穩定溶液的制作方法

專利名稱：穩定溶液的制作方法
技術領域：
本發明涉及血液凝固的領域。更確切地，本發明涉及穩定溶液及其作為凝血分析的對照材料的用途，以及有關凝血分析的方法。
背景技術：
凝血是ー個復雜的過程，通過該過程血液形成凝塊。凝血是止血(中止從受損的血管失血)的重要部分，其中受損的血管壁被血小板和包含纖維蛋白的凝塊覆蓋，以停止流血并且開始受損的血管的修復。凝血的紊亂能夠導致流血(出血)或者血液凝結(clotting)(血栓形成)的增加的危險。凝血是遍及生物界高度保守的；在所有哺乳動物中，凝血涉及細胞(血小板)組分和蛋白(凝血因子)組分二者。人類中的所述系統已經被最深入地研究，并且因此是最被 了解的。凝血在血管的損傷已經損壞內皮(血管的內層)之后幾乎立即發生，這暴露或釋放起始連鎖反應(chain reaction)的膜蛋白組織因子。血小板粘附至內皮下的物質例如膠原蛋白和血管性血友病因子，被活化并且隨后在損傷的位置形成栓塞(Plug);這被稱為初級止血。次級止血同時發生被稱為凝血因子或凝結因子(clotting factors/)的血衆中的蛋白質以復雜的級聯反應響應，以形成纖維蛋白股(fibrin strands),所述纖維蛋白股強化所述血小板栓塞。圖I示出人類中的凝血系統的概況，該圖采納自Rams_m，S的研究論文，2001，LinkopingUniversity Medical Dissertation 776 號(ISBN91-7373-535-3)。次級止血的凝血級聯反應具有兩個導致纖維蛋白形成的途徑，接觸活化途徑(之前被稱作內源性途徑)，和組織因子途徑(之前被稱作外源性途徑)。血液凝固的起始的主要途徑是組織因子途徑。組織因子途徑和接觸活化途徑二者都激活因子X、凝血酶和纖維蛋白的最終關同途徑(參見圖I)。測試凝血系統大量的試驗被用于評價凝血系統的功能，舉例來說，aPTT(活化部分凝血活酶時丨、日」，activated partial thromboplastin timeノ、PT(凝血_原時間，prothrombin time,也用于確定INR)、纖維蛋白原測試(可以通過克勞斯法(Clauss method)來進行)、血小板計數、血小板功能測試(通常通過PFA-100)、TCT、流血時間、混合試驗(mixing test,如果將患者的血漿與正常的血漿混合，患者的異常是否被修正)、凝血因子分析、抗磷脂抗體、D- ニ聚體、遺傳試驗(舉例來說，因子V Leiden突變，凝血酶原突變G2021 0A)、稀釋印度蜂蛇毒時間(dilute Russell' s viper nenom time, dRVVT)、各種血小板功能試驗、凝血弾性掃描法(TEG或者Sonoclot)、優球蛋白溶解時間(euglobulin lysis time, ELT)。接觸活化途徑是通過血漿的接觸因子的活化來被起始，并且可以由aPTT試驗來測量。組織因子途徑是通過暴露于血液或者組織因子或者組織因子(特定的細胞膜蛋白)的釋放而被起始，并且可以由PT試驗來測量。PT的結果通常被記錄為標準化比值，SP國際標準化比值(International Normalised Ratio, INR)的值。疾病和測試取決于病理學的本質，凝血系統中的紊亂可以傾向于出血、血栓形成以及偶爾地為出血和血栓形成二者。因此，對精確的測試和測量的需要是被充分理解的，并且對凝血系統的評價中適當的對照材料的需要是顯然的。同樣，監護人員(care taking staff)對對照材料的適當的操作是重要的。在大多數情況下，就地(point of care)的凝血試驗要么由患者自己進行，要么由醫院的員エ進行，其中兩組人員都沒有在實驗室技能方面被適當地訓練。當前的對照材料主要是基于包括作為緩沖和作為螯合劑的檸檬酸鹽緩沖液的冷凍干燥的血漿。所述冷凍干燥的血漿需要在臨使用之前被稀釋，并且需要加入鈣以恢復所述冷凍干燥的血漿的凝血能力。因此，重構的溶液是短壽命的，并且應該被在4小時內使用，以保持高質量。進ー步地，由使用者(員エ或者患者)通過不慎延長使用之前的時間或者通過不正確的稀釋對對照樣品的不適當的操作是已意識到的問題，該問題將會影響分析的結果和隨后基于所述結果的藥物治療。 因此，存在為凝血分析提供更穩定并且更可靠的對照的迫切需要，特別是在被分析的材料是新鮮的、天然的人類血液(即在分析之前不進行添加)的情況下的試驗，以除去歸因于可能的稀釋錯誤或者過期的對照樣品，在評價患者中的凝血系統的狀態時的潛在的變化和不可靠的結果。因此，本發明滿足了該需要和利益。

發明內容
本發明的ー個方面提供包括分離的血漿的穩定溶液，并且其中所述分離的血漿是被耗竭凝血因子XII的。進ー步的實施方案是其中凝血因子XII的耗竭是95% -100%。進ー步的實施方案是其中凝血因子XII的耗竭是100%或者接近100%。進ー步的實施方案是其中所述穩定溶液的條件是所述溶液不包括任何鈣螯合剤。進ー步的實施方案是其中所述溶液包括生理量或者生理量以上的I丐。進ー步的實施方案是其中所述血漿是被耗竭血小板的。進ー步的實施方案是其中所述溶液在2-8°C或者在室溫(RT)穩定> 4小吋。進ー步的實施方案是其中所述穩定溶液在2_8°C或者在室溫穩定至少I周，例如I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或者甚至更長時間。本發明的進ー步的方面是根據本發明的穩定溶液作為凝血分析的對照材料的用途。本發明更進ー步的方面是產生穩定溶液的方法，所述方法包括以下步驟a)分離血漿；b)耗竭所述血漿的因子XII ；c)任選地，凍干分離的并且耗竭因子XII的所述溶液。本發明更進ー步的方面是可通過本文公開的方法獲得的根據本發明的穩定溶液。本發明更進ー步的方面是評價受治療者中的凝血系統狀態的方法，所述方法包括以下步驟
a)提供根據本發明的穩定溶液，b)提供來自受治療者的血液樣品，c)測量所述受治療者的凝血系統的狀態，d)分析所述患者的凝血系統的狀態，e)將所述受治療者的凝血狀態與陽性和/或陰性標準比較，從而評價所述患者中的凝血系統狀態。陽性和/或陰性標準形成參照點，并且，如果合適，可以標繪為標準曲線。標準曲線和每個分別的參照點可以通過測量單獨的參照點來制成，該單獨的參照點由無因子XII (即經耗竭的血漿或者來自因子XII缺陷的受治療者的血漿)、但具有所有其他補體因子存在的血漿，和匯合的包含因子XII的正常血漿的混合物構成。缺陷血漿和正常血漿以 不同比例混合，以形成不同的參照點。當被測量時，該參照點可以被以圖表描繪以形成標準曲線。進ー步的實施方案是其中所述受治療者是人類受治療者。更進ー步的實施方案是其中所述方法還包括其中來自受治療者的血液樣品在測量和分析凝血系統的狀態之前與根據本發明的穩定溶液混合。本發明更進ー步的方面涵蓋包括根據本發明的穩定溶液的試劑盒。附圖
簡述
圖I示出人類中的凝血系統的概況(采納自Ramstrdm，s的研究論文，2001，Linkopillp. University Medical Dissertation 776 號(ISBN91-7373-535-3))。次級止血的凝血級聯反應具有兩個導致纖維蛋白形成的途徑，接觸活化途徑(之前被稱作內源性途徑)，和組織因子途徑(之前被稱作外源性途徑)。血液凝固的起始的主要途徑是組織因子途徑。組織因子途徑和接觸活化途徑二者都活化因子X、凝血酶和纖維蛋白的最終關同途徑。圖2示出在高嶺土處理的(條紋的)和ニ氧化鈦(純黑)處理的血漿中，因子XII在第0天、第I天、第2天和第4天的活性。結果以底物裂解率計算。圖3示出0、1、2和4天之后的凝血酶生成，其被計算為以平均值+SD呈現的內源性凝血酶潛能(ETP)。數據代表分別與ニ氧化鈦一起孵育5分鐘(條紋的)和60分鐘(純黑)，以及與高嶺土一起孵育5分鐘(白色具黒點)和60分鐘(黒色具白點)。圖4示出使用來自4個不同供體的血漿在材料表面的凝血時間。數據以凝血時間的平均值+SD呈現，所述凝血時間是在Fe、Al、Ti和玻璃的表面測量。所述材料或者被直接測量(純黑)或者在添加檸檬酸鹽的(citrated)血漿中孵育60分鐘隨后被以HEPES沖洗之后測量(條紋的)。詳述定義如本文所使用的，涉及溶液或組合物的“穩定的”意指所述溶液或組合物不易分解或者從ー種物質狀態改變為另ー種物質狀態，并且不經歷自發的改變。如本文所使用的，“凍干(Iyophilization) ”、“冷凍干燥(freeze-drying) ”或者“冷凍忙存(cryopreservation) ”意指典型地用于保存易腐爛材料或者使所述材料運輸更方便的脫水過程。凍干通過冷凍所述材料并且然后降低周圍的壓カ以及添加足夠的熱量以允許材料中的結冰水直接從固相升華為氣體來起作用。如本文所使用的，“受治療者”意為包括人類的患有或者被懷疑患有疾病的任何哺乳動物。如本文所使用的“受治療者”表示哺乳動物，例如嚙齒動物、貓科動物、犬科動物和靈長類動物。優選地，根據本發明的受治療者是人類。如本文所使用的，“至少ー種”意為ー種或更多種，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。如本文所使用的，“檢測(detection)”、“檢測(detect) ”、“檢測(detecting) ”包括參照或不參照対照的定性的和/或定量的檢測(測量水平)，并且還指給定的血液凝結過程的存在、不存在或者量的鑒定。如本文所使用的，単數形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括復數指代對象，除非上下文明確指示為相反的。因此，舉例來說，提及“抗體(an antibody)”則包括復 數個這樣的抗體。如本文所使用的，“耗竭(cbpletion) ”意指部分地或者完全地除去所述組分或因子，或者以任何其他方式使所述組分或因子部分地或者完全地失去活性，舉例來說，通過添加所述因子的抑制劑，這直接地或者間接地使所述因子或組分失去活性。類似地，“經耗竭的溶液”完全地或者部分地不存在某種因子或組分。如本文所使用的，“經耗竭的溶液”也包括因子或組分的部分的或者完全的功能性耗竭或失活。該功能性耗竭或失活可以直接地或者間接地通過例如抑制劑的添加。如本文所使用的，“靈敏性”在其應用于血液凝結的方法或分析的上下文中使用，指正確地鑒定為其本身的情況的全部受治療者的比例。如本文所使用的，“治療”被定義為通過內科的或外科的手段對患者的處置。所述治療改善或減輕醫學狀況或疾病的至少ー個癥狀，并且被要求提供治愈。如本文所使用的，術語“治療結果”或“治療的結果”是所述治療對患者身體上的影響。如本文所使用的，術語“算法”指提供兩個或更多個數量之間的關系的數學公式。這樣的公式可以是線性的或者非線性的，并且可以以各種數值的權重因子的形式存在于計算機內存中。如本文所使用的，“單克隆抗體”或者“ mAb ”指具有單ー氨基酸組成的抗體，所述抗體是針對特定抗原的，并且是由B細胞或雜交瘤的單克隆產生的。如本文所使用的，“多克隆抗體”指來源于不同的B細胞系的針對特定抗原的抗體。如本文所使用的，“ Fab”指在通過用ー種蛋白酶即木瓜蛋白酶處理IgG獲得的片段之中，具有約50，OOODa的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其中，約一半的H鏈N端側和完整的L鏈是通過ニ硫鍵結合在一起的。如本文所使用的，“F(ab’)2”指在通過用ー種蛋白酶即胃蛋白酶處理IgG獲得的片段之中，具有約100，OOODa的分子量和抗原結合活性的抗體片段，所述抗體片段通過鉸鏈區的ニ硫鍵結合，稍大于Fab。如本文所使用的，“Fab””指具有約50，OOODa的分子量和抗原結合活性的抗體片段，所述抗體片段通過切割F(ab’ )2的鉸鏈區的ニ硫鍵獲得。如本文所使用的,單鏈Fv( “scFv”)多肽是共價連接的VH: :VL異ニ聚體,所述異ニ聚體通常表達自包括通過肽編碼接頭連接的VH和VL編碼基因的融合基因。本發明的人類scFv片段包括保持恰當的構象的CDR，優選通過使用基因重組技木。
