專利名稱：計數細胞和生物分子的系統和方法
技術領域：
本發明一般地涉及可用于分析和測量細胞和生物樣品的分析和監測系統。更特別地，本發明涉及用于成像、測量、計數、分析和監測微觀顆粒，如溶液樣品中的細胞和生物分子的系統和方法。發明背景
醫療診斷和生物醫學研究領域的一個重要方面涉及通過檢測生物樣品，如血液、脊髓液、細胞培養物和尿液，檢測、鑒定、定量和表征各種目標細胞和生物分子。醫療服務提供者和生物醫學研究人員常規分析這類生物樣品的細胞和生物分子的微觀存在和濃度。傳統地用于基于細胞試驗的熒光檢測的是熒光顯微鏡、熒光讀板儀和流式細胞儀。這些方法利用載玻片、微滴定板和流動室進行熒光分析。但是，這些熒光檢測方法通常包含昂貴的激發光源(如激光或弧光燈)以進行高強度的激發。通常情況下，用激發光源和帶發射濾光片的檢測探針來檢出特定的熒光信號。在儀器中(如熒光顯微鏡)，例如，需要二向性濾光器將光從頂端直射(normal)(即以直角)反射到樣品室。然后發出的熒光通過二向性濾光器被進入檢測器(如照相機、分光計等等)而被檢出。因為這些熒光檢測方法不是測量特定的流體體積的樣品，所以他們也不能用來直接測量樣品濃度。以往的熒光細胞計數技術的實例是一種在包含光學器件、照相機和樣品架的裝置 中利用濾波器室(filter cube)(如由Omega Optical所提供的)的技術。這些裝置可以為很多應用提供足夠的細胞和其他生物樣品的熒光像，并且它提供了用于生成生物樣品的熒光像的簡單和有效的方法。該技術采用了固定的室容積，其用于直接測量樣品的濃度，同時分析熒光強度。然而，它缺乏用于低熒光信號檢測和成像的靈敏度。這種系統的一個問題，例如，是激發光可能會泄漏到濾波器室的發射濾波器中。另一個問題是濾波器室形式在顏色選擇方面一般是不可變的。僅一個特定的濾波器室和一個LED可用于一種顏色。儀器中沒有更多的空間整合其他顏色，因此使其很難用于多色應用。因此，長期以來需要提供低熒光信號(如各種不同類型細胞上的表面標志物)的檢測和成像能力的細胞計數系統和方法。發明概述本發明部分地基于發現獨特的設計途徑導致檢測和成像(例如，測量、分析、計數或監測)微觀物體的系統的極大改進。該系統包括熒光激發的非常規設計以使得該系統允許兩個或多個斜射激發光束。這種新方法極大地解放了系統的整體設計，并使多個光源能夠以各種不同的入射角放置。為提高低熒光信號檢測的能力，必須降低樣品載片的背景和/或必須加強細胞或生物分子的熒光信號。本文提出的本發明描述了通過利用斜射激發光源和多個LED(發光二極管)照明，將樣品的熒光信號最大化而同時將樣品載片的背景噪音最小化的新方法。該新系統不僅通過放置兩個或更多個激發光源為增強(即更強)的激發開避了道路，而且它也使得能夠靈活使用和選擇激發光束的波長和入射角。通過允許入微激發光束角度的不同組合，可以生成使用現有系統不可能生成或不容易生成的圖像。一個方面，本發明一般地涉及用于微觀物體成像的系統。該系統包括配置為容納樣品中要成像的物體的懸浮液的樣品室，其中樣品室包括允許暴露樣品的光學透明窗；至少一個能夠通過所述窗為樣品提供熒光激發光束的熒光光源；能夠為樣品提供明場光束的明場光源；和至少一個用于檢測來自樣品的光信號的檢測裝置，從而形成至少一個微觀物體的圖像，其中熒光激發光束具有垂直于所述窗的表面平面以外的入射角。
在某些優選的實施方案中，該系統包含至少兩個熒光光源，其能夠為樣品同時提供兩個具有相同(或不同)波長的激發光束。在某些優選的實施方案中，該系統包含多個熒光光源，其能夠為樣品同時提供多個具有相同(或不同)波長的激發光束。在某些實施方案中，突光激發光束相對于樣品室窗的表面平面的入射角為約10°到約80° (例如，約30°到約70°、約35°到約55°或低于約45°、大于約45°和小于約90。、或約 45° )。可成像、監測、分析、測量或計數的微觀物體包括但不僅限于，微珠、細菌、藻類、真菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、蛋白質、DNA分子和表面標志物。在某些實施方案中，優選的微觀物體包括生物分子和細胞。