以及測定來自所述樣品的與每種抗原結合的每種特定抗原的量來確定IgE反應性的水平。通常，該方法的特征在于包括兩個分開的步驟(a)在分離自無癥狀對象組的多個第一樣品中測量針對多種抗原的IgE反應性水平，(b)在分離自患有哮喘、結膜炎或鼻炎的對象組的多個第二樣品中測量針對多種抗原的IgE反應性水平。為避免疑義，對本領域技術人員而言很清楚，這種分成兩個單獨步驟的分開是出于書面描述目的的人為分離。基本上，兩個步驟是相同的，只有樣品取自的組不同。因而，在實驗室中，(a)和(b)可概括為對于來自每組的每個樣品重復的單一步驟，即(ab)在分 離自對象的樣品中測量針對多種抗原的IgE反應性水平。對于“η”個樣品，步驟(ab)重復至少“η”次。因此，當多個第一樣品包含“χ”個樣品且多個第二樣品包含“y”個樣品時，χ+y等于重復的數目n。所以，顯然步驟(a)和
(b)可以以任何順序平行地或者依次地進行，或者根據需要重復步驟(ab)直到測試完所有樣品。優選地，通過使用抗IgE抗體的免疫測定的方法測量針對多種抗原的IgE反應性的水平。抗IgE抗體與人免疫球蛋白的IgE同種型反應。因此，在某些實施方案中，通過使用抗IgE抗體確定或定量與每種抗原結合的IgE的量。抗IgE抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、人源化抗體或嵌合抗體，盡管通常優選為親和純化抗體，更特別地為單克隆抗體。此類抗IgE抗體可以是常規抗體或重組抗體并且可由單鏈組成，但優選為由至少輕鏈或重鏈組成。但是，應了解，為了結合靶標(如抗體特異性結合的抗原)需要至少一個互補決定區(⑶幻。制備抗IgE抗體的方法為本領域所知。例如，如果期望多克隆抗體，那么可使用所選抗原(如異源抗原IgE)免疫接種選擇的哺乳動物如人、小鼠、兔、豬、綿羊、駱駝、山羊或馬。之后收集并處理來自經免疫的動物的血清以獲得抗體，例如通過免疫親和層析。單克隆抗IgE抗體可通過本領域已知的方法生產。使用雜交瘤技術制備單克隆抗體的一般性方法是公知的(參見，例如，Kohler, G和Milstein, C, Nature 256 495-497 (1975) ；Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy 中的第 77 96 頁，Alan R. Liss, Inc. (1985))。本文所提及的一種抗IgE抗體應由表位結合區(如CDR)組成。該抗體可以是任何合適的分類，包括IgE、IgM、IgD、IgA以及特別是IgG。還考慮了這些抗體的多種亞類。在一些具體的實施方案中，可使用抗IgE抗體或保留抗IgE抗體結合特異性的來源于此類抗體的多肽。此類片段包括，但不限于抗體片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv，其全部都能結合至表位。術語“抗IgE抗體”還擴展至任何多種天然或人工抗體以及可獲得的抗體衍生蛋白質以及衍生物，例如包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，人源化抗體，人抗體，單結構域抗體，全抗體，抗體片段如F(ab’)2和F(ab)片段、Fv片段(非共價異二聚體)，單鏈抗體如單鏈Fv分子(scFv)、微型抗體、寡聚抗體(oligobody)、二聚或三聚抗體片段或者構建體，等等。術語“抗IgE抗體”不暗示任何特定來源，其包括通過非常規方法所獲得的抗體，如噬菌體展示。本發明的抗體可以是任何的同種型(例如IgA、IgG、IgM即α、Y或μ重鏈)并且可以具有K (kappa)或λ (lambda)輕鏈。因此，本發明擴展至抗IgE抗體和具有用于本發明的IgE結合特異性的結合片段的用途。術語“特異地結合”或“結合特異性”指抗體或其片段以大于結合非靶表位的親和性結合靶標的能力。例如，抗體與靶表位的結合可導致比非靶表位的結合親和性高至少10、50、100、250、500或1000倍的結合親和性。在某些實施方案中，結合親和性由親和ELISA測定所確定。在一些替代性實施方案中，親和性由BIAcore測定所確定。或者，結合親和性可由動力學方法確定。在一些具體的實施方案中，抗IgE抗體是帶標記的抗體。作為非限制性的實例，標記可通過與酶(如過氧化物酶)或者化學發光或突光化合物(Alexa Fluor 555)或質量標 簽(mass tag)相綴合。在另一些實施方案中，抗IgE抗體是未標記的并且通過使用另外的抗體檢測，另外的抗體一般稱為第二抗體，如所述其可以是帶標記的。在一個優選的實施方案中，抗IgE抗體是抗IgE的未標記小鼠單克隆抗體，其使用帶標記的第二抗體來檢測，如抗小鼠IgG。在某些實施方案中，一個或更多個發光的或發熒光的部分可結合親和素/鏈霉親和素，所述親和素/鏈霉親和素繼而可結合與抗體化學綴合的生物素。在另一些實施方案中，凝集素(蛋白A/G/L)可連接發光或熒光分子，該分子還可連接抗體或其他蛋白質綴合物。在一些優選的實施方案中，使用了酪胺信號放大系統(tyramide signal amplification system),其使用辣根過氧化物酶(HRP)的催化活性以產生抗體的高密度標記。合適的標記和標記方法是本領域已知的并且對本領域技術人員而目是清楚的。在一些具體的實施方案中，帶標記的抗體包含熒光標記。適當的熒光標記為本領域所熟知，例如，非限制性的實例可包括Alexa Fluor488,Alexa Fluor 555、R-藻紅蛋白、Aqua、德克薩斯-紅(Texas-Red)、FITC、羅丹明、羅丹明衍生物、熒光素、熒光素衍生物、級聯藍(cascade blue)、Cy5或Cy3。檢測方法可以是本領域已知的任何合適的方法，如通過光學檢測，包括熒光測量、比色法、流式細胞術、化學發光等。其他方法包括電化學法、放射性方法、壓電法等。檢測結合的另一些方法可以是表面等離子體共振(surface Plasmon resonance, SPR)、表面等離子體顯微鏡(surface Plasmon microscopy, SPM)、表面等離子體突光光譜(surfacePlasmon fluorescence spectroscopy)或SELDI質譜等。技術人員將了解可通過使用檢測方法的組合進行檢測。具體地，通過發光信號的測量/檢測進行結合的檢測，例如通過化學發光化合物產生的化學發光。盡管群體所接觸的許多抗原在一個地理區域和另一個區域之間是共有的，但是可能有特定的抗原在一些區域是常見的但在另一些區域是稀有的。因此，對于每次分析或每一次實施所述方法，合適的抗原可選自在特定地理區域或國家中最常見的抗原，并且所述合適抗原可以變化。表I中鑒定了合適的多種抗原，具體為103種抗原。本領域的技術人員能夠選擇適當的抗原和合適的抗原并且抗原制品為普遍可商購的。盡管一般分開地評估每個個體樣品，但是優選地，基本上同時測量每個樣品中對所述多種抗原的反應性水平。例如，如果所述多種抗原包含50種抗原，那么對于1000個對象的組，將進行1000個單獨的測定并且測量50，000個反應的結果。一個接一個測量如此大量的反應，盡管是可能的，但通常是不可行的并且將花費大量的時間和人力去完成。因而，為了有助于平行處理大量的抗原，優選地，所述多種抗原結合至至少一個具有多個地址的固體支持物，所述地址每個具有一個獨特的(即特異性)抗原布置于其上。固體支持物的使用是有利的，因為其能夠平行處理大量的抗原，同時盡可能地減少所需的時間和人力。所述固體支持物可以是本領域已知的任何材料，例如玻璃載體、合成載體、硅片或膜。