如本文所使用的，“雜交瘤”表示通過將用抗原免疫非人類哺乳動物制備的B細胞經受與來源于小鼠等等的骨髄瘤細胞的細胞融合獲得的細胞，其產生具有抗原特異性的期望的單克隆抗體。如以上所掲示的，本發明提供穩定的對照樣品溶液。根據本發明的溶液與本領域可獲得的溶液相比是更加穩定的。進ー步地，根據本發明的穩定的對照樣品溶液在2-8°C是液體，在2-8°C和甚至在更高的溫度例如室溫(即大約23°C )具有良好的穩定性，并且隨時可用(ready to use)。因此，不要求或需要額外的稀釋步驟，舉例來說，稀釋為確切體積的液體，從而降低和/或消除了由于稀釋和人工操作的誤差。進ー步地，使用時不需要添加額外的鈣離子至根據本發明的穩定的對照樣品溶液。更進一歩地，根據本發明的所述穩定的對照溶液在室溫也是穩定的。舉例來說，室溫中的穩定性是> 4小時,例如5小時、10小時、20小時、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天即I周、2周或甚至更長，例如I個月、2個月、3個月、4個月、5個月或甚至6個月或一年的室溫。在2-8 0C，例如，舉例來說，在2 °C或者4 °C，穩定性甚至是更長的，例如6個月，7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或者甚至 24 個月。因此，在本發明的ー個方面，提供包括分離的血漿的穩定溶液，并且其中所述分離的血漿是被耗竭凝血因子XII的。所述穩定溶液包括生理量或者生理量以上的鈣。進ー步地，所述穩定溶液在2-8°C或者室溫穩定至少4小時，例如5小時、10小時、10小時、20小時、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天即I周、或甚至2周或甚至更長,甚至更長例如I個月、2個月、3個月、4個月、5個月或甚至6個月或一年的室溫。在2-8°C，例如，舉例來說，在2°C或者4°C，穩定性甚至是更長的，例如6個月，7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或者甚至24個月。因此，所述包括分離的血漿并且其中所述分離的血漿是被耗竭凝血因子XII的穩定溶液，條件是使用時不添加額外的鈣，并且進一歩地，所述穩定溶液在2-8°C或者在室溫穩定> 4小吋。凝血因子XII的耗竭可以根據本領域中已知的技術來進行。ー個方法是使用因子XII的免疫吸附。另一方法是使用因子XII的抗體利用免疫親和層析(參見，舉例來 說，Current Protocols in Immunology, ISBN 1934-3671,第 8 章，第 8. 2 單兀，2007, JohnWiley and Sons, Inc)從血衆免疫耗竭因子 XII,如 Braat 等人(Eur. J. Biochemistry,1999，263 =904-911)描述的。能夠特異地結合至因子XII的抗體可以根據本領域已知的技術來產生。因子XII的抗體的例子在W089/11865中給出。測量純化之后殘留的因子XII的量的分析在以下給出，并且在，舉例來說，Jones等人(Blood Coagul Fibrinolysis, 1998,9 (2) :183-7)、Stiirzebecher，J.等人(ThrombRes.，1989，55 (6) :709-15)中，以及在 Tankerslay 等人(Blood, 1983,62 :488-456)中給出。針對因子XII的定量的合適的分析的例子是不同的免疫分析，例如，舉例來說，ELISA(酶聯免疫吸附測定)分析。ELISA利用至少ー種特異地結合至因子XII的抗體。人類因子VII的抗體是從商業來源可獲得的，所述商業來源例如，舉例來說，Abeam、AbDberotech、Thermo Scientific、Pierce Antibodies、Acris Antibodies GmbH、AgriSera、AMERICAN DIAGN0STICA等。鑒定并且甚至定量蛋白例如因子XII的免疫分析，例如ELISA分析，在本領域是眾所周知的，并且在舉例來說，在由Harlow,E和Lane,D所著的Antibodies A laboratory Manual,第 14章，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,1988中描述。簡言之，在經耗竭的血漿中的因子XII的活性可以進一歩地通過添加已知被耗竭因子XII(FXII-對照血漿)但包括凝血的所有其他相關的因子的血漿來測量。當鈣被添加，凝血開始。凝結時間(clotting time)可以通過池度的變化例如在671nm的變化來測量。如本文所使用的，“特異地與......反應”意圖等同干“能夠選擇性地結合”或“特
異地與......結合”。如本文所使用的，該表達方式意指抗體或抗原結合片段，或其變體、融
合體或衍生物，包括任何抗體來源的結合部分(binding moiety),能夠結合至分子的抗原，并且進一歩地，比與其他蛋白的結合至少10倍更強地結合至因子XII，舉例來說，至少50倍更強地或至少100倍更強地。所述結合部分可以是在生理條件下(舉例來說，體內)能夠 選擇性地結合至蛋白。測量相對結合強度的合適方法包括免疫分析，舉例來說，當所述結合部分是抗體時(參見 Harlow&Lamp ;Lane, " Antibodies A Laboratory" , Cold SpringHabor Laboratory Press, New York,該書通過引用被并入本文)。可替換地，結合可以使用競爭分析或使用Biacore 分析(Biacore International AB,瑞典)評價。將在免疫耗竭方法或者免疫親和層析法中使用的特異地結合至因子XII的抗體可以是完整的抗體或其片段，舉例來說，抗原結合片段，或其變體、融合體或衍生物，只要其能夠在體外結合至期望的蛋白。這樣的結合特異性可以通過本領域眾所周知的方法來確定，例如，舉例來說，ELISA、免疫組織化學法、免疫沉淀法、蛋白印跡法、色譜分析法和使用表達全部亞基或其異ニ聚體的被轉染的細胞的流式細胞術(參見實施例)。如何測量抗體的特異性的例子在，舉例來說，Harlow&Lane, " Antibodies A Laboratory" ,Cold SpringHabor Laboratory Press, New York中給出，該書通過引用被并入本文。“抗體”包括任何物種，例如嚙齒類動物例如小鼠、大鼠、豚鼠或者非嚙齒類動物例如兔、山羊、綿羊、狗、豬、駱駝、單峰駱駝、驢、馬或雞的大體上完整的抗體分子，以及嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體(其中與天然存在的人類抗體相比至少ー個氨基酸是突變的)、單鏈抗體、雙特異性抗體、抗體的重鏈、抗體的輕鏈、抗體的重和/或輕鏈的同ニ聚體和異ニ聚體，以及其抗原結合片段及衍生物。舉例來說，該抗體可以是單克隆抗體。抗原特異性是由可變域賦予的，并且不依賴于恒定域，如從涉及都包含一個或更多個可變域的抗體片段的細菌表達實驗獲知的。這些分子包括類Fab分子(Better等人(1988)，Science 240,1041) ;Fv 分子(Skerra 等人(1988)，Science 240，1038);單鏈Fv(ScFv)分子，其中VH和VL伴侶域(partner domain)通過柔性的寡肽連接(Bird等人(1988)，Science242，423 ；Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85，5879)，和包括分離的V域的單域抗體(dAb) (Ward等人(1989), Nature 341,544)。涉及合成保留其特異的結合位點的抗體片段的技術的綜述在Winter和Milstein (1991)，Nature 349，293-299中找到。因此，“抗原結合片段”意為抗體的功能性片段，所述功能性片段能夠特異地結合至因子XII (舉例來說，Fab片段、Fab’片段和F (ab) 2片段)、單抗體鏈(舉例來說，重鏈或輕鏈)、單可變域(舉例來說，VH和VL域)和域抗體(domain antibody, dAb,包括單域抗體和雙域抗體形式；即，dAb-接頭-dAb)。術語“抗體”也包括全部類別的抗體，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。然而，在一個實施方案中，所述抗體是IgG分子，例如IgGl、IgGl, IgG3或IgG4分子。產生抗體和抗體片段的方法是本領域眾所周知的。舉例來說，抗體可以通過以下幾種方法的任一種來產生，所述方法采用抗體分子的體內生產的誘導，篩選免疫球蛋白庫(Orlandi 等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.第 86 卷，第 3833-3837 頁；ffinter 等人，1991，Nature 349 :293_299，以上通過引用被并入本文)，或者由培養的細胞系產生單克隆抗體分子。這些方法包括但不限干，雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術和EB病毒(EBV)-雜交瘤技術(參見 Kohler 等人，1975，Nature 256 :4950497 ；Kozbor 等人，1985，JTmmun01. Methods 81 :3ト42 ；Cote 等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :2026-2030 ；Cole等人，1984，Mol Cell. Biol. 62 :109-120,以上通過引用被并入本文)。