樣品室可以具有固定的深度，范圍是約Ιμπι到約Ι,ΟΟΟμπι。在一些優選的實施方案中，固定的深度的范圍是從約I μπι到約200 ym(例如，從約IOym到約100 μ m)。覆蓋的樣品室可配置為容納約IuL到約1，OOOyL的樣品體積。在某些優選實施方案中，覆蓋的樣品室可配置為容納約I μ L到約500 μ L(例如約I μ L到約100 μ L)的樣品體積。突光光源可以發射波長范圍從約300nm到約10，OOOnm (例如從約300nm到約2，OOOnm或從約300nm到約I，OOOnm)的光束。在另一個方面，本發明一般地涉及計數細胞或生物分子的系統。該系統包括配置為容納樣品中細胞或生物分子的懸浮液的覆蓋的樣品室，其中樣品室包含允許暴露樣品的光學透明窗；兩個或更多個熒光光源，各能夠獨立地通過所述窗為樣品提供熒光激發光束，其中各突光激發光束具有垂直于所述窗的表面平面以外的入射角；能夠為樣品提供明場光束的明場光源；至少一個用于檢測來自樣品的光信號的光檢測裝置；和用于控制明場光束到達樣品的通道的光閘。而在另一個方面，本發明一般地涉及測定生物樣品的特征的方法。該方法包括通過指引明場光束到樣品上來獲得生物樣品的至少一個靜態的明場圖像；通過指引激發光束到樣品上來獲得生物樣品的至少一個靜態的熒光圖像；和比較該至少一個明場圖像和該至少一個熒光圖像來確定生物樣品的特征，其中激發光束與明場光束成斜角。在某些優選的實施方案中，通過指引至少兩個激發光束到樣品上激發獲得熒光圖像。在某些其他的優選實施方案中，通過指引多個(例如3、4個)激發光束到樣品上激發而獲得熒光圖像。而在另一個方面，本發明一般地涉及檢測樣品中的生物分子的方法。該方法包括通過指引明場光束到樣品上來獲得生物樣品的至少一個靜態的明場圖像；通過指引激發光束到樣品上來獲得生物樣品的至少一個靜態的熒光圖像；和比較該至少一個明場圖像和該至少一個熒光圖像來確定生物樣品的特征，其中激發光束與明場光束成斜角。而在另一個方面，本發明一般地涉及確定樣品的細胞群中特定類型細胞的濃度或計數的方法。該方法包括使包含細胞的樣品與特異結合樣品中特定類型細胞的熒光標記試劑接觸；將樣品加載到具有已知高度的覆蓋的樣品室中，其中細胞群懸浮在樣品室中；獲得生物樣品中細胞群的至少一個靜態的明場圖像；獲得生物樣品中細胞群的至少一個靜態的熒光圖像；和比較明場圖像的細胞計數和熒光圖像的細胞計數來確定細胞群中特定類型細胞的濃度或細胞計數，其中激發光束與明場光束成斜角。附圖簡要說明
圖I是現有技術的示例性細胞計數系統。圖2是依據本發明的示例性系統。圖3是本文公開的系統的實施方案的示例性描述。圖4是本文公開的系統的實施方案的示例性描述。圖5是用具有不同波長的多LED以斜入射激發的LinearFlow珠(Invitrogen公司)熒光發射的示例圖像。圖6是斜入射設置的背景強度降低的示例。圖7是用具有相同波長的多LED以斜入射激發的LinearFlow UV熒光珠的示例圖像。圖8是用多LED在相同波長下5X物鏡的激發光增強的示例。圖9是靈敏度增強的示例，其中O. 8%的熒光強度的珠能夠使用斜入射設置成像。
圖10是用多LED在相同波長下IOX物鏡的激發光增強的示例。發明詳述本發明涉及用于檢測和成像微觀顆粒(如細胞和生物分子)的系統和方法。本發明部分地基于使得能夠實現用于檢測和成像(例如，測量、分析、計數或監測)溶液樣品中微觀物體的重大改進系統的獨特設計的發現。該系統包括非常規的熒光激發方式，從而允許可同時操作的兩個或多個斜入射激發光束。該新方式大大改進和解放了成像系統的整體設計并使得多個(相同或不同)光源能夠以對于樣品的不同入射角放置。因此，該新系統通過放置兩個或多個激發光源到適當的位置為增強(即更強)的激發功率開辟了道路。此外它允許靈活使用和選擇激發光束的波長和入射角。通過不同的激發光束入射角和組合，可以檢測和生成使用現有技術的系統不可能生成或不容易生成的圖像。通過組織樣品或體液的微觀檢查已闡明很多疾病的生物學機制。組織病理學檢查也允許開發多種疾病的有效醫學治療。在標準解剖病理學中，在細胞形態學和染色特征的基礎上進行診斷。