合適的材料包括塑料、玻璃、硅、陶瓷或有機聚合物(包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、纖維素和硝化纖維)。其自身表面可以是如下形式或其部分載玻片、片、微量培養·板或微量滴定板、托盤、膜、纖維、孔、丸、棒、棍、管、珠等。所使用的術語“結合”意指物質(在本發明情況下為抗原)在分子水平(即，通過共價或非共價鍵或相互作用)上保留、固定或基本上結合至表面。所使用的固定方法應當是可再現的，適用于不同特性(大小、親水性、疏水性)的抗體、可用于高通量和自動化，并且維持抗原與抗體形成復合物的能力。非限制性的實例是本領域已知的非限制性的合適方法包括被動吸收、基于親和性的結合、與化學活化表面共價偶聯、光化學交叉偶聯等。術語“地址”用于指固體支持物或固體支持物上確定位置的獨特特征，其允許識別特定抗原，從而實現對針對特定抗原的IgE反應性水平的測定。在一個實施方案中，所述固體支持物是多個珠子，其每個可通過地址分別識別。合適的地址包括RFID標簽、質量標簽、熒光標簽、光學編碼、數字磁性標簽、光譜編碼等。在另一些實施方案中，所述固體支持物為微陣列。本文所使用的術語“微陣列”指用于結合IgE抗體的點的有序陣列。本發明的微陣列包含至少2個、至少9個、至少50個、至少100個、至少500個或至少1000個點。在一些實施方案中，微陣列可包含至少10,000、40，000,100, 000或I, 000，000個不同且獨特的點。點的密度為約100個/cm2至約1000個/cm2或更高。“點”表示放置于陣列表面上特定地址(在本發明情況下為物理位置)的一種或更多種試劑(在本發明的情況下為特定抗原或變應原制備物)。通常情況下，點的特征在于存在一種或更多種特異性分子(例如，特定的蛋白質、變應原提取物、抗原等)。點直徑可為10至2000 μ m，50至500μπι或150至250 μ m。為了形成陣列，抗原可以以O. 008mg/ml至3mg/ml的點樣濃度施于固體支持物的表面。適于測量或讀取來自微陣列的熒光信號的系統是已知的。通常，通過在激光點下二維掃描載玻片來構建圖像。在約I分鐘內可取得圖像，但是在圖像分析處理方面，分析是復雜的。由于所產生的大量數據以及產生來自每個點或微點的集成信號的清晰測定所需的分析算法，這些處理可以是復雜的。在本發明人之前的專利申請(公開為W0/2003/091712)中，為了逐個像素的構建每個點的圖像，本發明人發現有可能通過下述方式讀取熒光，即通過照射陣列上每個點的整體以及在單一測量中測量整個點的熒光，而不是分數次對每個點的一部分進行掃描和照射。這個方法使得低成本光源LED可用作發光源。每個熒光分子接受相同的光能，如同如果相干光源被用作發光源時那樣。但是檢測器產生單一閱讀，不需要進一步信號分析(而不是400像素圖像/點，其需要復雜的圖像處理以計算整個測量)。在一些情況下，由于干涉作用而在信號中引入的額外噪音，相干光源的使用是不利的。在另一些實施方案中，如在國際專利公開W02006/138161中所公開的設想使用微懸臂梁。在另一些實施方案中，使用一個或更多個微流體芯片進行測定。該方法的第三個步驟包括，(C)鑒定在對象組之間顯示出IgE反應性水平顯著差異的所述多種抗原的子集，其中針對所述子集的IgE反應性水平與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關聯。 可通過使用統計數據分析方法來確定對象組之間的顯著差異的IgE反應性水平。數據集的統計分析可被用以確定一種或更多種抗原是否與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關，即相關聯。例如，根據針對特定抗原的IgE反應性水平，對象可被分為至少兩個分類。之后，通過聚類或學習算法分析IgE反應性和健康狀況之間的相關性。作為非限制性的實例，合適的方法包括有監督和/或無監督聚類算法、k-均值、主成分分析、分層聚類、最近鄰分析、支持向量機、人工神經網絡等。特定的聚類或分類中的顯著量對象(例如，至少50%、60%、70^^80^^90%或更多)可具有第一健康狀況，以及在一個或更多個其他分類中的顯著量患者可具有不同的健康狀況。從而，相對于另一組對象，可鑒定IgE對第一組對象中多種抗原的反應性的差異。對此類抗原反應性的水平可用作生物標志物用于預測/確定對象的健康狀況、臨床效果或治療效果。與臨床病癥相關的并經鑒定的反應性水平代表了反應性的理想模式，該模式是不同健康狀況的對象的代表。結果，此類疾病特定的模式或特征譜可進行比較以預測/確定對象的健康狀況、臨床或治療效果。合適的方法如下例證，其包括聚類分析以將數據分配到子集或聚類。分析的終點是與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關或相關聯的來自所述多種抗原的抗原子集的鑒定。針對抗原的子集IgE反應性可用以制備可用于比較的針對特定臨床狀況的一般性反應性特征譜。在下面的實驗部分例證了鑒定與此類臨床診斷相關的51種抗原的子集。表4中列出了包含所述抗原子集的抗原。顯然，任何特定子集的組成取決于所使用的多種抗原的組成。更顯然，可合并與臨床診斷相關聯的抗原子集。例如，第一集合包含20種抗原，第二子集包含30種抗原，假定所述子集之間沒有共有的抗原，合并的子集將包含50種抗原。但是，子集之間可能有一些交叉，使得在組合的子集中抗原的總數可能少于組合前每個子集中抗原數目的總和。在這種情況下，所使用的術語合并簡單地意指所述抗原一起使用，例如分別放置在同一微陣列上。本發明的第二個方面提供了評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險的方法。該方法包括(a)在分離自所述對象的樣品中測量針對生物標志物集合的IgE反應性水平的步驟。在本發明的背景中，至少一定比例的生物標志物來源于與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關的抗原子集。優選地，所述抗原已根據本發明的第一個方面被鑒定。從而，此類抗原已知與臨床診斷相關聯。因此，本文所使用的術語“預先確定相關聯”指，在用于所述方法之前，一個要素(例如抗原)的反應性已顯示出與所關心疾病或異常具有統計學上顯著的相關性。在下文的實驗章節中并根據本發明的第一個方面例證了用于確定此類相關性的合適方法。所使用的術語“比例”意指至少10 %的生物標志物是預先確定與關心的疾病或異常相關的抗原。更具體地，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%，或者至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的生物標志物預先確定與關心的疾病或異常相關。在某些實施方案中，所有的生物標志物(100% )預先確定與關心的疾病或異常相關。對象的IgE反應性特征譜之間的相似或差異指示了對象的分類成員及其各自的健康狀況。相似或差異可由任何合適的方法確定，例如由上述的統計學方法。比較可以是 定性的、定量的或其兩者。針對抗原子集的IgE反應性可用以制備反應性特征譜，其可用于與特定的臨床病癥的一般性特征譜進行比較。對象的生物標志物特征譜可與參照特征譜(手動地或電子地)相比較。在一個實例中，通過將針對特定抗原的每個IgE反應性水平與參照數據集或特征譜中針對特定抗原的一般性IgE反應性水平進行比較，來實施所述比較。針對特定抗原的IgE反應性可具有絕對值或歸一化的值。可通過倍數變化、絕對差、模式識別或比較或者其他合適的方法(包括算法)來評估針對對象的特定抗原的IgE反應性與參照特征譜或數據集之間的差異。在某些實施方案中，在來自對象的樣品中，針對生物標志物集合中至少75%的IgE反應性水平高于3. 51 IU/ml表明對象可能發生或已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎。在另一些實施方案中，反應性水平可高于O. 71IU/ml、高于3. 51IU/ml、高于