抗體可以通過免疫法來進行，在所述免疫法中完整蛋白或其合適的片段可以被注射至非人類的哺乳動物(如小鼠或免)中，接著是加強注射，以產生抗體反應。可從被免疫的動物分離的血清分離其中含有的多克隆抗體，或者來自被免疫動物的脾臟可以被用于產生雜交瘤和單克隆抗體。 在一個示例中，一種蛋白質的單克隆抗體可以根據Kohler和Milstein(Nature,256 =495,1975)的經典方法或其衍生方法從小鼠雜交瘤來制備。簡單地說，小鼠(例如Balb/c)在幾周的時間內被重復地接種幾微克選定的蛋白或其肽片段，或其合適的載體綴合物。然后將小鼠處死，并且分離脾臟的抗體產生細胞。該脾臟細胞通過聚こニ醇與小鼠骨髓瘤細胞融合，并且過量的未融合細胞通過將該體系在包含氨基喋呤的選擇性培養基(HAT培養基)上生長而被毀滅。成功融合的細胞被稀釋，并且稀釋物的各等份(aliquotes)被放置在微量滴定板的多個孔中，在所述微量滴定板的多個孔中培養物繼續生長。抗體產生克隆是通過用免疫分析程序和其衍生方法在孔的上清液中檢測抗體而鑒定的，所述免疫分析程序例如ELISA,如最初由Engvall描述的(Enzymol. ,70 :419,1980)。可以擴增選定的陽性克隆，并且收獲其單克隆抗體產物以備使用。抗體可以在使用前被純化。抗體的純化是使用本領域可獲得的、并且在如"Monoclonal Antibodies A manual of techniques" , H Zola(CRC Press, 1988)中和在"Monoclonal Hybridoma Antibodies !Techniques and Applications " ,JGRHurrell (CRC Press, 1982)中描述的技術來進行，以上書籍通過引用被并入本文。抗體或其抗原結合片段或衍生物也可以通過重組的方式生產。選定的抗原和蛋白的合適的單克隆抗體可以由已知的技術制備，如在由"Monoclonal Antibodies A manual of techniques" , H Zola (CRC Press, 1988)中和在"Monoclonal HybridomaAntibodies !Techniques and Applications" , J GR Hurrell (CRC Press,1982)中，和在"Antibodies A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory,New York 中所公開的那些技木，以上書籍通過引用被并入本文。抗體片段也可以使用本領域眾所周知的方法來獲得(參見，舉例來說，HarloW和Lane,1988, " Antibodies A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory,New York，該書通過引用被并入本文)。舉例來說，抗體片段可以通過抗體的蛋白酶水解，或者通過在大腸桿菌中或哺乳動物的細胞(舉例來說，中國倉鼠卵巢細胞培養物或其他蛋白表達系統)中表達編碼該片段的DNA來制備。
可替換地，抗體片段可以以常規方法通過胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得。因此，凝血因子XII的耗竭可以是與血液剛被從患者采出時的原始水平相比的95% -100%，舉例來說，95%、96%、97%、98%、99%、99. 9%0相應地，根據本發明的溶液的進ー步的實施方案是其中凝血因子XII的耗竭是95% -100%，舉例來說，95%、96%、97%、98%、99%、99. 9%0除了凝血因子XII的耗竭，接觸活化系統的至少ー種另外的凝血因子可以被耗竭。另外的凝血因子的例子是因子XI、前激肽釋放酶、高分子量激肽原(HMWK，又被稱為Williams-Fitzgerald-Flaujeac 因子或 Fitzgerald 因子或 HMWK 激妝釋放酶因子)。 因此，本發明所述的溶液的進ー步的實施方案是其中除了凝血因子XII，接觸活化系統的至少ー種另外的凝血因子是被耗竭的。在根據本發明所述的溶液的一個進ー步的實施方案中，除了因子XII，因子XI是被耗竭的。因子XII和因子XI的每ー種的耗竭可以是以相同的水平，舉例來說，約95% -100%，然而數值不相同。這意味著，舉例來說，因子XII可以被耗竭至約99%，而因子XI可以被耗竭約96%，或者相反，即在所述范圍內但具有在所述范圍內的不同數值。當然，所述數值也可以是相同的。如果兩種或更多種因子被耗竭，應理解不是所有的因子都需要被完全地耗竭，而是可以殘留痕量的每種因子。舉例來說，如果因子XII和因子VI 二者都被耗竭，它們可以二者都被耗竭約95% -96%，并且仍提供根據本發明的非常穩定的溶液。因此，在所述溶液的更進ー步的實施方案中，因子XII和因子XI各自被耗竭約95% -100%，舉例來說，各自分別地約 95%,96%,97%,98%,99%,99. 9%0本發明所述的穩定溶液的更進ー步的實施方案是其中凝血因子XII的耗竭是100%，如通過，舉例來說，最初由Engvall (Enzymol. ,70 =419,1980)描述的ELISA及其衍生的方法來測量的。除了本文中提到的定量測量以外，因子XII的量也可以被測量為活性量或者耗竭之后剰余的活性量。凝血因子XII的活性可以通過反映因子XII的活性的任何凝血因子分析來測量，例如本文描述的那些或者凝血分析領域技術人員已知的任何其他分析。最常見的分析是使用FXII缺陷型血漿的基于APTT的方法，舉例來說，針對ACL Top (米蘭，意大利)的IL方法。也存在使用顯色底物的方法(參見，舉例來說，Practical applicationof a chromogenic FXIIa assay. Zhuo R, Vogler EA.Biomaterials. 20060ct ；27 (28)4840—5 ；An automated chromogenic peptide substrate assay forcoagulation factorXII.Jones D ff, Gallimore MJ, Winter M. Blood Coagul Fibrinolysis,1998Mar ；9 (2)183-7)。相應地，本發明所述的溶液的進ー步的實施方案是其中凝血因子XII的活性是零(0)或接近零。除了耗竭以外，因子XII的零活性可以通過加入因子XII抑制劑來實現。這樣的因子XII抑制劑可以是直接抑制劑或間接抑制劑。直接抑制劑直接作用于因子XII。間接因子XII抑制劑抑制如圖I中所示的因子XII-級聯反應。合適的直接或間接因子XII抑制劑的例子為玉米胰蛋白酶抑制劑(因子XII的直接抑制劑)。因此，如上所述，根據本發明的穩定溶液從而是穩定的溶液，其中由于因子XII的耗竭或失活，內部正常運作的凝血級聯反應是無功能的或者功能紊亂的。致使正常運作的凝血級聯反應不運作的方法可以是通過，舉例來說，凝血因子XII的耗竭，或者通過如本文所描述的直接或間接的抑制。致使正常運作的凝血級聯反應不運作的再進一步的方法是通過添加直接地或間接地作用于因子XII的抑制劑，舉例來說，例如本文提及的，或其他在本領域已知的，或者通過添加可以直接地或間接地作用以阻滯因子XII的活性的抗體。正常的凝血級聯反應也可以由于遺傳缺陷而不運作。然而，因為該情況是罕見的，完全FXII缺陷少于1/10，000并且FXI缺陷更加罕見，從這樣的供體無限制的取得或者大量的分離血漿是不方便的。因此，本發明的溶液的進一步的實施方案是其中根據本發明的穩定溶液是耗竭因子XII的，或者以如本文所描述的任何其他方式具有不運作、或者功能紊亂、或者失去功能 的凝血級聯反應。所述不運作、或者功能紊亂、或者失去功能的凝血級聯反應是通過與正常的、健康的受治療者中的凝血級聯反應相比較來鑒定的。用于評價正常的凝血級聯反應的合適的分析是如本文所舉例說明的，或者由本領域已知的凝血分析以任何其他方式評價(參見，舉例來說，“Klinisk Biokemi i Norden，，，特別期刊 2008 :Coagulation. EdsStrandberg K, Hillarp A. Laboratory techniques in thrombosis-a manual, ACAT 分析程序的第二次修訂版· Eds Jespersen J, Bertina RM, Haverkate F. Kluwer AcademicPublishers 2000)。因而，如本文所使用的，耗竭因子XII或者因子XII的耗竭，除了因子XII本身的耗竭以外，還涵蓋通過直接或間接的手段耗竭因子XII的活性。用于因子XII活性的耗竭的直接或間接的手段的例子是，舉例來說，通過添加直接或間接作用的因子XII抑制劑，或者通過添加特異地與因子XII或與如本文所描述的在凝血級聯反應中在與因子XII相同的下游級聯反應中作用的任何其他因子(參見圖I)結合的抗體。在與因子XII相同的下游級聯反應中作用的其他因子的例子為因子XI或前激肽釋放酶、高分子量激肽原。另外的因子在圖I中給出。對于適用于Coaguchek儀器和類似儀器的凝血分析，因子FX和下游因子不能被除去。如本文所描述的，本發明所述的因子XII被耗竭或被失活的穩定溶液是具有從約0.5mole/L及以上的鈣水平(例如鈣的生理水平或以上)的穩定溶液。因為大多數血液是伴隨鈣螯合劑被采出的，鈣水平需要與因子XII的耗竭和/或失活共同地(優選之后)被立即調整以避免凝血。然后所述溶液將在室溫和2-8°C保持穩定> 4小時。通常，當血液被采出時，并且特別是當為了后續的凝血分析而被采出時，鈣螯合劑即螯合劑或化合物被過量地添加，通常是檸檬酸鹽。舉例來說，對于檸檬酸鹽，如果以IOmmoI/L的最終濃度被添加到具有I. 3mmol/L的生理水平的鈣濃度的采出的血液或血漿中，游離鈣的最終濃度將會很低(如果有的話)(參見，舉例來說，Rilby等人，ClinicalChemistry,45 8, pgll76_1180，特別是圖 I)。進一步的實施方案是，其中沒有額外的鈣被添加到根據本發明的穩定溶液。當所采的血是來自具有凝血因子XII活性或表達的遺傳缺陷的患者時，可以是這種情況。因此，針對因子XII或本文所提及的任何其他因子缺陷的患者或血液供體，不需要添加鈣螯合劑至所述經耗竭的血液及其隨后分離的血漿，并且鈣水平將保持為生理水平并且溶液穩定。