通過標準方法(如蘇木精和伊紅)染色的組織樣品的鏡檢和分類已顯著改善了癌癥治療。例如，可以檢驗腫瘤樣品以鑒定腫瘤類型，并表明病人是否響應于特定形式的化療。分子醫學的最新進展提供了甚至更大的機會來了解疾病的細胞學機制，并選擇成功可能性最大的適當的治療。例如，某些激素依賴性乳腺腫瘤細胞的雌激素受體的表達的增加，表明腫瘤所取自的患者很可能會對特定的抗雌激素藥物治療作出響應。其他的診斷和預后性的細胞學變化包括腫瘤特異性細胞表面抗原的存在(如黑色素瘤中)、胚性蛋白質的產生(如消化道腫瘤所產生的癌胚性糖蛋白抗原)和基因異常(如腫瘤中激活的致癌基因)。多種技術已經發展來檢測這些細胞學異常情況的存在，包括利用單克隆抗體的免疫表型分型、利用核酸探針的原位雜交和利用聚合酶鏈式反應(PCR)的DNA擴增。由于使目前的自動分析系統不能夠以經濟的、時間敏感的和可重復的方式利用和確認變化的生物標志物，在有效地利用這些生物標志物幫助診斷和確定治療方案方面還存在阻礙。以往的技術和系統往往被證明不足以有效地分析需要進行多種獨立的顯微特征、組織學特征和/或分子特征的平行快速分析的組織樣品。此外，人工的方法可能是極度費時的并經常需要高度的專業培訓和質量控制水平以確認和/或定量細胞。這種情況不但對于腫瘤細胞的識別和檢測是如此，而且對于包括嗜中性白細胞堿性磷酸酶分析、網狀細胞計數和成熟評估等等的其他應用也是如此。相關的人工勞動在可能由于長期的、艱苦的人工檢查可能產生潛在的錯誤之外還導致了這些過
程的高成本。一種熒光細胞計數技術利用了光學器件、照相機和樣品架組件中的濾波器室。在某些應用中，它能夠提供足夠的細胞和其他生物樣品的熒光圖像。雖然該技術提供了簡單和有效的方法來產生生物樣品的熒光圖像，但它缺少低熒光信號檢測和成像所需的靈敏度。激發光泄漏和系統的設計和顏色選擇缺乏靈活性(由于濾波器室形式)是其中的主要缺點。僅一個特定的濾波器室和一個LED可用于一種顏色。沒有更多的額外的空間可用于整合其他顏色。(示例性的計數系統和相關方法可發現于PCT/US09/39863及美國專利申請公開 No. 2004/0145805 中。)圖I中描述了現有技術的細胞計數系統的實例。該系統包括計數室、熒光光源(連接于熒光光束收縮裝置)和明場光源(連接于明場光束收縮裝置)。圖I中的細胞計數系統還包括檢測裝置(照相機)和熒光濾波器組件，其使來自熒光光源的激發光照射樣品室中的樣品。在圖I中，熒光激發光以直角(直射)照射在計數室的樣品上。本發明至少在兩個主要方面大大提高了上述系統的靈敏度和檢測限。第一，斜入射激發光源用來使由濾波器室方法共有的從激發濾波器到發射濾波器的光泄漏造成的背景信號減少到最低。第二，通過應用斜激發概念，多個LED可以很容易地整合到一個儀器中來照射樣品，從而增加來自樣品的熒光信號并減少在濾波器室系統中獲得圖像所需的曝光時間(從而使新系統與激光或弧光燈激發相當)。參照圖2，其是依照本發明的細胞計數系統的示例性實施方案的示意圖。該細胞計數系統200包括連接到熒光光束收縮裝置215的熒光光源210、連接到明場光束收縮裝置225的明場光源220。該細胞計數系統還包括計數室230和檢測裝置240 (照相機)。在該系統中，熒光激發光以斜角照射在計數室230中的樣品250上。該細胞計數系統200還包括顯微物鏡206和可移動的光閘228。用于獲取圖像的檢測裝置可以是照相機，如CCD(電荷耦合器件)照相機。照相機可配備冷卻功能。在某些實施方案中，顯微物鏡是在可操作地連接到系統200上的電腦260的控制下移動的。計數室230有可以預先選定、調節或固定的已知高度。計數室230可以覆蓋或以其它方式封關以使得其中的樣品懸浮液的體積不會由于蒸發而損失。通過移液將樣品移入到樣品室230的進樣孔而將樣品加載到樣品室230中。隨著樣品加載到樣品室中，通過樣品室230中的放氣孔使空氣逸出樣品室230。雖然實際樣品大小可能根據不同的應用和儀器設置而變化，但示例性的樣品大小為20 μ I。一旦樣品被加載到樣品室230中，通過系統外殼中的插槽將樣品室230裝入計數系統200中。熒光光源和明場光源可以是發光二極管。熒光光束收縮裝置和明場光束收縮裝置可以是準直儀。