17.51IU/ml或高于50.01IU/ml。顯然，IgE反應性與針對抗原的應答將有變異性。因此，優選地,針對至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少91 %、92%、93%、94%、95%、96^^97^^98^^99%或100%的所述多種抗原的陽性反應表明對象可能發生或已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎。另外，顯然可以有指示臨床狀況但在抗原之間有所差異的特定的反應性閾值水平。因此，為了診斷或預測的目的，17.51IU/ml的反應性水平可指示一個抗原的陽性結果，但是指示另一個的陰性結果。在一些具體的實施方案中，生物標志物集合包含9至51種預先確定與關心的疾病或異常相關的抗原。預先確定與關心的疾病或異常相關的抗原包括抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907和X910。在下面的實驗部分中例證這些抗原的鑒定。在一些具體的實施方案中，優選地至少包括抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18。如上所討論的，關于本發明的第一個方面，可通過將所述多種抗原或生物標志物與分離自對象的血清相接觸以及通過使用抗IgE抗體測定與每種抗原結合的IgE的量來確定IgE的反應性水平。IgE抗體的檢測表明致敏過程已經開始。伴隨癥狀和陽性病史，其確認了臨床診斷；或者，在沒有癥狀的情況下，其可預測變應性疾病隨后的發展。常常發現，特異性IgE抗體應答先于癥狀出現，而癥狀隨時間隨后才發生。再次，如上述，關于本發明的第一個方面，所述抗原與固體支持物結合。因而，在本發明的第三個方面中，提供了抗原微陣列，其用于評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險的方法，所述抗原微陣列包含抗原F95、GU G3、G4、G12、G14、G15和G18和任選地一種或更多種選自以下的抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。優選地，明確地排除不根據本發明的第一個或第二個方面使用的或者不用于評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險的抗原微陣列。 在本發明的第四個方面中，提供試劑盒，其包含(i)抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15 和 G18 以及(ii)任選地一種或更多種抗原 C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、Wl、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。以適用于根據第一個和第二
個方面的方法或適用于根據本發明的第三個方面的制備微陣列的形式提供抗原。此類試劑盒還可包含其他組分，例如抗IgE抗體、洗滌緩沖液、稀釋劑、抗體(即一抗、二抗、三抗)、檢測劑、熒光團、手套、移液器槍頭、操作說明書等。優選地，抗原以微陣列上點的形式提供并且還可包括對照和標準品等。因而，所述試劑盒可包含陣列，其由下列抗原組成C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907和X910。或者，所述試劑盒可包含陣列，其包含抗原C2、DU D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。在本發明的第五個方面中，以及如在實驗部分所例證的，提供了第一個和第二個方面的方法、第三個方面的微陣列或第四個方面的試劑盒的用途，其用于評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險。在本發明的第六個方面中，提供了前述方面的方法、微陣列或試劑盒在篩選用于治療哮喘、結膜炎或鼻炎的化合物中的用途。例如，所述方法可包括以下步驟(a)在分離自對象的第一樣品中測量針對生物標志物集合的IgE的反應性水平；(b)在分離自對象的第二樣品中測量針對生物標志物集合的反應性水平和(c)比較IgE的反應性水平以確定任何具有以下特征的差異，即一定比例的生物標志物是預先確定為與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關的抗原。在一個實施方案中，第一樣品可在用藥物或藥品治療前取自對象。第二樣品可在用藥物或藥品治療后取自同一對象。在第一和第二樣品之間的反應性水平的任何改變可指示特定的藥物或樣品在治療哮喘、結膜炎或鼻炎中有用或者具有臨床應用。或者，該結果可指示針對個體對象的治療方案的效力。顯然，根據第一個、第二個、第五個和第六個方面的方法或其每個階段之間，可包括任選的洗滌、干燥和/或孵育步驟。所述方法還可任選地包括所述方法的一個或更多個步驟之間的“封閉步驟”，例如其中將非相互作用蛋白(如牛血清白蛋白(BSA))的濃溶液添加至例如微量滴定板的全部孔中。此類蛋白阻斷了其他蛋白的非特異性吸附并且在降低可干擾測定靈敏度的“背景”假象中可能是有益的。通過引用下列描述和實施例可更好的理解本發明，下列描述和實施例意圖作為本發明的方法的示例。
實施例群體案例研究這個研究包括后代患特應性哮喘的家族。所有的哮喘患者是特應性的。在4年的 時期內收集特應性哮喘的兄弟姐妹兩人(同胞親屬)和三人，主要來自兒科和肺病中心。為了避免擬表型(phenocopy)，所有的患者滿足下列標準至少3代為撒丁島人來源和訪視時年齡> 6歲。在募集時期，每個對象接受面試,通過身體檢查確定疾病狀況,請求使用個人健康記錄的許可，以及收集血液樣品。每個參與者簽署經當地倫理委員會(Azienda SanitariaLocale number 8 protocol 24/Comitato Etico/02, authorization number 4737)批準的知情同意書。哮喘由肺科醫師診斷，依照美國胸科學會(American Thoracic Society)標準(I)由肺量測量法評價肺功能用升/分鐘表示I次的用力呼氣量(FEVl)。根據世界衛生組織指南(World Health Organization guideline)(全球哮喘防治創議(GlobalInitiative for Asthma)),醫師進行問卷調查以收集病史并將哮喘嚴重程度分為4個水平。記錄哮喘藥品和任何其他藥劑的使用。使用標準方法通過對常見吸入性變應原的陽性皮膚測試來測定特應性。關于青春期(18歲)結束后哮喘癥狀的持續性由醫師與具有早期發作史的患者面談。樣品由總計872份血清(包含440位父母的及其子女(432個個體))組成。在研究組內，428位兒童和58位父母(總數的55. 73% )被診斷為哮喘，341位父母(總數的39. 