因此，相應地，根據本發明的溶液的實施方案是其中如本文所描述的所述穩定溶液的條件是所述溶液不包括任何鈣螯合劑。然而，通常，用于凝血分析的對照材料是基于血細胞血漿的抗凝血液(即，在采血后添加了螯合劑)，并且其中血 小板被進一步除去。為了除去全部血小板及其碎片，血小板的除去可以通過離心隨后濾過孔徑為O. 25 μ m的過濾器(MiniSart , Sartorius,德國)來進行。通常，在本領域被添加至對照材料的抗凝血劑是鈣螯合物質，例如，舉例來說，檸檬酸鹽或異檸檬酸鹽。本發明的穩定溶液也是這種情況。通常，所述抗凝血劑例如螯合劑如檸檬酸鹽以1/lOv/v的約O. 105mol/L至O. 13mol/L的濃度(如果使用檸檬酸鹽)被添力口。如果使用異檸檬酸鹽，可以使用稍高的濃度，例如，舉例來說，O. 3mol/l。因此，在正常情況中，當在制備本發明的穩定溶液時添加抗凝血劑或螯合劑時，鈣水平需要如本文所描述的被調整至生理水平或生理水平以上使其穩定。因此，要使所述溶液穩定，在制備所述穩定溶液時鈣水平必須是生理水平或以上。然而，在使用該溶液時，從而沒有添加鈣或者其他因子的進一步需要，如同用于凝血分析的所有已知對照材料的情況那樣。相應地，所述穩定溶液將對于作為患者本人或患者的日間護理人員的最終使用者更容易執行。在使用時更少的操作、稀釋以及額外的添加將使已知由于對現存的凝血對照材料的該額外操作而存在的誤差最小化，并且將給出所述患者的正確得多的凝血值。相應地，更加正確的凝血值本身將為患者提供更精確的護理和藥物。通常，因子XII然后通過免疫吸附法(免疫親和層析)被除去，所述免疫吸附法可以被重復。同樣，接觸活化系統的其他組分也可以通過免疫吸附法被除去，舉例來說，凝血因子XI(在如W02008/081025中所描述的)、因子X (在如W095/01571中所描述的)或前激肽釋放酶(W02004/047859)。同樣，穩定性可以通過(從血細胞)除去所有含磷脂的細胞膜來改進。作為另一選擇，可以使用來自因子XII缺陷的供體的血液。然而，其供血量是十分有限的。因子XII缺陷型血漿的純化可以以靜脈穿刺方式從具遺傳性因子XII缺陷的供體收集血液來進行。根據本發明的一個方面，本文描述的穩定溶液包括> O. 5mol/L的游離鈣，例如生理量的鈣或甚至生理量以上的鈣。離子鈣的生理量是約I. 17-1. 29mM(NORIP)。因此，進一步的實施方案是其中離子鈣的量是約 O. 5,0. 75、1、1. 1,1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、2、5、10、15或甚至是20mM。因此，在本發明的穩定溶液中，鈣水平可以是約O. 1-0. 5 μ M或以上。在任何情況下，本發明的穩定溶液不具有O. 5mmol/L或以下的鈣水平。相應地，進一步的實施方案涵蓋了其中鈣水平是至少不低于生理水平或者生理水平以上。在添加檸檬酸鹽的血漿中，所述血漿是從具有常規添加的1/10體積的O. 11或
O.13mol/L的檸檬酸鹽作為抗凝血劑的血液中制備，由于檸檬酸鹽與離子鈣形成I : I的復合物，游離鈣的終濃度是極低的。由于生理水平是l-2mmol/L，當血液被從受治療者采集時，以大量過量添加檸檬酸鹽。離子鈣的濃度已被報導為約1.25mmol/L(參見，舉例來說，Laurells Klinisk kemi. Ed Nilsson-Ehle P.Studentlitteratur 2003,和 Brown EM 和MacLeod J， Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signalling，Physiol Rev2001 ；81 :239-97 ；以及 Larsson L 和 Magnusson P，Ionized calcium orcorrected total calcium J Bone Miner Res 2003 ；18 :1554-5)。根據本發明的穩定溶液的進一步的實施方案是其中所述穩定溶液的血漿是耗竭血小板的。血小板的除去可以如上文所描述的，即，為了除去全部血小板及其碎片，通過離心隨后濾過孔徑為O. 25μ 的過濾器(MiniSart , Sartorius,德國)來進行。進一步的實施方案是其中穩定溶液還包括分離的和沖洗過的紅細胞。紅細胞可以通過從健康的供體以標準靜脈穿刺法收集血液來分離。重要的是制備時添加沖洗過的紅細胞以除去所有可能存在的因子XII。進一步地，應該除去盡量多的白細胞和血小板。通常，首先通過離心制造血小板富集的血漿，和然后接著除去血漿(包括血小板)和血沉棕黃層來進行。血沉棕黃層是經抗凝處理的血液樣品在約SOOxg離心約20分鐘之后含有大多數白血球和血小板的部分。離心后，透明液體(血漿)層、包含大多數紅血球(紅細胞)的紅色液體層和在二者之間的薄層可以被分辨，該薄層構成少于I %的血液樣品總體積，所述血沉棕黃層具有大多數的白血球和血小板。
添加至本發明的穩定溶液的沖洗過的紅細胞的量主要是為了使可被用作凝血分析(檢驗)的對照材料的所述穩定溶液與血液更相似，因為血液是將被檢驗的樣品。如果不添加沖洗過的紅細胞，本發明的穩定溶液實質上將不同于來自患者的被檢測的血液，并且從而校準和系數(factor)的添加需要通過算法來進行。這在本領域是已知的，并且以不同的分析進行，所述分析例如，舉例來說，Roche的儀器(CoaguCheck XS系統、CoaguCheck XSPlus系統和CoaguCheck XS Pro系統)。由系數重新計算(舉例來說，通過代碼芯片)的其他例子也是方便的，并且對于例如Coagucheck XS系統(參見例如www. rochediagnostics.se/content/se/coaRUcheck/coaRuChekXS. html)、ProTime Microcoagulation 系統www. protimesystem. com 和 Abbott i-STAT 系統(參見例如 ffffff. abbottpointofcare. com)是已知的。因此，一個實施方案是其中沖洗過的紅細胞被添加至本發明的穩定溶液。添加至本發明的穩定溶液的所述沖洗過的紅細胞是以等同于血液中正常的紅細胞的量的量，即，全血的約 45%，例如 40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或甚至約50%。在進一步的實施方案中，如果紅細胞被添加至本發明的穩定溶液，紅細胞的量是約1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或甚至約 60%。因此，根據本發明的穩定溶液可以進一步包括紅細胞，以與新鮮的血液樣品相似，并且從而在進行血液凝固分析(檢驗)時，不需要通過例如代碼芯片上的算法或者僅歸因于血漿和血液之間的差異的重新計算來進一步重新計算或校準分析的結果或數據。根據本發明的穩定溶液在2_8°C穩定>4小時或甚至在室溫穩定>4小時，所述在室溫穩定> 4小時當然是要求更高的。本發明的穩定溶液比本領域已知的溶液更加穩定，所述本領域已知的溶液通常需要在重構的4小時之內使用。本發明的穩定溶液不需要這樣。在進一步的實施方案中，根據本發明的穩定溶液在室溫或者在2-8°C穩定至少I周，例如I周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或者甚至更長時間，如本文所描述和進一步舉例說明的。本發明的穩定溶液在室溫也穩定> 4小時，例如5、6、7、8、9、10小時，或者甚至13、14、15、16、17、18、19、20 或者甚至 24 小時，即，多于 I 天、2 天、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或者2周，3、4、5、6、7、8、9、10周或者甚至1個月、2個月、3個月、4個月、5個月，或者更長時間，如本文所描述和進一步舉例說明的全部在室溫(RT)中。根據本發明的穩定溶液是其中所述分離的血漿是任何哺乳動物的血漿，例如牛、豬、貓科動物、犬科動物、兔、鼠科動物或人類的血漿。在本發明的一個進一步的方面，所述穩定溶液包括分離的人類因子II、VII和X，即三種維生素K依賴性因子。所述穩定溶液還可以包括因子V。如果使用分離的人類因子II、VII和X，可以使用除人類之外的另外的血漿來源，例如，舉例來說，禽類的血漿。
因此，在進一步的實施方案中，本發明的穩定溶液包括禽類的血漿，所述禽類的血漿具有分離的人類因子II、VII和X即三種維生素K依賴性因子，和任選地還有因子V以增加反應速率。如果這樣，任何來源的血漿可以被用作血漿基底，舉例來說，兔或牛的血漿。然而，如果使用除人類血漿之外的另外的來源，例如，舉例來說，牛或者兔，則避免來自接觸活化系統的因子即，前激肽釋放酶、HMW激肽原、因子XI和因子XII的污染是十分重要的。因此，所述分離的因子II、VII和X不需要具有任何可檢測量的來自接觸活化系統的至少一種因子。所述因子，舉例來說，人類因子II、VII和X，即凝血酶原時間的對照材料或者任何這些因子的分析的對照材料所需的維生素K依賴性因子，也可以是重組的并且被加入至，舉例來說，禽類的血漿或來自哺乳動物的血漿。然而，后一種血漿必須被耗竭所述接觸活化因子的至少一種。對于預期用于依賴于從纖維蛋白原生成纖維蛋白(以制造凝塊)的凝血酶原時間方法的對照材料，如果純的因子被用于生成所述對照材料，纖維蛋白原必須被添加。這樣的方法的例子是 i-STAT (Abbott, US)、HemoSense INRatio 系統(Hemosense, US)和Hemochron Jr. Signature Whole Blood Microcoagulation 系統(由 ITC, US 制造)。將被添加至穩定溶液的纖維蛋白原的合適水平是生成約O. 5g/L或以上的終濃度，例如，I、I. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4. 5g/L的纖維蛋白原終濃度。在進一步的實施方案中，根據本發明的穩定溶液是其中所述分離的血漿是人類的血漿。 在進一步的實施方案中，所述牛的血漿是來自奶牛。在進一步的實施方案中，本發明的穩定溶液包括具有分離的人類因子II、VII和IX即維生素K依賴性因子的禽類的血漿。如果這樣，任何來源的血漿可以被用作血漿基底，舉例來說，禽類的或牛的血漿，然而，那樣的話則避免來自接觸活化系統的因子即，前激肽釋放酶、HMW激肽原、因子XI和因子XII的污染是十分重要的。因此，所述分離的因子II、VII和IX需要是純的并且不具有任何可檢測量的來自接觸活化系統的因子。所述因子，舉例來說，人類因子II、VII和IX即維生素K依賴性因子，也可以是重組的并且被加入至，舉例來說，禽類的血漿或牛的血漿。可替換的從血漿清除接觸因子的方法是這樣的方法，其中凝血酶原時間的對照材料所需的凝血因子，即，凝血酶原、因子V、VII和X以及最終的纖維蛋白原(依賴于要控制的凝血酶原時間方法的變量)，是在來自健康供體的人類血漿中利用鋇鹽例如硫酸鋇沉淀維生素K依賴性因子并且添加純化的因子V和纖維蛋白原(如果需要)。來自人類血漿的維生素K依賴性因子的濃縮物是市售用于患者的靜脈內治療的，舉例來說，Ocplexi(Octapharma)和ConfidexCD (來自 CSL Behring)。