一旦獲取圖像，可以由計數室的高度和成像的樣品的面積獲得所探測的樣品體積。可以得到各探測樣品的體積，并對于獲取的圖像是已知的。應該注意的是，樣品室的高度可以根據應用而變化，只要探測樣品的體積可以獲得或已知。系統200配置用于樣品室230中樣品的明場成像和熒光成像。細胞計數系統200的組件封裝在外殼中。明場光源220定位在外殼的基部，并配置為發射光到同線地(in-line)定位在明場光源220上方的樣品室230中的樣品上。在樣品室230和明場光源220之間是明場光束收縮裝置225。光束收縮裝置使明場光源220發射的光聚焦，并指引光到樣品室230中的樣品上。定位在樣品室230和明場光源220之間的還有可移動的光閘228。可移動的光閘228位于明場光束收縮裝置225上方和樣品室230下方。光閘228被連接到用于移動光閘的機構上，如電機或螺線管。光閘228被機械地與明場光源220同線地移動，以允許來自明場光源220的光在明場成像過程中與樣品室230中的樣品相互作用。 光閘228被機械地與明場光源220同線地移動，以阻斷來自明場光源220的光在熒光成像過程中與樣品室230中的樣品相互作用。當來自明場光源220的光束通過樣品室230中的樣品后，光線隨后通過顯微物鏡206。顯微物鏡206負責初始圖像形成并參與決定由系統200能夠生成的圖像質量。顯微物鏡206還參與決定特定樣品的放大倍數和決定系統200中可以觀察的微小樣品細節的分辨率。顯微物鏡可從奧林巴斯美國公司(Center Valley, PA)買到。當來自明場光源220的光經過顯微物鏡206后，來自樣品的發射的光經過發射濾波器265，并且由檢測裝置240獲得來自樣品室230中的樣品230的發射的光。發射濾波器265與明場光源220、明場光束收縮裝置225、樣品室230、顯微物鏡206和檢測裝置240同線。示例性檢測裝置是可從奧林巴斯美國公司(Center Valley, PA)買到的CXD相機。來自檢測裝置240的圖像傳送給具有分析軟件211的計算機260。如圖2中所示，該系統包括至少一個用于樣品室230中樣品的熒光成像的熒光光源210。熒光光源210通過熒光束收縮裝置215發射激發光。在熒光檢測過程中，光閘228與明場光源220同線地機械移動以阻止來自明場光源220的白光在熒光成像過程中與樣品室230中的樣品相互作用。圖2顯示了一套熒光光源和熒光光束收縮裝置。兩套或多套熒光光源和熒光束收縮裝置可用于熒光激發和發射檢測。圖3顯示具有兩套熒光激發光源的這種系統。利用在相同樣品上可得的兩套或多套(例如3或4套)熒光激發和發射，可以獲得可變的和/或更強的激發，以及超過一種熒光標記可用于高水平的分析。圖4A和4B是顯示了示例性細胞計數系統的不同視圖的照片。因此，本發明的細胞計數系統包括熒光激發的非傳統設計以便該系統能允許兩個或多個斜入射激發光束。這種新方式極大地解放了系統的整體設計，并使多個光源能夠以各種不同的入射角放置。本文所述的細胞計數系統捕獲樣品室中細胞或生物分子明場和熒光圖像，分析細胞或生物分子的數目、各細胞的大小和熒光強度，然后將這些數據轉換成濃度、大小和熒光直方圖散點圖。本發明的細胞計數系統可用于各種生物分析和其他應用。
一個方面，本發明一般地涉及用于微觀物體成像的系統。該系統包括配置為容納樣品中要成像的懸浮液的樣品室，其中樣品室包含允許暴露樣品的光學透明窗；至少一個能夠通過所述窗為樣品提供熒光激發光束的熒光光源；能夠為樣品提供明場光束的明場光源；和至少一個用于檢測來自樣品的光信號的光檢測裝置，從而形成微觀物體的至少一個圖像，其中熒光激發光束具有與所述窗的表面平面垂直以外的入射角。在某些優選的實施方案中，該系統包括至少兩個熒光光源，其能夠為樣品同時提供兩個具有相同(或不同)波長的激發光束。在某些優選的實施方案中，該系統包括多個熒光光源，其能夠為樣品同時提供多個具有相同(或不同)波長的激發光束。在某些實施方案中，突光激發光束相對于樣品室窗的表面平面的入射角為約10°到約80° (例如，約30°到約70°、約35°到約55°、或低于約45°、大于約45°和小于約90°、或約45° )。