11% )被分類為非哮喘，但是他們中的一些患特應性相關的病癥，如鼻炎、結膜炎和濕疹，剩余的5. 16%被分類為未證實的哮喘診斷。將這些數據列于表2中。基于微陣列的免疫測定的開發微陣列免疫測定法由4個階段組成(“印刷”、處理、掃描、定量和分析)。微陣列的制備為了產生陣列，將選擇的變應原(天然提取物、經純化的變應原和重組分子)一式兩份地印刷在乙醛活化的玻璃顯微鏡載玻片上亂序的位置，以使得處理錯誤的影響最小化。所述陣列還可包含陽性和陰性對照、空白和內部劑量應答曲線。為了減少標準點樣時間、減少批次間變異性和增加每次測試所處理的芯片數目，在單個顯微鏡載玻片上印刷兩個芯片(“變應芯片”)。每個微陣列批次包含120個載玻片，總計240個變應芯片(執行時間為14小時)。研究組的分析需要總共480個經印刷的載玻片，相當于960個芯片，并且全部的印刷過程被分成4個批次。每個芯片包含使用高速機器人技術(Microgrid Compact ；Biorobotics) 一式兩份地印在經乙醒活化的玻璃顯微鏡載玻片(CEL Associates)的103種變應原。在23°C /60°C濕度下“印刷”陣列并在印刷箱內保存過夜。最初在pH7. 4的PBS (重構緩沖液)中重構變應原(由Allergopharma提供)，其終濃度為O. 4至40mg/ml,然后在下列點樣緩沖液中點在陣列上PBS pH7. 4、甘氨酸ρΗ2· 4、硼酸鹽ρΗ9· 4、甘油10%、DTT 5mM、SDS (O. 2%；0. 05% )、吐溫20(0. 01% )D每個變應原的點樣濃度為O. 008至3mg/ml。微陣列加工用含有2% BSA的PBS在室溫下將經印刷的載玻片封閉I小時。之后將載玻片與各個血清樣品(100μ I)在37°C下孵育60分鐘。為了顯現結合的IgE，載玻片用抗人IgE的第二小鼠單克隆抗體(O. Hyg/miaOOy I)在37°C下孵育45分鐘，然后用抗小鼠IgG HRP綴 合抗體(1.6 μ g/mL，100 μ I)在37°C下孵育45分鐘，最后用以I : 200稀釋的酪胺-Alexa555 (具有HRP-鏈霉親和素和Alexa Fluor 555酪胺*的TSA Kit#42 *，* 50-150個載玻片*) (InvitiOgen) (100 μ I)在37°C下孵育15分鐘。在測量熒光信號之前，載玻片37°C下干燥。熒光測量使用突光檢測掃描儀ScanArray Gx掃描經加工的載玻片并且使用由PerkinElmer Life Sciences Inc提供的ScanArray 軟件產生圖像。在相同的設置下掃描所有的載玻片90%激光功率和60%光電倍增管增益。結合的IgE的定量使用ProScanArray Express 3. O版軟件獲取突光信號。針對內部陰性對照校正各個點的PMC讀取值，以確定高于背景的信號。對各個變應原進行一式兩份的測量。通過具有在每個微陣列上所印記的內部校準曲線的插值確定變應原結合的IgE的濃度(IU/ml)。校準曲線由遞減的鏈霉親和素的量(80 μ g/ml ；53. 3 μ g/ml ；35. 6 μ g/ml ；
23.7 μ g/ml ；15.8yg/ml ；10. 5yg/ml ；7. 02 μ g/ml)組成，其捕獲加入至封閉溶液的骨髓瘤生物素化的IgE。為了將IU/ml值賦給校準曲線，使用由微陣列載玻片產生的外部參考曲線對不同量的經印刷鏈霉親和素下所收集的平均信號進行插值處理，該微陣列載玻片用重復的山羊抗人IgE印刷并用遞增濃度的人IgE(WH0參考標準0. 35IU/ml, I. 0IU/ml,3. 5IU/ml, 10. 0IU/ml,50. OlU/ml)孵育。使用校準曲線對從變應原收集的信號進行插值處理，以獲得IU/ml值并轉化成在標準反應性等級中通過繪制數據的分類得分。分類得分值分類0(少于0.35IU/ml);分類 1(0. 35 0. 71IU/ml);分類 2(0. 71 3. 5IU/ml);分類 3(3. 51 17. 5IU/ml);分類4(17. 51 50IU/ml);分類 5(50. 01 100IU/ml)。使用熒光免疫測定分析血清IgE反應性，其作為基礎并入103種變應原的微陣列，這些變應原代表了從歐洲中南部與特應性疾病最頻繁相關聯的變應原中選擇的11個獨特的變應原分類。分析血清反應性特征譜在用103-維載體(每個變應原I維)編碼每個血清反應性特征譜之后，使用Cluster 3. 035軟件通過k_均值聚類分析來分析通過血清與陣列免疫測定一起孵育而產生的反應性特征譜，以及使用MapleTree來顯現聚類結果。通過使用不同數目的聚類進行特征譜分配的嘗試，以鑒定使得聚類內相似性和聚類間差異最大化的條件。為此，我們分析了具有數個性能指標的聚類譜，如由Machaon37、38軟件提供，以驗證每種分配嘗試的統計學顯著性。在k = 3的條件下(即設置成獲得3個聚類的k-均值聚類分析)，5個性能指標中有4個，如由Machaon得到的最高值所計算的。分析在k = 3時使用k_均值聚類分析產生的聚類以尋找與年齡，性別和病理狀態(哮喘、鼻炎等)存在、其持久性和/或嚴重程度，發作年齡等的相關性。在SPSS軟件內進行統計檢驗，如皮爾遜(Pearson' s) χ 2檢驗和Kruskall-Wallis非參數檢驗，并且制作Excel以調查在聚類中是否病理狀態的頻率是否有顯著差異以及每個聚類是否與作為整體的研究群體有顯著差異。聚類分析根據血清反應性特征譜的相似性，我們使用k_均值聚類分析將血清分成明顯的·聚類。k_均值算法是一種無監督迭代算法，其將對象分配位固定的用戶定義數目(k)的聚類，使得聚類內部相似但是與外部不相似。為了定義血清之間的距離，使用歐幾里得距離(Euclidean distance)相似性度量。進行數次迭代以盡可能減小每個聚類內距離的總和以及通過收斂提供最佳的聚類分析解決方案。這個分析顯示在算法的10000次迭代內實現了收斂至最佳的解決方案。應用具有不同k值(I至14和20)的多個統計檢驗，以確定產生彼此顯著不同的聚類的劃分。它們包括(I)輪廓圖驗證法(Silhouette Validation method)將輪廓圖(silhouette)的概念定義為聚類緊密度和隔離度的指標。良好的劃分過程導致聚類緊密(即每個聚類內的對象彼此接近)并且良好的分離(即聚類彼此遠離)，而糟糕的劃分產生彼此太接近(接近到它們可能會部分重疊的程度)的聚類并且聚類內的對象可能較分散，從而使得難以將一些樣品分配到特定的聚類。對于第i個對象的輪廓圖的數學模型，S(i)為“，其中a(i)是在同一聚類中第i個對象相對于全部其他對象的平均不相似性；b(i)是第i個對象相對于另一個最接近的聚類中全部對象的最小平均不相似性。S(i)為-1(錯誤分類的對象)至1(對象的最佳劃分結果)。全部聚類對象的S(i)的算術平均數提供了整個聚類過程的整體性能。指數越接近1，聚類結果越好。(2) Dunni s有效性指數。與輪廓圖法類似，這個技術也是基于良好劃分產生緊密的和良好分離的聚類的概念。模擬此類屬性的指數，Dunn' s有效性指數，被定義為
'1H- ' +，其中d(ci、cj)是聚類ci和cj之間的距離(聚類間距離)；d’ (ck)是聚類ck
的聚類內距離，η是聚類的數目。在良好的劃分處理中，聚類間的距離是最大的(聚類之間的最大分離)，而聚類內的距離是最小的(聚類內的最大緊密)。D越高，聚類結果越好。(3)Davies-Bouldin有效性指數。另外通過DB指數來獲得緊密度和隔離度的同一