在一個特殊的實施方案中，血漿是添加檸檬酸鹽的人類血漿，鈣水平是生理水平，因子XII是與未被耗竭的血漿相比被耗竭約98%、99%或甚至99. 5%或以上的，并且穩定性是在室溫約3個月和在2-8°C約I. 5年。在進一步的實施方案中，本發明的穩定溶液是水溶液。因為本發明的所述溶液是穩定的，不需要為了儲藏而凍干。因此，所述溶液可以不需要被凍干。相應地，再進 一步的實施方案是其中所述溶液是水溶液，條件是該溶液沒有被凍干。然而，方便起見，根據本發明的穩定溶液也可以是被凍干的，即便凍干并不是為了所述溶液的穩定化目的所必需的。如果所述溶液被凍干，該凍干的溶液在使用前被重構。然而，在使用時不需要其他添加物，并且如本文所描述的，重構的穩定溶液是穩定的。有時，凍干的溶液用于例如運輸是更加方便的。盡管被保存在溶液中或者被凍干、被重構或僅被保持為溶液而不凍干，如本文給出的，本發明的穩定溶液的穩定性> 4小時。本文描述的溶液可以被凍干儲存，并且在使用之前以合適的載體重構。任何合適的凍干方法(舉例來說，噴霧干燥、濾餅干燥(cake drying))和/或重構的技術可以被采用。本領域技術人員將理解，凍干和接下來使用之前的重構可以導致不同程度的活性喪失。凍干的(冷凍干燥的)組合物可能在再水合時喪失其活性。然而，通常，與凍干之前相比，凍干的組合物在再水合時，失去其活性(凍干之前)的不多于約20%、或不多于約25%、或不多于約30%、或不多于約35%、或不多于約40%、或不多于約45%、或不多于約50%。穩定溶液的用途本發明進一步的方面提供本發明的穩定溶液作為凝血分析的對照材料的用途。在2-8°C具有增加的(B卩，>4小時)穩定性并且在室溫中也穩定>4小時的本發明的穩定溶液，由于其增加的穩定性，作為凝血分析的對照材料使用是特別合適的。因此，凍干材料的更少重構，更少的歸因于這樣的稀釋步驟而產生的人為誤差，將會實現試驗之間更少的變異性以及更加一致的和可信的結果。特別是對于其中沖洗過的紅細胞被添加至本發明的穩定溶液的實施方案，需要較少的經由算法和標準曲線的重新計算，所述算法和標準曲線是在，舉例來說，本領域通常對對照樣品使用的特定代碼芯片(舉例來說，CoaguChek XS)上。再次重復，事實上，這樣的消除至僅使用一個代碼芯片將減少并消除誤差和錯誤。因此，將會獲得更可信的結果，輔助引導對患者進一步的藥物治療。患者將得到正確劑量的血液藥物，這轉而將增加患者的生活質量以及減少住院時間和經訓練的醫院員工的使用，從而降低社會的總成本。通常，使用的HEPES緩沖液是25mM的HEPES，pH 7. 4，具有33mmol/L的鈣。針對凝血的常規篩選試驗-APTT、ACT和PT活化部分凝血活酶時間(APTT)活化部分凝血活酶時間(APTT)的方法是被研發來解決針對凝血因子缺陷的較舊的篩選方法即部分凝血活酶時間具有的問題。不同實驗室使用的腦磷脂(沒有組織因子的大腦提取物，即，“部分凝血活酶”)在效力方面有差異，并且，最重要的是，血漿通過接觸外來表面被活化至不同的程度。Proctor和Rapaport (I)通過最大化地活化添加朽1檬酸鹽的血漿來繞過該問題，所述最大化地活化添加檸檬酸鹽的血漿是在+37°C用高嶺土粉末懸浮3分鐘，隨后再 丐化(Recalcification)并確定凝血時間。用作接觸活化劑的其他材料是娃土和鞣花酸。預孵育步驟起始接觸活化，在預孵育中，因子XII和XI被前激肽釋放酶和高分子量激肽原被活化，該活化受磷脂促進。通過添加吸附過的血漿至APTT，特定的缺陷可以被檢測。
分析過程由兩步組成第I步添加檸檬酸鹽的血漿+磷脂+接觸活化劑一fXI和XII的活化第2步再鈣化一纖維蛋白凝塊因此，APTT是依賴于凝血系統的內源性途徑的，8卩，因子VIII、IX、XI、XII、前激肽釋放酶和高分子量激肽原，以及共同途徑的因子，即，纖維蛋白原、凝血酶原、因子V和因子X。因子VII和XIII對APTT完全沒有影響。APTT被用作針對凝血因子的缺陷的篩選試驗，以監控使用普通肝素(unfractionated heparins)的治療和檢測狼瘡抗凝血劑。因為不同的反應試劑和儀器對因子水平和肝素的響應性(responsiveness)變化很大，標準化APTT以及引入共同單元(common units)是不可能的。一些反應試劑對因子缺陷更靈敏，而其他反應試劑對因子缺陷較不靈敏，但對狼瘡抗凝血劑更加靈敏。針對健康對照的參照范圍必須被在當地決定。錯誤地延長的APTT的成因是用于沖洗留置導管(indwelling catheters)的肝素的污染、歸因于裝料不足的樣品中過高的朽1檬酸鹽濃度以及歸因于不充分混合的部分凝結的樣品。在內源系統的起始，APTT是對因子缺陷最靈敏的。因子VIII或IX的輕微因子缺陷(> 25% )通常不被檢測到，但針對一些反應試劑，甚至僅10%的因子濃度也可以被檢測到！舉例來說，若干年前，部分歸因于不靈敏的反應試劑以及在參照范圍之內的APTT，一個年輕男孩的血友病的正確診斷在膝關節流血之后被延誤多于兩個月。大多數反應試劑對因子IX缺陷比對其他因子缺陷較不靈敏。應強調，患輕微的以及在最壞的情況甚至為中度的流血紊亂的許多患者將具有正常的APTT。對肝素的響應性在反應試劑之間變化至少兩倍，并且從而導致與對照值相比
I.5-2. 5或2-3倍的APTT的延長。然而，肝素的劑量將取決于當地的反應試劑_儀器的組合而大范圍地變化。APTT甚至可以在同品牌(same make)的儀器之間以及反應試劑批號之間相當大地變化。假性的短APTT的重要成因是從血液樣品中的血小板泄漏(leakage)血小板因子4，所述血小板因子4中和肝素，從而重要的是在血液取樣之后立刻(一小時之內)分離血漿。然而，近年來，用普通肝素(UFH)靜脈內治療靜脈血栓栓塞已經減少非常多，并且已經被用無APTT實驗室監控、按體重調節地皮下給予低分子量肝素(LMH)替代。LMH治療延長APTT ;以預防劑量，僅延長APTT數秒，而以用于治療靜脈血栓形成的劑量，APTT通常將超過參照范圍的上限數秒。用華法林(warfarin)的治療也延長APTT，在INR 2_3，通常延長至超過參照范圍上限5-15秒，但當嚴重地服藥過量時，APTT可以被延長至> 180秒。活化凝血時間(ACT)Hattersley為新鮮的全血樣品調整了 APTT試驗，使用硅藻土作為活化試劑。他將所述試驗命名為活化凝血時間(ACT) (2)。現在，高嶺土和硅藻土是兩種最常用的接觸活化齊U，有時組合使用。硅藻土比高嶺土更加響應于抑肽酶(3)。ACT比APTT具有更廣的劑量范圍響應，所以ACT被用于監控高劑量的UFH療法。與APTT不同，ACT仍是最頻繁進行的凝血分析中的一種，并且試驗的數目是增加的，就地檢測以控制在心內直視手術(open-heartsurgery)和經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention)中用靜脈內UHl的治療。通常，為了在將患者連接至體外循環時避免凝血，肝素劑量旨在實現>420-480秒的凝血時間。取決于反應試劑和儀器，來自用高劑量肝素的患者的血漿樣品的ACT可以相當大地變化，甚至在重復樣品之間。所述變化比APTT的變化更加嚴重(4)。為了改進客戶接受度，一些生產商已經在儀器的軟件中引入算法，將測量到的凝血時間在針對心內直視手術的判斷限值(decision limit)轉換成為等于舊的人工方法。凝血酶原時間(PT、PT-INR、PK_INR)PT為了三個目的被使用監控用香豆素的口服抗凝血劑療法，評價在嚴重肝臟疾病中肝臟的功能，以及篩選在外源性途徑和共同途徑中的缺陷。使用兩種不同類型的分析。由Quick在20世紀30年代發明的分析類型(5、6)是以使用未稀釋的添加檸檬酸鹽的血漿與等體積的凝血活酶反應試劑(=無添加的凝血活酶)和氯化鈣溶液或者兩體積的凝血活酶與氯化鈣的混合物混合為特征的。凝血活酶是含有組織因子和磷脂的提取物，通常來自 兔的大腦或人類胎盤-組織因子富集的來源。近年來，重組的組織因子已經被引入。QuickPT的結果取決于維生素K依賴性因子II、VII和X的活性以及因子V和纖維蛋白原的活性。因子V是不穩定的，并且因此血液樣品必須在血液取樣之后一小時之內被分析，或者血漿必須被分離和冷凍。概要地，所述分析過程如下添加檸檬酸鈉的血漿+凝血活酶+Ca2+ —纖維蛋白凝塊更特異的分析類型是在近二十年后由Owren所描述的(7、8)。所述分析的特征是將患者的樣品與含有凝血活酶、因子V、纖維蛋白原和氯化鈣的反應試劑(=合并的凝血活酶)混合。由于因子V和纖維蛋白原的添加(常以因子II、VII和X耗竭的牛血漿的形式)，該分析對凝血因子II、VII和X更特異。如果PT是通過Owren方法分析的，來自用華法林的患者的樣品可以被儲存在室溫48小時。在來自口服抗凝血劑的患者的樣品中，PT主要取決于凝血酶原和因子VII。簡要地,針對Owren PT的分析過程如下在緩沖液中1/7預稀釋的添加檸檬酸鹽的血漿+經耗竭的牛血漿+兔凝血活酶+Ca2+—纖維蛋白凝塊Owren方法已經被修改，并且在目前在北歐和波羅的海國家實施的Owren類型的PT分析過程中，存在以含有檸檬酸鹽的緩沖液的初始血漿樣品稀釋(I份+6份)，隨后添加合并的反應試劑(2份)至稀釋的樣品(I份)，產生1/21的最終樣品稀釋。這可以與原始的Quick PT分析形成對比，所述原始的Quick PT分析具有1/3的最終樣品稀釋。在針對利用凍干的凝血活酶被天然的血液樣品溶解的就地檢測修改的Quick PT分析中，患者的血衆完全沒有被稀釋，舉例來說，在CoaguChek儀器中(Roche Diagnostics,巴塞爾,瑞士)。目前的Owren方法的優勢是PT試驗需要最小量的樣品，并且因此所述試驗對于兒科的和毛細血管的樣品的自動實驗室分析是合適的。所述稀釋還降低干擾，這當狼瘡抗凝血劑或其他抑制劑例如直接凝血酶抑制劑存在時是特別期望的(9、10)。使用Quick方法，以及特別是如果所述方法被應用于就地檢測的儀器，狼瘡抗凝血劑可以相當大地增加INR值，并且患者處于治療不足以及血栓形成的危險中。