在某些實施方案中，兩個或多個熒光激發光束相對于所述窗的表面平面具有相同的入射角。在某些實施方案中，兩個或多個熒光激發光束相對于所述窗的表面平面具有不 同入射角的組合。在某些實施方案中，兩個或多個熒光激發光束具有不同的波長。在某些實施方案中，兩個或多個熒光激發光束具有相同的波長。激發光源可以具有可選擇的激發波長。可成像、監測、分析、測量或計數的微觀物體包括但不僅限于，微珠、細菌、藻類、真菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、蛋白質、DNA分子和表面標志物。在某些實施方案中，優選的微觀物體包括生物分子和細胞。在一些優選的實施方案中，樣品室被覆蓋(或封閉)。樣品室可以具有固定的深度，其范圍是約I μ m到約Ι,ΟΟΟμπι。在一些優選的實施方案中，固定深度的范圍是從約Iym到約200μπι(例如，從約IOym到約100 μ m)。覆蓋的樣品室可配置為容納約I μ L到約1，000 μ L的樣品體積。在某些優選實施方案中，覆蓋的樣品室可配置為容納為約I μ L到約500 μ L(例如約I μ L到約100 μ L)的樣品體積。熒光光源可以發射范圍從約300nm到約10，OOOnm(例如從約300nm到約2，OOOnm或從約300nm到約1，OOOnm)的光束。在另一個方面，本發明一般地涉及用于計數細胞或生物分子的系統。該系統包括配置為容納樣品中的細胞或生物分子的懸浮液的覆蓋的樣品室，其中樣品室包含允許暴露樣品的光學透明窗；兩個或更多個熒光光源，其各能夠通過所述窗為樣品獨立提供熒光激發光束，其中各個突光激發光束具有與所述窗的表面平面垂直以外的入射角；能夠為樣品提供明場光束的明場光源；至少一個用于檢測來自樣品的光信號的光檢測裝置；和用于控制到達樣品的明場光束通道的光閘。而在另一個方面，本發明一般地涉及用于測定生物樣品的特征的方法。該方法包括通過指引明場光束射到樣品上來獲得生物樣品的至少一個靜態的明場圖像；通過指引激發光束到樣品上來獲得生物樣品的至少一個靜態的熒光圖像；和比較該至少一個明場圖像和該至少一個熒光圖像來確定生物樣品的特征，其中激發光束與明場光束成斜角。在某些優選的實施方案中，通過指引至少兩個激發光束到樣品上激發來獲得熒光圖像。
在某些其他的優選實施方案中，通過指引多個(例如3、4個)激發光束到樣品上激發來獲得熒光圖像。各個激發光束可以具有與明場光束相同(或不同)的斜角。激發光源可以發射范圍從約300nm到約10，OOOnm(例如從約300nm到約2，OOOnm或從約300nm到約1，OOOnm)的光束。而在另ー個方面，本發明一般地涉及用于檢測樣品中生物分子的方法。該方法包括通過指引明場光束射到樣品上來獲得生物樣品的至少ー個靜態的明場圖像；通過指引激發光束到樣品上來獲得生物樣品的至少ー個靜 態的熒光圖像；和比較該至少ー個明場圖像和該至少ー個熒光圖像來確定生物樣品的特征，其中激發光束與明場光束成斜角。在某些實施方案中，激發光束與明場光束成約45°角。在某些實施方案中，激發光束與明場光束成小于約45°的角。在某些實施方案中,激發光束與明場光束成大于約45°的角。而在另ー個方面，本發明一般涉及用于確定樣品的細胞群中特定類型細胞的濃度或計數的方法。該方法包括使包含細胞的樣品與特異性結合樣品中特定類型細胞的熒光標記試劑接觸；將樣品上樣到具有已知高度的覆蓋的樣品室中，其中細胞群懸浮在樣品室中；獲得樣品中細胞群的至少ー個靜態的明場圖像；獲得樣品中細胞群的至少ー個靜態的熒光圖像；和比較明場圖像的細胞計數的熒光圖像的細胞計數來確定細胞群中特定類型細胞的濃度或細胞計數，其中激發光束與明場光束成斜角。本發明具有至少兩個優于以往設計的獨特優勢。第一個優勢是多發射光整合的靈活性，它采用多個LED和多個濾波器以進行多色熒光檢測。第二個獨特優勢是降低了由從激發泄漏到發射濾光器的光所引起的背景。此外，由于激發光是斜入射的，通過物鏡反射回來的散射光較少，從而進一歩降低了背景。可使用本發明的方法分析的樣品包括得自或源自活生物體的生物物質。