概念，所述DB指數被定義為’ ·%(- ；, I5其中η是聚類數目，Sn是屬于聚類的所有對象到
其聚類中心的平均距離(緊密度的度量)和S(Qi;Qp是聚類中心之間的距離(隔離度的度量)。如果聚類緊密且彼此遠離，那么DB很小(良好的聚類結果)。jj(4) C指數。C指數的定義如下·β= _7就單一聚類來說，假設其所有對象組
ijIBm
織成對。假設在給定的聚類中有I對。那么S是那些I對的距離的總和。這可被認為是該聚類緊密度的度量。就整個對象的集合(即所有聚類)來說，通過在所有可能的對中(即聚類內以及聚類間二者)取可見的I最小距離來計算另一個距離總和Smin。類似地，將所有對中I最大距離的總和計算為smax。根據此定義，小的C值是良好聚類結果的指標。(5)分離指數。這個技術是基于以下假設，如果對象隸屬于某聚類，那么其最近的鄰居也可能隸屬于同一聚類。在良好的聚類結果中這個性質應被最大化。為了在數學上獲取這個概念，引入了下列表達其中Xi是第i個對象，Vk (Xi)是\的最接近的鄰居的一部分，已被正確地分配到同一聚類，以及η是數據集中對象的總數。對于良好的聚類結果，每個聚類中每個對象具有高的Ik值是理想的。對于每個個體，我們得到了針對103種獨特的變應原的IgE反應性特征譜，這些變應原選自歐洲中南部最常見與特應性疾病相關聯的那些。在分類得分和所識別的變應原的組合方面，個體特征譜的分析顯示出很高的IgE識別模式多樣性水平。極少數的特征譜是相同的，并且許多在其他方面健康的個體顯示出針對許多變應原的出人意料復雜的模式。這一多樣性有可能反映了變應原暴露與研究群體遺傳多樣性方面的差異。為了鑒定在IgE血清反應性方面顯示出相似性的組，按照我們通過實驗驗證使得聚類間相似性和聚類內差異性最大化的設置，我們使用k-均值聚類分析來處理特征譜。每個聚類的IgE反應性特征譜或節點在圖5a、5b和5c中所示。這個分析產生了 3個聚類，其在所識別的變應原的組合以及受不同特應性疾病(包括哮喘、鼻炎和結膜炎)影響的個體比例方面彼此有顯著差異。特別地，哮喘的個體貢獻了聚類I反應性特征譜的83%。與研究群體中哮喘的個體的那些百分比相比，這個百分比顯示了非常高的統計學顯著性差異(P< 1E-8)(表 3)。有意思的是，盡管聚類O和聚類2在哮喘的和非哮喘的個體比例上不顯示顯著性差異，但是它們的組成分析證明了，與聚類I相反，它們富含同一家族核心的成員。我們認為，聚類O和2的組成反映了家族成員暴露于包含在微陣列中的常見變應原集合。盡管這些變應原具有強大致敏能力，但是它們與哮喘無關，而是貢獻于形成反應性特征譜，因此可掩蓋額外的相關性。鑒定哮喘相關的變應原通過使用Mann-Whitney檢驗比較哮喘的和非哮喘個體針對每個變應原的反應性，以鑒定在兩個組中顯示最顯著差異的那些變應原。研究樣品滿足下列要求以應用Mann-Whitney檢驗i)哮喘的和非哮喘的組被認為是獨立的；ii)血清反應性值可被認為是定序型隨機變量；iii)有足夠數目的可比較案例。另外，這個檢驗不需要特定的值的分布(例如高斯分布(Gaussian))并且可使用具有不同個體數目的兩組(但是相似性給出了較好的執行)來進行。數據分析根據所指個體的哮喘狀況，在輸入文件中標記每個變應原的反應性數據。哮喘的(對應于標記“2”)，非哮喘的(對應于標記“I”)。從文件中手動刪除對應于具有未證實的哮喘臨床狀況之個體的血清(5. 16% )。在排除未證實的診斷的個體之后，用于該分析的血清總數為827。所存在的變應原的起始數目為103。每種變應原的反應性值為O至5(微陣列記錄的分類得分)。使用SPSS，在進行分析之前，將數據轉換成定序型數據(ordinal)。這個分析產生了 51種變應原的列表(表4)，其被用以建立使用k-均值進行聚類分析的新的反應性特征譜的集合。節點3、4和5的反應性特征譜分別在圖6a、b和c中所示。這些新的聚類顯示了一些有意思且新的特征。在IgE識別模式和血清組成方面，聚類4與聚類I非常相似，但是在哮喘的個體百分比上顯示出進一步增加至88%以及統計學顯著性進一步增加。兩個剩余的聚類也在其組成上顯示出特別顯著的統計學差異。聚類3富含非哮喘個體(69% )，而聚類5含有高百分比的哮喘患者(82% )。聚類中哮喘和結膜炎(但濕疹并非如此)的分布非常接近地反映了哮喘的分布，其與其他觀察結果(建立了這些特應性疾病中的關聯)一致。如預期地，我們沒有觀察到在聚類3、4和5中富含同一家族核心的成員，從而表明相應的特征譜與哮喘臨床狀況而不是與接觸變應原密切相關。包含最高比例的哮喘的個體的兩個聚類(聚類4和5)具有重疊的IgE識別特征譜的特征。聚類4的譜顯示了針對9個另外的主要來自食物和禾本科的變應原的特異性反應性。值得注意地，聚類4而不是聚類5顯示了與哮喘嚴重程度的顯著相關性，從而揭示一方面的疾病嚴 重程度與另一方面的IgE應答復雜性和特異性之間的令人意外的相關性。其他數據存在于在圖7a和b中。我們的數據證明了哮喘與針對單一變應原的IgE抗體應答之間的相關性顯著低估了針對變應原庫的個體反應性的內在相似性和差異性，這可以與理解疾病的原因、嚴重程度和進展有關。這也解釋了為什么抗體應答與疾病之間的關聯性為何難以鑒定。與此相反，通過分析針對大的變應原集合的IgE血清反應性特征譜，我們可證明，哮喘的和非哮喘的個體在所識別的變應原數目和分類方面具有顯著差異。人工神經網絡使用具有ANN專用模塊的專業軟件應用程序，如RBF(徑向基函數算法(RadialBasis Function Algorithm) -SPSS 17. 0),來開發分類器。RBF是設計用于在SPSS統計學軟件應用程序內進行有監督訓練，SPSS提供了一整套強大的函數用于訓練專用于分類任務的神經網絡，例如針對我們的情況。通過使用作為輸入數據的包含51種變應原和827個個體的血清反應性特征譜的樣品數據集合來完成神經網絡分析。在該樣品中，485個是哮喘陽性個體，342個是陰性。為了評估通過減少分類器所考慮的變應原數目而實現的實際改善(通過Mann-Whitney檢驗的方法，如之前所示例的)，對整個變應原集合訓練分離的RBF，然后其結果與對過濾的集合進行的RBF進行比較。樣品首先是隨機的(參見樣品章節的處理)并且所使用的訓練樣品的大小為整個群體的約60%，留下剩余的個體用于驗證目的(10%測試，以及30%保留(holdout))。使用隨機化標準選擇訓練子集，確保樣品相對于整個群體的代表性。這是為了確保RBF復制了代表全部群體的行為。全部有監督訓練過程重復10次，每次都在一個新的之前未訓練過的網絡上進行，而且每次用初始群體的一個新的隨機化子集。這是為了觀察可與訓練樣品代表性中的變異性相關聯的的任何執行中的變異性。RBF網絡中有3個層(輸入層、RBF層和輸出層)。有許多類型的徑向基函數；我們使用歸一化的RBF(NRBF)。為了評估神經網絡的真實效率，神經網絡運行不同的10次。網絡的總效率為這10次不同試驗的平均值。哮喘被視為因變量，分類得分變應原為協變量。所使用的案例劃分的具體相對數目由以下組成訓練6(60%)，試驗1(10%)和維持3(30%)。圖8示例了 RBF網絡的圖示，其分別由3層組成輸入層(框I 51)、隱層(圈I 8)和輸出層(在黑框中的哮喘分類)。樣本數據的處理為了避免樣本定向偏差，首先將血清隨機化。通過在Matlab中使用RAND變量實現隨機化，得到隨機數目I至827，并且用其標記每個血清。之后使用字母順序對最初的血清順序重新取樣。使用的設置為了評估神經網絡的真實效率，神經網絡運行不同的10次。網絡的總效率為這些10次不同試驗的平均值。