使用PT,初步結果是以秒計的凝血時間,對于正常血衆,使用Quick方法的凝血時間是約12秒，使用Owren方法的凝血時間是約20秒。纖維蛋白的形成通常是通過由濁度分析法(turbidometry)或者池度法(nephelometry)檢測的吸光度的增加來被檢測,可選擇地通過由機械設備檢測的粘度的增加來被檢測。不同的凝血活酶顯示出對因子缺陷的不同的靈敏性。輕微的因子缺陷(> 40% )可能不被檢測到。自發地延長的PT的最常見的成因是肝臟疾病、遺傳性因子VII缺陷(通常是輕微的、沒有出血癥狀)以及維生素K攝入不足。UHl的治療劑量延長PT數秒，除非反應試劑含有肝素中和劑。由于其所要求的低的血液體積，Owren方法方便地分析取自毛細血管的添加檸檬酸鹽的全血，但是非常高或非常低的血球密度(hematocrit)將造成錯誤的結果，除非儀器針對血球密度測量并補償，所述針對血球密度測量并補償通過例如就地檢測儀器Simple Simon (Zafena AB, Borensberg,瑞典)來進行。多年以來，PT結果是以秒、凝血酶原指數、凝血酶原活性或者凝血酶原比值表示
(11)。取決于反應試劑，所述結果以及由此的香豆素的平均劑量在醫院之間變化很大。為了標準化PT，國際標準化比值(INR)在1983年被世界衛生組織采用(12)。INR= (PT/MNPT) ISI。PT是以秒計的凝血酶原時間，MNPT是來自至少20個正常受治療者的血漿樣品的PT的幾何平均值，以及ISI是凝血活酶的國際靈敏性指數。ISI的概念是將從用當地工作方法獲得的比值轉換為假如用指定為67/40的凝血活酶的一級國際參考品(first international reference preparation, IRP)獲得的比值，使用手工傾斜試管技術(manual tilt tube technique)。所述工作方法的ISI是由分樣(split-sample)PT測試對參照方法以及IRP確定的。來自至少20個正常受治療者和60個穩定口服抗凝血劑的患者的新鮮血漿必須通過兩種方法來測試。ISI是參照方法Iog-PT對工作方法Iog-PT的正交回歸線的斜率。IRP 67/40的原始貯存(stock)已經被耗盡，并且二級IRP的鏈(chains)已經以分級模式被賦以ISI值。取決于使用哪個二級IRP，結果將顯著地偏離，歸因于在每次賦值中引入的誤差以及在IRP的儲存期間性質的微小變化。WHO規程是繁瑣的，IRP的貯存是有限并昂貴的，并且校準必須被在每個實驗室每年進行多次(當改變反應試劑批號、儀器或者儀器售后服務時)。極少實驗室使用WHO規程，反而依賴由制造商提供的ISI值。然而，被賦于各類儀器或模式的ISI值對特定儀器并不一定是有效的。由于以上描述的校準程序的限制，存在對使用具有被賦以INR值的血漿校準器的增加的興趣。然而，校準器的不同的IRP、分析方法和生產方法可以導致顯著不同的被賦以的INR值。此外的未解決的問題的兩個例子是需要多少個校準器以及校準器對新鮮的患者血衆的基質效應(matrix effect)。在使用Owren類型PT的瑞典和挪威，可替換的校準程序在1999年被引入(13)。所述方法利用正常血漿的稀釋物替代IRP，并且正常活性的百分比(PT% )被轉換為INR(INR=(1/ΡΤ% +0.018)/0.028)，所述轉換是通過使用源自回歸分析的方程式，基于使用Owren方法和手工傾斜試管技術以及IRP的血漿樣品的分樣分析，所述血漿樣品是來自正常受治療者和口服抗凝血劑的患者。舉例來說，100%= INR 1,25%= INR 2. 07,20%= INR2. 43、10%= 4. 21。使用該算法，任何正常血漿的稀釋物具有一永遠有效的INR值，所述INR值被用于對凍干的校準器賦以INR值。因此，不再需要參照凝血活酶(IRP)。在當地實驗室水平僅需要兩個校準器，一個在正常范圍中并且一個具有在治療范圍中的INR。在數個實驗室已參加外部質量控制項目的瑞典，三年的隨訪報告，用該當地INR校準，實驗室之內和實驗室之間的變化已經變為明顯地改進的(14)。盡管在丹麥、芬蘭和冰島，不同模式的校準被用于Owren-ΡΤ,以國際角度看在北歐國家的實驗室間的變化是非常小的(15)。為了獲得用Owren類型PT的正確的結果，重要的是混合血液樣品，以確保抗凝血和均質的血漿，以使得樣品和反應試劑在分析之前被平衡至正確的溫度，以在分析之前所要求的時間溶解反應試劑(以避免在工作日期間ISI和/或MNPT的改變)、以進行正確的校準、以運行對照樣品并且遵循QC的規則。盡管PT已經被用于控制口服抗凝血劑多于60年，仍需要反應試劑和校準程序的改進。在使用Quick方法的國家，實驗室之間的變化相當大，并且對于一種患者樣品，歸因 于反應試劑的性質，可能獲得臨床上顯著不同的結果。如果仍使用Quick PT方法的國家變為使用更特異的Owren PT方法,會實現顯著的改進。產生穩定溶液的方法本發明進一步的方面是產生穩定溶液的方法，所述方法包括以下步驟a)分離血漿，b)耗竭所述血漿的因子XII，和c)調整游離鈣的水平至彡O. 5mol/L、生理水平或以上。本發明進一步的方面是提供用于產生本發明的穩定溶液的方法，其中所述方法包括a)添加分離的人類因子II、VII和X至分離的血漿，和b)調整游離鈣的水平至彡O. 5mol/L的步驟。本發明進一步的方面是提供用于產生穩定溶液的方法，所述方法包括a)添加分離的人類因子II、VII和X至分離的血漿，和b)調整游離鈣的水平至彡O. 5mol/L的步驟。更進一步的方法是a)分離人類因子II、VII和X，b)添加耗竭至少一種接觸活化因子的非人類血漿，所述接觸活化因子例如，舉例來說，激肽釋放酶、HMW激肽原、因子V、因子XI或因子XII，c)調整游離鈣的水平至彡O. 5mol/L、生理水平或以上。如本文所描述的，分離的血漿可以是哺乳動物的血漿，例如人類的血漿，或者非人類的哺乳動物血漿，例如兔或牛的血漿。分離的血漿也可以是非哺乳動物的血漿，例如禽類的血漿。如本文所提及的，如果使用禽類的血漿，不需要進一步耗竭至少一種接觸活化因子。如果使用非人類的哺乳動物的血漿，本文描述的所述方法還包括耗竭非人類的哺乳動物的血漿的至少一種接觸活化因子的步驟。因為穩定溶液的鈣水平是生理水平或以上，可選的步驟d)是其中，取決于鈣螯合劑是否在取血時被添加，鈣水平被調整至生理水平。然而，通常，鈣螯合劑是被添加的，并且隨后調整鈣水平至生理水平或以上的可選步驟是強制性的。所述可選步驟是由于分離的血漿的血液來源。如果正常的血液供體被采血，鈣水平需要被調整至生理水平或以上。如果血液供體是因子XII缺陷的(即本身在活性或蛋白表達上缺陷)，不需要添加額外的鈣，這是因為由于采血時不需要添加螯合劑或抗凝劑，鈣水平將會是生理水平或以上。因此，在上述用于制備所述穩定溶液的方法中，鈣水平需要被核對是否為正常的水平或以上，并且如果需要(即鈣水平是低于正常水平的)，調整至正常水平或以上。血液或血漿中的離子隹丐水平可以由大多數血氣分析儀(blood gas analyzers)來測量,舉例來說，RadiometerABL720,或者 Kone clinical chemistry analyzer。分別參見 http://www. radiometer,com/ 和 http://www. thermofisher, com/global/en/products/home, asp。參見，舉例來說，Laurells Klinisk kemi. Ed Nilsson-Ehle P.Studentlitteratur 2003 ；Brown EM 和MacLeod J, Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signalling,Physiol Rev 2001 ;81 :239-97 ;以及 Larsson L 和 Magnusson P, Ionized calcium orcorrected total calcium J Bone Miner Res 2003 ；18 :1554-5。血漿可以在如通常標準的作為螯合劑的檸檬酸鹽(檸檬酸緩沖液)、異檸檬酸鹽或者草酸鹽緩沖液或類似緩沖液中通過正常的靜脈穿刺來分離。通常，檸檬酸緩沖液是以約1/10體積的約O. 105,0. 01或O. 13mol/L的終濃度、中性或者略酸性的pH(舉例來說，pH約6-7. 4)被添加，即大量過剩于血漿中的游離鈣。如果供體具遺傳性的因子XII缺陷，血液被采出而不添加任何鈣螯合劑。然后血液被采集在例如塑料試管中而無任何另外的添加物(例如檸檬酸鹽(檸檬酸)或異檸檬酸鹽緩沖液)，使用吸入或真空原理的采集，舉例來說，使用Monovette, Sarstedt0然后血液 被離心，并且血沉棕黃層和紅細胞最上面的部分如本文所描述的被除去。第二次離心之后，保存血漿并且丟棄沉淀團。如果需要，接著進行因子XII的耗竭。如何從血漿耗竭因子XII是本領域已知的，并且被進一步在本文中被舉例說明，通過，舉例來說，免疫方法、使用金屬氧化物(例如，舉例來說，二氧化鈦)的耗竭，以及其他方法。如果需要，至少一種另外的免疫接觸因子的耗竭也可以使用免疫方法及本領域技術人員已知的類似方法來進行。鈣水平被進一步測量，并且鈣被添加至血漿以調整鈣水平至生理水平或以上。進一步地，因子XII缺陷的血漿可以然后被保持為根據本發明的穩定溶液或被凍干。如果被凍干，使用之前需要重構。然而，凍干不是為了穩定化的目的而被需要。在重構之后，所述溶液可以然后被保持為穩定溶液。用于所述穩定溶液的制備的方法可以然后還包括耗竭血漿中的血小板的步驟。血小板可以通過在約180-200xg離心隨后濾過孔徑不大于O. 25 μ m的過濾器來耗竭，如本文所描述的。用于穩定溶液的制備的根據本發明的方法可以然后還包括添加沖洗過的紅細胞。紅細胞的沖洗在本領域是已知的，并且在本文被進一步描述。沖洗可以通過在IOOOxg離心、以等量在生理鹽水中重懸以及重復離心來進行。因此，進一步的實施方案是其中所述血漿是人類的血漿。再進一步的實施方案是其中所述添加的沖洗過的紅細胞是人類的紅細胞。本發明的進一步的方面是其中根據本發明的穩定溶液是通過本文所描述的方法可獲得的。用于評價凝血系統狀態的方法本發明更進一步的方面涵蓋評價受治療者中凝血系統狀態的方法，所述方法包括以下步驟a)提供根據本發明的穩定溶液，b)提供來自受治療者的血液樣品，