通常樣品包括細胞、組織或生物分子，如蛋白質、多核苷酸(如DNA或RNA)、有機物質以及任何上述物質的組合。這些樣品包括，但不僅限于，頭發、皮膚、組織、培養的細胞、培養的細胞介質和體液。組織是連接的細胞和/或細胞外基質物質的團，例如，中樞神經系統組織、神經組織、眼組織、肝組織、胎盤組織、乳腺組織、胃腸道組織、肌肉骨骼組織、泌尿生殖系統組織等等，例如來自人類或其他哺乳動物的，并包括與細胞和/或組織相關的連接物質和液體物質。體液是源自于例如人類或其它哺乳動物的液體物質。這種體液包括，但不僅限于，血液、血衆、血清、血清衍生物、膽汁、痰、唾液、汗液、羊水、乳腺液(mammary fluid)和腦脊液(CSF)，如腰椎或腦室CSF。樣品也可以是包含細胞或生物物質的介質。本發明的系統也可以用于探測(interrogate)細胞系。細胞系是指可以在給定的合適的培養基和條件下可以無限生長的特定細胞。本發明的系統可用于探測任何類型的細胞系。細胞系可以是哺乳動物細胞系、昆蟲細胞系或植物細胞系。示例性的細胞系可包括腫瘤細胞系或干細胞系。
實施例使用Lumenera Vision照相機和標準的Thor實驗室部件構成儀器(圖2)。帶有160mm鏡頭筒的相機安置于頂部并且帶有發射濾波器的標準DIN物鏡直接位于物鏡上方。熒光激發光源以約42°安置于樣品臺上方，使光束中心照射樣品區域。樣品臺周圍同時設置多個LED。樣品制備100和O. 8%的UV突光珠(LinearFlow, Invitrogen)用于測試儀器設置的可行性。此外，也對非熒光珠的非特異性信號進行了測試。將100%的UV、藍色、緑色和紅色熒光珠(LinearFlow, Invitrogen)混合,并用來測試多發射的儀器設置的可行性。使用AdobePhotoshop疊加獲得的圖像(圖5)。降低背景信號僅利用Nexcelom計數載片而無樣品以斜入射使用藍色、綠色和UV LED獲取圖像來測定該方法的背景效應。采用各種不同的曝光時間和用不同的LED獲取圖像來與濾波器室方法進行比較(圖6)。 多個LED信號增強通過利用I至4個LED和測量珠信號來比較信號增強(圖7、8、10)。這些均采用高強度珠和低強度珠進行，其中O. 8%的最低百分比熒光珠能夠成像(圖9)。多發射設置通過利用斜入射照明方法，多熒光發射成為可能。在圖5中，使用各種顏色獲取四個圖像并使用Adobe Photoshop進行合并。在明場圖像和突光圖像之間觀察到清晰的匹配四種不同類型的珠，這確認了多重熒光檢測設置的使用。背景信號降低通過使用斜入射方法，藍、綠和UV LED的背景顯著降低。在圖6中，藍、綠和UV LED的背景降低分別為約2、8和3倍。因此，檢測限顯著提高(從而允許各種不同激發光源或熒光團的較低的熒光)。藍、綠和UV LED的背景降低分別為2、8和3倍。此外，信號的增強與LED的數目線性相關；因此，在使用4個LED的情況下，存在四倍的增強。對于4個LED，信噪比(S/N)，Ni = N/2、8或3和V =4得到藍色、綠色和UV LED的最終S/N增強為8、32和12倍。通過引用引入本文中對其他資料，如專利、專利申請、專利公開、期刊、圖書、報紙、網站內容進行了參考和引用。此處通過引用引入為所有目的整體引入所有這些文獻。等同代表性的實例意圖是為了幫助說明本發明，它們沒打算，也不應被解釋為限制本發明的范圍。事實上，本發明的各種修改和許多進一步的實施方案，除本文所顯示的和描述的那些，對于本領域的技術人員來說從本文全部內容(包括實施例和本文包括的科學和專利參考文獻的引用)而成為顯而易見的。實施例包含了重要的附加信息、例證和指導，其可在不同的實施方案中及其等同方案中用于本發明的實施。
權利要求
1.一種用于微觀物體的成像系統，包括 配置為容納樣品中待成像物體的懸浮液的樣品室，其中所述樣品室包含允許暴露樣品的光學透明窗； 至少一個能夠通過所述窗為樣品提供突光激發光束的突光光源； 能夠為樣品提供明場光束的明場光源；和 至少一個用于檢測樣品的光信號的光檢測裝置，從而形成所述微觀物體的至少一個圖像， 其中所述熒光激發光束具有與所述窗的表面平面垂直以外的入射角。