分析、神經網絡、徑向基函數變量因變量哮喘協變量C2、D01、D02、D03、D70、D71、D72、D73、E01、E03、E081、E082、F04、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G01、G02、G03、G04、G05、G06、G08、G12、G14、G15、G18、106、K87、MOUM03、M04、M05、M06、T04、T06、T07、T09、T14、T901、W01、W06、X902、X903、X904、X905、X907、X910協變量的重標度無劃分指定相對案例數目訓練6(60% )，試驗 1(10% )和維持 3(30% )結構隱層中單元數目激活發現范圍內最佳的單元數目范圍激活自動計算范圍隱層的激活功能標準化徑向基函數隱藏單元中的重疊自動計算重疊的量以使得輸出網絡結構選擇說明、圖表、突觸權重網絡性能選擇模型概要、分類結果、Roc曲線、由所觀察到的圖表的預測激活案例的處理概要存儲存儲每個因變量的預測值或種類存儲每個因變量的預測假概率
存儲的變量的名稱選擇自動產生的唯一名稱完成輸出激活將突觸權重評估輸出至XML文件選項 用戶——遺漏值選擇排除結果包含103種最常見變應原的微陣列免疫測定用以研究屬于283個家族的872個個體的IgE血清反應性，其中所有的子女(I至3個)都受哮喘影響。參與這個研究的個體包括父母和所有子女(大部分兒童小于27歲(75%的兒童小于27歲))。從每個個體中收集關于哮喘(發作年齡、嚴重程度和持續性)以及伴隨存在的其他特應性疾病的詳細臨床歷史的信息。對于每個血清樣品，對免疫測定進行校準以測量與每個排成陣列的抗原相結合的特異性IgE的濃度(O. 35IU/ml至100IU/ml)。將以IU/ml計的反應性值轉化為使用經驗證的O 5級的分類得分。這個方法產生了 872個獨特的IgE反應性特征譜和超過90，000個抗體-抗原測定。對于每份血清，產生了與IgE分類得分(O至5)相匹配的針對排成陣列的變應原的顏色編碼的數字特征譜(從黑至白)(圖5a、b、c和圖6a、b和c)。血清具有顯著不同的針對排成陣列的變應原的IgE反應性。許多收集自非哮喘雙親或哮喘兒童的血清與超過40種變應原發生反應，但是哮喘個體顯示出平均最高數目的個體變應原抗體反應。為了研究反應性特征譜的結構，我們使用k-均值聚類分析，通常用以鑒定微陣列數據內的組結構的劃分方法。聚類算法用不同的k的值(3至14和20)進行，以使特征譜分裂成越來越多的聚類。使用5個特定的指標(Silhouette指數、Dunn指數、Davies Bouldin、C指數和分離指數)進行的統計分析，用Machaon計算,表明k = 3是通過將特征譜排列成3個聚類使得聚類內的相似性和聚類間的差異性最大化的參數。為了尋找IgE反應性特征譜和哮喘之間的關聯，我們研究了在k = 3時產生的聚類在哮喘的和非哮喘個體的頻率以及其他特征和病理狀態(年齡、性別、結膜炎、濕疹、鼻炎、哮喘持久性和嚴重程度)的分布上是否有顯著差異。許多獨立的統計分析(皮爾遜χ2檢驗和Kruskal I-Wal I is檢驗)用以評估在聚類之間以及每個聚類與整個樣品之間的每個特征和病理狀態的頻率是否具有顯著差異。特別地，χ2檢驗用于分析二元屬性(即，哮喘的對非哮喘的)，而Kruskal I-Wal I is檢驗在離散數字變量上進行(如哮喘發作的年齡)。這個分析結果表明，3個聚類在哮喘、結膜炎、濕疹、鼻炎和性別的頻率上具有顯著差異。最突出地，聚類I比其他兩個聚類和整個研究樣品顯示出驚人的(83% )顯著更高的比例(χ 2 = 33. 480，P = 2. 16E-08)。在對多個比較進行Bonferroni校正后沒有影響統計顯著性。類似地，顯著地關聯也可通過聚類I的結膜炎和鼻炎觀察到。譜的劃分也強調了聚類中家族核心的有趣分布聚類O和2富含同一家族的成員并且顯示出哮喘的和非哮喘個體的相似百分比，聚類I包含顯著更高比例的兒童，而雙親非常少。這些發現表明，分配到聚類O或2的同一家族的成員具有與哮喘無關的類似IgE識別模式，這可能是因為暴露于排成陣列的變應原特定集合所產生的占優勢的作用。與此相反，家族成員的分離沒有在聚類I中發現，這是由于相應的IgE血清反應性特征譜與所述疾病緊密相關。在對研究群體的變應原暴露沒有詳細了解并且對于引發哮喘相關IgE應答的特定變應原之作用沒有任何事先猜測的情況下，對陣列進行了設計。因此，一些變應原很少被識別而另一些在哮喘的和非哮喘的個體中顯示出類似的反應性百分比，這并不令人驚訝。針對這些變應原的反應性為所述特征譜的形成提供了貢獻，并且可代表掩蓋一些相關性的“背景噪聲”的來源。為了解決這個問題，我們試圖通過以下方式鑒定在陣列中對于哮喘的相關性作出最大貢獻的變異性，即通過用閾值P < O. 05的曼-惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U test)過濾所得結果，以摒除在哮喘和非哮喘個體之間的IgE反應性方面 沒有顯示出差異的那些變應原。該分析產生了 51個相關變應原的列表，其用以產生新的特征譜并在k = 3時進行聚類關聯分析。對新的聚類(聚類3、4和5)進行的相關性研究揭示了 IgE識別特征譜與哮喘之間相關性的進一步增強。聚類4在其結構和組成方面顯示了與聚類I高的相似性，但是與哮喘相關性的統計學顯著性以及相應的反應性特征譜進一步增加(X 2 = 35. 145，P=9. 18E-09)(圖2B)。其他兩個聚類與用整個變應原集合所產生的那些有顯著差異。這次，沒有在聚類I中所包含的大多數哮喘的個體與聚類5的反應性特征譜顯著相關(χ2=22.958，P = 4.97E-06)，而聚類2包含了大多數非哮喘的個體(χ2 = 31. 172，p =
7.08E-08)。甚至在對多個比較進行Bonferroni校正后，哮喘的和非哮喘個體分布的差異仍保持高度的顯著性。與其他聚類相比，在聚類I中觀察到針對結膜炎和鼻炎的強相關性。值得注意的是，由過濾的變應原集合所產生的聚類沒有顯示出家族成員的共分離。有趣地，兩個獨特的反應性特征譜4和5與哮喘顯著相關。這兩個特征譜具有共同的IgE反應性模式，51種變應原中的20種被這兩個聚類的血清所識別，而聚類4的血清還與主要來自食物和禾本科的9種變應原(變應原19 23和17 30)發生反應。值得注意的是，與所有其他的聚類和群體研究樣本相比，聚類4顯示了顯著更高比例的被診斷有嚴重哮喘的個體(嚴重程度分類3和4)。使用參考譜的預測將一些聚類的反應性特征譜與哮喘相關聯的異常強的相關性促使我們生成了人工神經網絡(ANN)分類器，其設計用于根據哮喘的和非哮喘個體的反應性特征譜來區分二者。這是通過使用徑向基函數(RBF)而開發的，其支持通過樣品教導(teaching-by-example)的訓練方法(又稱監督式訓練/監督式學習)。在監督式訓練中所使用的每個特征譜樣品包含關于51種經過濾的變應原的反應值和關于哮喘狀況的個體的健康狀況的信息(期望的分類結果)。用于訓練RBF(訓練集合)的特征譜由整個研究血清樣品的60%組成。另外10%的譜被保留用以評估在訓練期間(測試集合)的預測精度。留下剩余的個體(即整體群體的30% )并用于評估在10次獨立運行中網絡的性能(保留集合(holdout set))。ANN將82%哮喘的患者正確地分為“哮喘的”，約72%非哮喘患者分為“非哮喘”。RBF的整體性能符合特征譜相關性分析由RBF分類器將哮喘的患者正確的識別為哮喘的平均百分比接近在聚類4和5中所存在的哮喘的患者之組合的百分比。圖9a顯示了 ANN通過預測-觀察性能圖。