c)測量所述受治療者的凝血系統的狀態，d)分析所述患者的凝血系統的狀態，e)將所述受治療者的凝血狀態與陽性和/或陰性標準比較，從而評價所述患者中的凝血系統狀態。本發明再進一步的實施方案提供用于評價受治療者中的凝血系統狀態的方法，所述方法包括以下步驟a)在來自所述受治療者的血液樣品中測量所述受治療者的凝血系統的狀態，和b)分析與根據本發明的穩定溶液相比較的所述受治療者的凝血系統的狀態，從而評價所述受治療者中的凝血系統狀態。所述方法的條件是，在臨使用之前不添加另外的鈣至所述溶液，如血液凝結分析的正常情況那樣。因此，所述穩定溶液是具有生理水平的鈣的溶液，并且條件是運行分析新鮮血液樣品和對照材料的就地檢測儀器的人/個人不添加鈣至所述穩定溶液。 凝血系統的狀態的測量可以由本領域已知的評價凝血系統的功能的不同試驗來進行。本發明的穩定溶液可以然后在分析中作為對照材料使用。分析/試驗的例子是，舉例來說，PT(凝血酶原時間，也用于確定INR)、混合試驗(如果將患者的血漿與正常的血漿混合，患者的異常是否被修正)、凝血因子分析、凝血彈性掃描法(TEG或者Sonoclot)。接觸活化途徑是被血漿的接觸因子的活化來起始的，并且可以通過aPPT試驗測量。組織因子途徑是通過組織因子(特定的細胞脂蛋白)的釋放來被起始，并且可以由PT試驗來測量。PT的結果通常被記錄為比值，即INR(國際標準化比值)值。測量之后，對每個樣品進行分析，并且分析在測量步驟中對樣品給出的值。進一步地，可進行與分析中包括的正對照和/或負對照的隨后的比較。本發明的穩定溶液可以被照此使用。如果所述分析是以混合分析(mixing assay)進行的，本發明的穩定溶液也可以被用作混合組分。對于這樣的混合分析，維生素K依賴性因子也必須從一種混合溶液中被耗竭，所述混合溶液將要與具有正常含量的這些因子的一種溶液混合。維生素K依賴性因子的耗竭可以通過使用吸附至鋇鹽或者通過免疫耗竭來進行。以百分數表示的凝血酶原復合物活性可以通過使用已發表的算法(Lindahl TL等人，INR calibration of Owren-typeprothrombin based on the relationship between PT% and INR utilizing normalplasma samples. Thromb Haemost 2004 ；91 1224-31)被轉換為 INR。進一步的實施方案是其中所述受治療者是人類受治療者。凝血系統的狀態可以通過選自由PT(凝血酶原時間)、混合試驗、凝血因子分析、凝血彈性掃描法(TEG或Sonoclot)以及優球蛋白溶解時間(ELT)組成的組的分析來測量。所述方法還可以包括其中來自受治療者的血液樣品是在測量和分析所述凝血系統的狀態之前與根據本發明的穩定溶液混合。試劑盒本發明的進一步的方面涵蓋包含根據本發明的穩定溶液的試劑盒。如果方便，所述穩定溶液可以以凍干形式被提供。然而，這不是為了本發明所述的穩定溶液的穩定性的目的所需要的。
在一些實施方案中，試劑盒包括指導性材料，所述指導性材料公開，舉例來說，使用本發明的穩定溶液作為凝血分析/檢驗的對照材料的方法，或者使用特殊的反應試劑的方法。所述指導性材料可以被以電子形式(舉例來說，計算機軟盤或光盤)書寫，或者可以是可視化的(舉例來說，視頻文件)。所述試劑盒還可以包括額外的組分以輔助所述試劑盒為之設計的特殊的應用。因此，舉例來說，所述試劑盒可以包括用于實施特別地公開的方法的緩沖液和其他常規反應試劑。這樣的試劑盒和恰當的內容物是本領域技術人員所熟知的。
所述試劑盒還可以包括對于至少一次檢驗足夠的量的根據本發明的穩定溶液，所述穩定溶液是作為單獨地包裝的反應試劑。典型地，還包括被包裝的反應試劑的使用說明。典型地，這樣的說明包括描述反應試劑的濃度和/或至少一種檢驗方法的參數(例如，反應試劑和將被混合的樣品的相對量、反應試劑/樣品摻合物的保持時間段、溫度、緩沖液條件等等)的具體表述。因此，進一步的實施方案是其中所述試劑盒還包括針對其作為用于凝血分析的對照材料使用的說明書。甚至更進一步的實施方案是其中所述試劑盒還包括針對其用于根據本發明的方法的說明書。試劑盒的某些實施方案可以包括運送工具，例如盒、袋、背包、塑料箱(例如吹模塑料或其他透明的包裝)、包裝材料(例如，密封的或可密封的塑料、紙或金屬包裝材料)、或其他容器。在一些例子中，試劑盒的組分將被裝入單獨的包裝單元中，例如盒或其他容器，該包裝單元可以具有分隔，試劑盒的一個或更多個組分可被放置在所述分隔中。在其他實施例中，試劑盒包括一個或更多個容器，例如可以保存如一個或更多個將被檢測的血液樣品
的瓶、管等等。其他的試劑盒的實施方案包括，例如，注射器、棉拭子或乳膠手套，所述注射器、棉拭子或乳膠手套可以是對操作、收集和/或處理血液樣品有用的。可選擇地，試劑盒還可以包括將血液樣品從一個位置移到另一個位置有用的用具，舉例來說，滴管、注射器等等。再其他的試劑盒實施方案可以包括用于丟棄使用過的或不再需要的物品(例如受治療者的樣品等)的處理工具。這樣的處理工具可以包括，而不局限于，能裝來自丟棄的材料的滲漏物的容器，例如塑料的、金屬的或者其他不滲透性的袋、盒或容器。本文的所有參考文獻通過引用被并入本文。體現本發明的某些方面的非限制性的實施例將在此描述。
實施例實施例I-從具有因子XII缺陷的供體純化因子XII缺陷血液和凝血酶原時間的測量采集時間血液被通過靜脈穿刺從兩個具有遺傳性因子XII缺陷(即，當通過使用免疫耗竭的血漿的凝血時間測量時，因子XII低于檢測下限)的供體采集，血液被采集在塑料試管中而無添加物(Monovette, Sarstedt)(沒有抗凝的添加物)。所述血液被在180xg離心20分鐘。血沉棕黃層和紅細胞的最上層部分被除去，接著是第二次離心步驟，1000xg,5min。保存血漿并丟棄沉淀團。紅血球的沖洗血液被通過肘前靜脈的靜脈穿刺從健康的供體采集，并且被采集在含有1/10體積的檸檬酸鈉(O. 13mol/L)的 真空試管中。所述試管被在180xg離心20分鐘，丟棄富集血小板的血漿和紅血球的最上層部分。添加等體積的Owren' s緩沖液。紅血球團被重懸，接著在IOOOxg離心5分鐘。丟棄緩沖液相，添加等體積的生理鹽水，并且重復離心步驟。在添加至因子XII耗竭的血漿之前血細胞 被混合。利用就地檢測儀器CoaguChek XS測量凝血酶原時間對于血漿，遵循來自儀器制造商的對照材料的說明，即，如所指示的，將針對對照材料的代碼芯片(code chip)插入儀器。不同批號的反應試劑已經被使用，舉例來說，183，以及針對由Roche提供的對照材料的代碼芯片028，批號170。對于CoaguCheck采血筆(stick)，舉例來說，批號20165732。結果結果示于表I中。-未稀釋的因子XII缺陷的血漿INR= I. O (對健康供體的預期結果；INR1±0.2)。該因子XII缺陷的血漿從志愿患者獲得，所述志愿患者具有已知的遺傳性因子XII的完全缺陷(低于利用在來自Il (米蘭，意大利)的ACL Top上的一步凝結方法的檢測下限)。-因子XII缺陷的血漿在HEPES緩沖液中1+1預稀釋；INR= I. 9 ;1· 9和I. 8(η =3)-遵循針對毛細血管的說明使用新材料，新鮮的血液從口服抗凝血劑的患者或者健康的供體獲得，即，僅對新鮮的、未稀釋的血液使用代碼芯片。-未稀釋的因子XII耗竭的血漿與沖洗過的紅血球和因子XII缺陷的血漿以1+1的體積混合，并且然后被測量。結果INR= I. I ；1. 2 ;L 2(預期結果 INR 1±0· 2)-同上，但因子XII耗竭的血漿在與沖洗過的紅血球混合之前，以等體積的HEPES緩沖液稀釋。結果INR= 2. 4 ;2· 5 ;2· 5將所述因子XII缺陷的血漿與因子XII被免疫耗竭的血漿即冷凍運輸的Cryocheck (Precision Biologic，目錄號 #FDP_12_10，批次#D12-12)交換。將該血漿與25mM的CaCl2等體積混合。根據來自Roche的說明作為對照樣品在CoaguCheck XS上測量。結果INR= I. 5 ；1. 5 ;1. 5(預期值 INR = I. 4±0· 2)。將因子XII缺陷的血漿(來自患者)與3倍體積的HEPES緩沖液混合，INR = I. 9 ；1.9 ;1. 9 (預期值INR= 2. 0±0. 2)(如前，未稀釋的INR= 1.0)。在+22。。儲藏16小時后測量。結果INR = 2. O ；1. 9 ;1· 9，即完全無差別!將缺陷的血漿在25mM的HEPES緩沖液中1+3稀釋，該25mM的HEPES緩沖液具有33mmol/L的CaCl2和終濃度為5mmol/L的疊氮化鈉。表I來自因子XII缺陷的新患者的血漿的穩定性
天數=O I Γ~2 p7~INR179O 270 2.4 實施例2-穩定性試驗A.因子XII被吸附至< 1%。從正常的供體收集的血漿在HEPES緩沖液(4. 89g HEPES至IL水)中被稀釋，每IOmL血漿使用18.9mL HEPES緩沖液。為調整鈣濃度至生理水平，添加I. 33mL的氯化鈣儲 液(O. 5mol/L) ο添加150微升疊氮化物儲液(lmol/L)以防止細菌生長。穩定性結果在表2中示出。表2-在第3、5、8和12天的穩定性
3天 5天8天12天
O2小時 4小時 24小時 48小時120小時 192小時 288小時~
INR 176 hi O O O179 Γθ當使用這種產生穩定溶液的方法時，INR在第一個小時可能稍微變化。然而，24小時之后，INR穩定。歸因于設備的INR數值的變化是約O. 1INR。所述溶液被存放在室溫。B.在該實施例中，使用來自因子XII缺陷的受治療者的血漿。該缺陷在所述受治療者的血液中留下少于< 1%的因子XII。不添加檸檬酸鹽至所述血漿。不添加疊氮化物至所述血漿。結果示于表3中。表3-在24小時、48小時、3天和4天的穩定性新鮮制備 24小時48小時3天 4天
1.21.3 1.3 1.3 1.3C.以下的實施例具有已經被在HEPES緩沖液(包括O. 13mol/L氯化鈉)中稀釋的來自B的因子XII的血漿，以獲得來自穩定性測量的更高的INR值的數據，示于表4中。表4-在24小時、48小時、3天、4天和I周的穩定性
Γ 新鮮制備 24小時48小時3天 4天 I M---------
2.1_2.2 2.3 2.5 2.5 2.9在這種情況下，僅穩定一天。實施例3-凝血因子XI和/或因子XII缺陷的血漿的產生根據來自制造商的說明，針對因子XI的抗體(針對人類因子XII的多克隆雞抗體)和針對因子XII的抗體(山羊抗人類因子XII，純化的IgG)被分別偶聯至來自Innovata(斯德哥爾摩,瑞典)的 Novarose ActHlgh100/40 膠。添加檸檬酸鹽的人類血漿被施加在所述膠頂部，級分被收集。測量在280nm的吸光度。含有最多蛋白質的級分(最高的吸光度)被使用PT(Owren方法)來分析。具有PT-INR < 3的級分被保存并且貯存在_70°C。所述級分中的一些被施加至也具有被固定的另一抗體的柱，從而制造雙重缺陷的血漿。所述缺陷血漿被以1+3在含有8. 8mol/L的CaCl2的低離子強度HEPES緩沖液(25mmol/L,pH 7.4)中稀釋。使用低離子強度的緩沖液是為了能夠使用具代碼芯片和測試條(test strips)的Coaguchek XS儀器,所述儀器預期用于天然的人類毛細血管血(在所述儀器中使用阻抗測量以核對樣品是血液或血漿，如果不是所預期的，所述儀器不給出結果，而給出一錯誤信息。此處的預期是使用如針對全血使用的相同的程序，所以使用所述低離子強度的緩沖液)。考慮到稀釋效應，對于一種因子缺陷的血漿，預期稍微超過INR = 2的結果(如果在產生所述缺陷的血漿時沒有稀釋，將會預期2. O和3. 3)，對于雙重缺陷的血漿，預期約 3.5。因此，以下的表5和表6獲得的值如所預期的表5-對于因子XI、XII和雙重耗竭的血漿的超過24小時的穩定性測量