2.權利要求I的系統，其中所述系統包括能夠為樣品同時提供具有相同或不同波長的兩個激發光束的至少兩個熒光光源。
3.權利要求2的系統，其中所述系統包括能夠為樣品同時提供具有相同或不同波長的四個激發光束的至少四個熒光光源。
4.權利要求I的系統，其中所述熒光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角為約10。到約 80°。
5.權利要求I的系統，其中所述熒光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角為約30。到約 70。。
6.權利要求I的系統，其中所述熒光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角為約35。到約 55°。
7.權利要求I的系統，其中所述熒光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角為約45。。
8.權利要求I的系統，其中所述熒光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角為小于約45°。
9.權利要求I的系統，其中所述突光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角大于45。并小于90°。
10.權利要求2的系統，其中所述至少兩個熒光激發光束各具有相同的相對于所述窗的表面平面的入射角。
11.權利要求2的系統，其中所述至少兩個熒光激發光束相對于所述窗的表面平面的入射角不同。
12.權利要求10的系統，包含具有相對于所述窗的表面平面的相同入射角的多個熒光激發光束。
13.權利要求10的系統，包含具有相對于所述視窗的表面平面的不同入射角的多個熒光激發光束。
14.權利要求10或11的系統，其中所述激發光束具有不同的波長。
15.權利要求10或11的系統，其中所述激發光束具有相同的波長。
16.權利要求10或11的系統，其中所述激發光束包含可選擇的波長。
17.權利要求I的系統，其中所述微觀物體選自于微珠、細菌、藻類、真菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、蛋白質、DNA分子和表面標志物。
18.權利要求17的系統,其中所述微觀物體選自于蛋白表面標志物、弱突光標記和DNA分子。
19.權利要求I的系統，其中所述微觀物體包含生物分子。
20.權利要求I的系統，其中所述樣品室被覆蓋。
21.權利要求20的系統，其中所述樣品室具有固定的深度。
22.權利要求21的系統，其中所述固定的深度的范圍為約Ιμπι到約Ι,ΟΟΟμπι。
23.權利要求22的系統，其中所述固定的深度的范圍為約Ιμπι到約200μ m。
24.權利要求23的系統，其中所述固定的深度的范圍為約10μ m到約100 μ m。
25.權利要求20的系統，其中所述覆蓋的樣品室配置為容納約Iμ L到約1，000 μ L的樣品體積。
26.權利要求25的系統，其中所述覆蓋的樣品室配置為容納約Iμ L到約500 μ L的樣品體積。
27.權利要求26的系統，其中所述覆蓋的樣品室配置為容納約Iμ L到約100 μ L的樣品體積。
28.權利要求I的系統，其中所述至少一個熒光光源包含范圍為約300nm到約10,OOOnm的波長。
29.權利要求28的系統，其中所述至少一個熒光光源包含范圍為約300nm到約2，OOOnm的波長。
30.一種用于計數細胞或生物分子的系統，包括 配置為容納樣品中細胞或生物分子的懸浮液的覆蓋的樣品室，其中樣品室包含允許暴露所述樣品的光學透明窗； 兩個或更多個熒光光源，各自能夠通過所述窗為樣品獨立地提供熒光激發光束，其中各熒光激發光束具有與所述窗的表面平面垂直以外的入射角； 能夠為樣品提供明場光束的明場光源； 至少一個用于檢測樣品的光信號的光檢測裝置；和 用于控制明場光束到達樣品的通道的光閘。
31.權利要求30的系統，其中所述系統包括能夠為樣品同時提供具有相同或不同波長的兩個激發光束的四個熒光光源。