框線圖代表了 RFB輸出種類的預測的假概率(predicted-pseudo-probability);對合并的訓練和測試樣品，針對已知臨床狀況的哮喘⑴哮喘(2)，繪制哮喘的(灰色)和非哮喘的(白色)。圖9b :針對合并的訓練和測試樣品計算ROC曲線，其中哮喘(黑色)、非哮喘(灰色)。圖10示例了 ANN哮喘分類器一致性性能。針對選擇的個體的已知臨床狀況，基于皮爾遜X2檢驗評估保留樣品的ANN預測的哮喘狀況。構建來自哮喘患者的組合文庫為了分離和表征對與哮喘、結膜炎或鼻炎相關的抗原具有特異性的人IgE抗體， 在本研究中構建來自哮喘的患者的IgE組合文庫。外周血單個核細胞從150ml肝素化的血液樣品(獲自患者)中獲得。簡要地，通過菲克帕克(FicolΙ-Paque)密度梯度離心制備細胞。通過Davis等，1986的異硫氰酸胍法制備RNA。進行數個獨立的cDNA合成以及使用RNA PCR試劑盒(Perkin-Elmer)進行PCR擴增反應。簡言之，方案與Steinberger等，1996所使用的相同。將總RNA(20 60 μ g)與對ε 鏈的恒定區(Cl，5’ -GCT ACT AGT TTT GTT GTC GACCCA GTC;C2，5’ -CGA CTG TAA ACTAGT CAC GGT GGG CGG GGT G)和對輕鏈(Ckla，5，_GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCCTGT TGAAGC TCT TTG TGA CGG GCA AG ;Ckld，5’ -GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACTCTC CCCTGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G;C2，5’ -CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACATTC TGT AGG)特異的10 20pmol寡核苷酸引物混合，在65°C加熱5分鐘，之后根據供應商的方案用于2小時的逆轉錄反應。之后,將逆轉錄反應和對重鏈Y,5' -CAC TCC CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCTGG ；V,5/ -GTC CTG TCC CAGGTC AAC TTA CTC GAG TCT GG ；V,5/ -GTC CAGGTG GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG ；V,5' -GTC CTG TCC CAG GTGCAG CTG CTC GAG TCG GG ；V,5/ -GTC TGT GCC GAG GTG CAGCTG CTCGAG TCT GG ；V,5/ -GTC CTG TCA CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG ；V,5/ -AGGTG CAG CTG CTC GAG TCT GG ；V,5/ -CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCGGG 和 κ-或-鏈(Vkl,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC CAG ATGACC CAG TCT CC ；Vkla,5/ -GAC ATC GAGCTC ACC CAG TCT CCA ；Vk2a,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG ATG AC(C/T)CAG TCTCC ；Vk3a,5/ -GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA ；Vk3,5/ -GAG CCG CAC GAG CCC GAGCTCGTG(A/T)TG AC(A/G)CAG TCT CC;VI，5' -AAT TTT GAG CTC ACT CAGCCC CAC ；V3,5/ -TCTGTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG)的可變區特異的寡核苷酸引物用于100 μ I下列條件的熱啟動PCR擴增一個循環的95°C變性5分鐘、54°C退火50秒和72°C延伸50秒，然后40個循環的92°C變性I分鐘、54°C退火50秒和72°C延伸50秒。使用每個恒定區和可變區引物的組合完成PCR反應并合并以構建文庫。根據(Kabat等，1987)合成ε鏈和輕鏈的寡核苷酸引物的序列。根據Persson等(1991)和Kang等(1991b)合成對重鏈的可變區和κ -或-鏈的可變和恒定區特異的寡核苷酸引物。構建IgE組合文庫分別對編碼IgE Fd和輕鏈的PCR產物進行乙醇沉淀、凝膠純化并且用Spe I/XhOI和Sac I/Xba I (Boehringer Mannheim)酶切。經消化的PCR產物經乙醇沉淀并經凝膠純化。為構建IgE組合文庫,首先將輕鏈連接至pComb3H的Sac I/Xba I位點并轉化至大腸桿菌(Escherichia coli)XL-IBlue以產生3X IO7獨立克隆的輕鏈文庫。之后分離包含輕鏈文庫的質粒DNA，用Spe I/XhOI酶切以釋放重鏈填充片段，并經凝膠純化。將編碼IgE Fd的cDNA連接至輕鏈質粒，產生了 5 X IO7獨立初級克隆的輕鏈文庫。
根據Carlos F. Barbas 和 Dennis R. Burton 的 Cold Spring Harbor Course onMonoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries進行用于構建IgE組合文庫的分子生物學操作。分離表達具有與哮喘相關的抗原之特異性的Fab片段的噬菌體克隆用展現與哮喘特征譜有相關性的51種變應原制品(O. 2 μ g/孔)分別包被ELISA板(Costar 3690, Cambridge, MA)。孔用含有3% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水封閉。將新鮮制備的噬菌體懸液(大約10個噬斑形成單位)添加至每個孔，然后在室溫下孵育2小時。將噬菌體移出，然后將孔用含有O. 05% (v/v)吐溫20的Tris緩沖鹽水洗滌一次。噬菌體用含有lmg/ml牛血清白蛋白的O. IM甘氨酸-HCI，pH 2. 2洗脫，然后將洗脫液用2M Tris中和。之后，用該洗脫的噬菌體侵染新鮮生長的大腸桿菌XL-lBlue。一份用以確定侵染的大腸桿菌的滴度。將培養物在含有50 μ g/ml氨芐青霉素和10 μ g/ml四環素的SB培養基中生長。通過使用輔助噬菌體VCS M13侵染，產生了絲狀噬菌體用于下一輪淘選。淘選重復四次。在隨后的淘選期間，對孔進行額外地洗滌，之后通過ELISA分析各個克隆以產生抗原特異性Fab。編碼IgE Fd和輕鏈的cDNA的序列分析測序前，通過ELISA檢查克隆的抗原特異性Fab生產以及通過限制性分析檢查克隆中編碼重鏈片段和輕鏈的cDNA的正確插入。使用Qiagen tips (Hilden, Germany)從重組大腸桿菌XL-IBlue中制備質粒DNA。將兩條DNA鏈進行測序。生產具有抗原特異性的可溶性重組Fab片段為了生產可溶性Fab片段，在第五輪淘選之后，從數個獨立的克隆分離DNA。將質粒DNA用Spe I和Nhe I消化、回收自I %瓊脂糖凝膠、自連并再轉化至大腸桿菌XL-lBlue。包含正確再連接的質粒的大腸桿菌用以生產可溶性Fab片段。簡言之，將單克隆接種至含有20mM MgCl和50 μ g/ml羧芐青霉素的SB培養基中。將培養物在37°C培養6小時，然后通過添加異丙基-I-硫代-3-D-吡喃半乳糖苷至終濃度為4mM進行誘導。之后將經誘導的大腸桿菌在30°C培養過夜，然后通過在4°C以3000Xg離心10分鐘收集細胞。大腸桿菌上清液用于ELISA測定、免疫印跡和親和純化抗原特異性Fab0通過對經純化的抗原的親和性純化抗原特異性IgE