使用的抗體在零時刻的INR 在24小時的INR 在8天的INR
FXI__13__2A__42_
FXll2.43.1未檢測FXIΦ FXII 3.43.9未檢測
(I vol)*____
FXl-XH 2.12.7未檢測
(2 volf* ___*)缺陷血漿與所述低離子強度緩沖液以1+3混合，**) 2+3。用山羊抗體的FXII的吸附表現為在收集的穿透的級分中留下痕量的FXII。在該特定情況下，FXI的吸附是更有效的，具有滿意的穩定度，雖然不能持續8天。表6-新一批血漿
使用的抗體零時刻第I天第2天第7天的 INR的 IMR的 INR的 INR
FXI_6J_2J_2J_U_最初24小時的奇怪變化的原因未知，并且在上面的之前的試驗中沒發生過。然而，重要的是從第一天及以后的穩定性。實施例4-使用吸附至不同的帶負電材料來產生FXII缺陷的血漿以及比較由這樣的吸附獲得的缺陷血漿的穩定性血漿的制備新鮮的血液從健康的志愿者抽取，并被收集在帶檸檬酸鹽的4. 5mL Monovette采樣管(Sarstedt，德國)中。為獲得血小板富集的血漿(PRP)，新鮮的血液在140g離心20min。離心后，血小板富集的上清被轉移至新的塑料試管中。不含血小板的血漿(PFP)通過血液在2500g離心15分鐘并且濾過O. 20微米的Minisart膜過濾器(Sartorius,德國)來產生。因子XIIa的活性因子XIIa的活性是使用在添加檸檬酸鹽的血漿中的因子XIIa的熒光底物Boc-Gln-Gly-Arg-AMC(參見[I])來測量的。血漿被在二氧化鈦或高嶺土粉末中孵育5分鐘，使用每毫升血漿O. 5g粉末的比率。血漿樣品被儲存在冰箱中，并且樣品等份在I小時、
I天、2天和4天被冷凍。此后，全部樣品被解凍并且用250微摩爾的因子XIIa活性底物來評價。突光的測量是在 Fluoroskan 96 孔讀板儀(Fluoroskan 96-well plate reader)中進行，使用390nm的激發波長和460nm的發射波長。結果被計算為最大因子XIIa底物裂解率，并且在圖2中以平均值+SD呈現。從結果看，因子XIIa活性的更高水平在高嶺土處理的血漿樣品中找到。然而，該水平隨時間降低(使用成對樣品的t檢驗比較第O天和第4天，P < O. 05)。結果在圖2中示出。 實施例5-內源性凝血酶替能(ETP)內源性凝血酶潛能(ETP)用利用針對凝血酶的熒光底物的經校準的凝血酶生成分析(Thrombinoscope)來測量(參見[2])。根據H. C. Hemker,ETP可以被用于“在一給定的血漿樣品中評價可以影響凝血酶生成的全部因子的組合效應” [3]，S卩，對于凝血酶原時間，與對照材料有關的是什么。分離自三個不同個體的添加檸檬酸鹽的不含血小板的血漿(參見血漿制備段落)被在二氧化鈦或高嶺土粉末中孵育5分鐘，使用每毫升血漿O. 5g粉末的比率。所述血漿樣品在冰箱中儲存，并且樣品等份在I小時、I天、2天和4天被冷凍。此后，全部樣品被解凍并且用由Hemker等人描述的凝血酶生成方法[2]來評價。凝血酶生成被使用Thrombinoscope軟件包(Thrombinoscope BV，荷蘭)計算為ETP。應注意，使用高嶺土孵育的血漿僅產生平坦的凝血酶生成曲線，所述平坦的凝血酶生成曲線給出零ETP。總之，高嶺土吸附對于對照材料的產生不是一個選擇。參見圖3。圖3示出0、1、2和4天之后的凝血酶生成，其計算為以平均值+SD呈現的內源性凝血酶潛能(ETP)。數據代表分別與二氧化鈦一起孵育5分鐘(條紋的)和60分鐘(純黑)，以及與高嶺土一起孵育5分鐘(白色具黑點)和60分鐘(黑色具白點)。實施例6-用CoaguCheck(Roche)測量的凝血酶原時間(PT)分離自三個不同個體的添加檸檬酸鹽的不含血小板的血漿(參見血漿制備段落)被在二氧化鈦或高嶺土粉末中孵育5分鐘，使用每毫升血漿O. 5g粉末的比率。然后，所述血漿樣品在冰箱中儲存4天。在PT測量中10微升血漿被與30微升所述含鈣的低離子強度緩沖液混合。此后，制備的血漿樣品在CoaguCheck中測量，并且INR或錯誤代碼被記錄。在高嶺土中孵育的血漿在PT測量中僅生成錯誤代碼(3個供體中的3個)，而在二氧化鈦中孵育的血漿樣品可以全部被測量并且得到INR值(3個供體中的3個)。結果在表7中示出。表7.來自用CoaguCheck(Roche)的凝血酶原時間測量的INR值或錯誤代碼
權利要求
1.一種穩定溶液，所述穩定溶液包括分離的因子II、VII和IX以及分離的血漿，其中所述溶液包括彡O，5mol/L的鈣，并且其中所述溶液在2-8°C和/或在室溫穩定> 4小時。
2.所述穩定溶液，其中所述因子以在所述分離的血漿中分離，并且其中所述分離的血漿是被耗竭凝血因子XII的。
3.根據權利要求1-2中的任一項所述的穩定溶液，其中所述鈣的量是>O，5mol/L。
4.根據權利要求1-3中的任一項所述的穩定溶液，其中所述鈣的量是生理水平或者生理水平以上。
5.根據權利要求1-5所述的穩定溶液，其中所述溶液在室溫中穩定>4小時。
6.根據權利要求2-5中的任一項所述的穩定溶液，其中凝血因子XII的耗竭是95% -100%。
7.根據權利要求2-6中的任一項所述的穩定溶液，其中凝血因子XII的耗竭是100%。
8.根據權利要求1-7中的任一項所述的穩定溶液，條件是所述溶液不包括任何鈣螯合劑。
9.根據權利要求1-8中的任一項所述的穩定溶液，條件是在使用時不添加額外的鈣到所述穩定溶液。
10.根據權利要求1-9中的任一項所述的穩定溶液，其中所述血漿是被耗竭血小板的。
11.根據權利要求1-10中的任一項所述的穩定溶液，還包括纖維蛋白原。
12.根據權利要求1-11中的任一項所述的穩定溶液，還包括分離的和沖洗過的紅細胞。
13.根據權利要求1-12中的任一項所述的穩定溶液，所述穩定溶液在室溫穩定至少12小時。
14.根據權利要求1-13中的任一項所述的穩定溶液，其中所述分離的血漿是哺乳動物的血漿。
15.根據權利要求1-14中的任一項所述的穩定溶液，其中所述分離的血漿是人類的血漿。
16.根據權利要求1-13中的任一項所述的穩定溶液，其中所述分離的血漿是禽類的血漿。
17.根據權利要求1-16中的任一項所述的穩定溶液，其中另外的接觸活化因子是被耗竭的。
18.根據權利要求17所述的穩定溶液，其中所述另外的接觸活化因子選自由前激肽釋放酶、HMW激肽原、因子V、因子XI組成的組。
19.根據權利要求1-18中的任一項所述的穩定溶液作為凝血分析的對照材料的用途。
20.一種產生穩定溶液的方法，所述方法包括以下步驟 a)耗竭分離的血漿的因子XII； b)調整鈣水平至0，5mol/L或以上。
21.根據權利要求20所述的方法，其中因子XII的耗竭是通過使用金屬氧化物來進行。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述金屬氧化物是二氧化鈦。
23.根據權利要求20-22中的任一項所述的方法，所述方法還包括耗竭所述血漿中的血小板。
24.根據權利要求20-22中的任一項所述的方法，所述方法還包括添加沖洗過的紅細胞。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述沖洗過的紅細胞是人類的紅細胞。
26.根據權利要求20-25中的任一項所述的方法，其中所述血漿是人類的血漿。
27.根據權利要求20-25中的任一項所述的方法，其中所述血漿是禽類的血漿。
28.—種產生穩定溶液的方法，所述方法包括以下步驟 a)添加分離的人類因子II、VII和X至分離的血漿；和 b)調整游離鈣的水平至彡0,5mole/L。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述分離的血漿是非人類的哺乳動物的血漿。
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述分離的血漿是禽類的血漿。
31.根據權利要求28-29中的任一項所述的方法，還包括耗竭所述非人類的哺乳動物的血漿的至少一種接觸活化因子。
32.根據權利要求1-18中的任一項所述的穩定溶液，所述穩定溶液是可通過根據權利要求20-31中的任一項所述的方法獲得的。
33.一種評價受治療者中凝血系統狀態的方法，所述方法包括 a)在來自所述受治療者的血液樣品中測量所述受治療者的凝血系統的狀態；和 b)分析與根據權利要求1-18中的任一項的穩定溶液相比較的所述受治療者的凝血系統的狀態， 從而評價所述受治療者中的凝血系統狀態。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述受治療者是人類受治療者。
35.根據權利要求33-34中的任一項所述的方法，其中所述凝血系統的狀態是通過選自由PT (凝血酶原時間)、混合試驗、凝血因子分析和凝血彈性掃描法(TEG或者Sonoclot)組成的組的分析來測量的。
36.根據權利要求33-35中的任一項所述的方法，條件是在使用時不添加鈣到所述穩定溶液。
37.一種包含根據權利要求1-18中的任一項所述的穩定溶液的試劑盒。
38.根據權利要求37所述的試劑盒，其中所述穩定溶液以溶液形式或者以凍干的形式提供。
39.根據權利要求37-38中的任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括其用作凝血分析的對照材料的說明。
40.根據權利要求37-39中的任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括其在權利要求33-36中的任一項的方法中的用途的說明。
全文摘要
本發明涉及穩定溶液，所述穩定溶液包括無凝血因子XII并且具有預定量的離子鈣的穩定溶液。所述穩定溶液可以被用作凝血分析的對照材料。進一步地，本文涵蓋用于產生所述穩定溶液的方法，以及用于評價受治療者中凝血系統狀態的方法和試劑盒。
文檔編號G01N33/49GK102753189SQ201180008108
公開日2012年10月24日 申請日期2011年2月8日 優先權日2010年2月8日
發明者托馬斯·林達爾, 拉斯·法科薩爾夫 申請人:諾帝克哈莫斯塔西斯公司