32.權利要求31的系統，其中所述四個熒光激發光束各具有相對于所述窗的表面平面約10°到約80°的不同的入射角。
33.權利要求31的系統，其中所述四個熒光激發光束各具有相對于所述窗的表面平面約10°到約80°相同的入射角。
34.權利要求33的系統，其中所述四個熒光激發光束各具有相對于所述窗表的面平面約45°的入射角。
35.權利要求30的系統，其中所述細胞選自于由選自細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞的物體組成的組。
36.權利要求35的系統，其中所述細胞或生物分子選自于細菌、藻類、真菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、蛋白質、DNA分子和表面標志物。
37.權利要求30的系統，其中所述樣品室具有固定的深度。
38.權利要求39的系統，其中所述固定深度的范圍為約Iym到約Ι,ΟΟΟμπι。
39.權利要求40的系統，其中所述固定深度的范圍為約Ιμπι到約200μπι。
40
41
42.權利要求41的系統，其中所述固定的深度的范圍為約10μ m到約100 μ m。
43.權利要求30的系統，其中所述至少一個熒光光源包含范圍為約300nm到約10，OOOnm的波長。
44.權利要求43的系統，其中所述至少一個熒光光源包含范圍為約300nm到約2，OOOnm的波長。
45.一種用于測定生物樣品特征的方法，包括 通過指引明場光束到樣品上來獲得所述生物樣品的至少一個靜態明場圖像； 通過指引激發光束到樣品上來獲得所述生物樣品的至少一個靜態熒光圖像；和 比較該至少一個明場圖像和該至少一個熒光圖像來確定所述生物樣品的特征， 其中所述激發光束與所述明場光束成斜角。
46.權利要求45的方法，其中所述熒光像是通過指引至少兩個激發光束到樣品上激發而獲得的。
47.權利要求46的方法，其中所述熒光像是通過指引四個激發光束到樣品上激發而獲得的。
48.權利要求46的方法，其中所述激發光束各與所述明場光束成相同的斜角。
49.權利要求48的方法,其中所述激發光束各與所述明場光束成45°角。
50.權利要求45的系統，其中所述至少一個激發光束包含范圍為約300nm到約10，OOOnm的波長。
51.權利要求50的系統，其中所述至少一個激發光束包含范圍為約300nm到約2000nm的波長。
52.一種用于檢測樣品中的生物分子的方法，包括 通過指引明場光束到樣品上來獲得所述生物樣品的至少一個靜態明場圖像； 通過指引激發光束到樣品上來獲得所述生物樣品的至少一個靜態的熒光圖像；和 比較該至少一個明場圖像和該至少一個熒光圖像來確定生物樣品的特征， 其中所述激發光束與所述明場光束成斜角。
53.權利要求52的方法，其中所述熒光像是通過指引至少兩個激發光束到樣品上激發而獲得的。
54.權利要求53的方法，其中所述熒光像是通過指引四個激發光束到樣品上激發而獲得的。
55.權利要求54的方法,其中所述激發光束各與所述明場光束成相同的斜角。
56.權利要求55的方法,其中所述激發光束各與所述明場光束成45°角。
57.一種用于確定樣品中的細胞群中細胞類型的濃度或計數的方法，包括 使包含細胞的樣品與特異性地結合樣品中特定類型的細胞的熒光標記試劑接觸； 將樣品加載到具有已知高度的覆蓋的樣品室中，其中所述細胞群懸浮在所述樣品室中； 獲得所述樣品中細胞群的至少一個靜態的明場圖像； 獲得所述樣品中細胞群的至少一個靜態的熒光圖像；和 比較所述明場圖像的細胞計數和所述熒光圖像的細胞計數來確定細胞群中特定類型細胞的濃度或計數，其中所述激發光束與所述明場光束成 斜角。
全文摘要
本發明一般地涉及用于分析和測量細胞和生物樣品的分析和監測系統。更特別地，本發明涉及用于成像、測量、計數、分析和監測微觀顆粒，如溶液樣品中的細胞和生物分子的系統和方法。
文檔編號G01N33/483GK102834718SQ201180008975
公開日2012年12月19日 申請日期2011年1月11日 優先權日2010年1月12日
發明者L·L·陳, P·李 申請人:耐克思樂生物科學有限責任公司