根據制造商說明書,將2. 5mg經純化的抗原偶聯至AminoLinkO柱子(Pierce)。將大約200ml包含抗原特異性Fab的大腸桿菌上清液以20，000 X g離心，然后通過折疊濾器(Macherey-NageI, Duren, Germany)過濾以從溶液中移除沉淀。
將上清液于4°C施加于該柱子，之后用磷酸鹽緩沖鹽水徹底地洗滌柱子直到在洗滌級分中通過光度法在280nm檢測不到蛋白質。用IOOmM甘氨酸-HCl，pH 2. 7洗脫結合的抗原特異性Fab，然后用3M Tris, pH 9中和。
權利要求
1.一種鑒定與哮喘、結膜炎或鼻炎相關的抗原的方法，其包括 (a)測定分離自無癥狀對象組的多個第一樣品中針對多種抗原的IgE反應性水平； (b)測定分離自以具有哮喘、結膜炎或鼻炎為特征的對象組的多個第二樣品中針對多種抗原的IgE反應性水平； (c)鑒定在對象組之間顯示IgE反應性水平顯著差異的所述多種抗原的子集，其中針對所述子集的IgE反應性水平與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關。
2.根據權利要求I的方法，其中基本上同時測定每個個體樣品中的針對所述多種抗原的反應性水平。
3.根據權利要求2的方法，其中所述第一和/或多個第二樣品包含30至800個樣品。
4.根據權利要求1、2或3的方法，其中所述多種抗原包含30至400種抗原。
5.根據權利要求4的方法，其中所述抗原選擇為在特定區域中最常見的抗原。
6.根據前述權利要求中任一項的方法，其中通過將所述多種抗原與分離自所述對象組的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測定與每種抗原結合的IgE的量來確定IgE反應性水平。
7.根據權利要求6的方法，其中所述抗IgE抗體是帶標記的抗體。
8.根據權利要求6的方法，其中所述抗IgE抗體是非標記的并且使用帶標記的抗體對其進行檢測。
9.根據權利要求7或8的方法，其中所述帶標記抗體包含熒光標記。
10.根據權利要求9的方法，其中通過熒光檢測確定所述與每種抗原結合的IgE的量。
11.根據前述權利要求中任一項的方法，其中所述多種抗原與至少一個具有多個地址的固體支持物結合，其中每個地址具有獨特的抗原布置于其上。
12.根據權利要求11的方法，其中所述固體支持物包含多個可分開鑒定的珠子。
13.根據權利要求11的方法，其中所述固體支持物是微陣列。
14.根據權利要求13的方法,其中所述抗原的點樣濃度為O.008mg/ml至3mg/ml。
15.一種評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者是否具有其發生風險的方法，其包括 (a)測定分離自所述對象的樣品中針對生物標志物集合的IgE反應性水平； 其特征在于，所述生物標志物是預先確定與哮喘、結膜炎或鼻炎的臨床診斷相關的抗原，并且其中針對生物標志物集合中至少75%的IgE反應性水平高于3. 51IU/ml表明所述對象可能發生或已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎。
16.根據權利要求15的方法，其中所述生物標志物集合包含9至51種抗原。
17.根據權利要求16的方法，其中所述集合選自以下抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907 和 Χ910。
18.根據權利要求15至17的方法，其中通過將所述生物標志物集合與分離自所述對象的血清相接觸以及使用抗IgE抗體測定與每種抗原結合的IgE的量來確定IgE反應性水平。
19.根據權利要求18的方法，其中所述抗IgE抗體是帶標記的抗體。
20.根據權利要求18的方法，其中所述抗IgE抗體是未標記的并且使用帶標記的抗體對其進行檢測。
21.根據權利要求19或20的方法，其中所述帶標記的抗體包含熒光標記。
22.根據權利要求21的方法，其中通過熒光檢測確定所述與每種抗原結合的IgE的量。
23.根據權利要求15至22中任一項的方法，其中所述抗原結合于固體支持物。
24.根據權利要求23中任一項的方法，其中所述固體支持物是微陣列。
25.根據權利要求24的方法,其中所述抗原的點樣濃度為O.008mg/ml至3mg/ml。
26.根據權利要求24的方法，其中基本上同時測量與所述生物標志物集合中每種抗原所結合的IgE的量。
27.一種用于確定哮喘、結膜炎或鼻炎的發生風險或對其作出診斷的抗原微陣列，其包含抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15和G18以及任選地一種或更多種選自以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、Τ6、Τ7、T9、Τ14、Τ901、Wl、W6、Χ902、Χ903、Χ904、Χ905、Χ907和 Χ910。
28.—種試劑盒，其包含(i)抗原F95、G1、G3、G4、G12、G14、G15 和 G18 ； (ii)任選地一種或更多種以下的抗原C2、D1、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、G2、G5、G6、G8、16、K87、Ml、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 Χ910 ； (iii)抗IgE抗體。
29.根據權利要求28的試劑盒，其在微陣列上包含抗原C2、Dl、D2、D3、D70、D71、D72、D73、E1、E3、E81、E82、F4、F16、F25、F35、F49、F84、F95、G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G12、G14、G15、G18、I6、K87、M1、M3、M4、M5、M6、T4、T6、T7、T9、T14、T901、W1、W6、X902、X903、X904、X905、X907 和 X910。
30.根據權利要求15至26的方法、根據權利要求27的微陣列或根據權利要求28和29的試劑盒在用于評估對象是否已經發生哮喘、結膜炎或鼻炎或是否具有其發生風險中的用途。
全文摘要
本發明涉及用于評估對象是否已發生哮喘、結膜炎或鼻炎或者具有其發生風險的方法。本發明還涉及用于此類方法的抗原集合，所述方法包括鑒定與哮喘、結膜炎或鼻炎相關的其他合適抗原。
文檔編號G01N33/68GK102893158SQ201180009850
公開日2013年1月23日 申請日期2011年2月16日 優先權日2010年2月16日
發明者安德烈亞·克里桑蒂, 塔尼亞·多托里尼 申請人:微測試矩陣有限公司