與天然變性蛋白質結合的化合物及其篩選方法

專利名稱：與天然變性蛋白質結合的化合物及其篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種與天然變性蛋白質的不規則序列區(以下有時也表述為不規則區域)相結合的化合物。詳細地說，本發明涉及一種化合物，該化合物通過與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合、利用該結合使不規則序列結構域的結構改變、從而導致不能與在天然變性蛋白質的自然狀態下應該結合的協同蛋白相結合，由此可以阻礙在自然狀態下發生的生物體反應。另外，本發明還涉及與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物的篩選方法等。進而，本發明還涉及含有與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物的藥物。
背景技術：
在此之前，提到在生物體內發揮功能的蛋白質時，則是說形成特定的立體結構、以該結構為基礎發揮特異的功能。近年來，與上述普通的想法相反，已知在生物體內存在很多 不形成立體結構的蛋白質或蛋白質的一部分不形成立體結構的蛋白質。在蛋白質中，不形成立體結構的氨基酸序列部分高達數百殘基也是很常見的。這種序列部分被稱作“原本不規則”的區域，蛋白質分子的整體由不規則區域構成或者即便是部分具有不規則區域者均稱作天然變性蛋白質。在美國的生化學者Christian B. Anfinsen的研究以來,建立了 “I級結構決定高級結構”這一想法。這被稱作“安芬森信條(Anfinsen' s dogma)”,描繪了 I級結構一特有的立體結構一蛋白質的特有功能這一圖式。反過來說，也具有缺乏特有立體結構的(=變性狀態)蛋白質一沒有功能的(變性)蛋白質這一默契。然而，這10年來已知存在具有很長的不規則區域的蛋白質IDP(天然變性蛋白質)(Intrinsically disordered Protein)。IDP 具有以下特征:(I)大量的IDP存在于真核細胞中(特別是多在細胞核內)、原核細胞中很少；(2) IDP富含大量的親水性殘基、疏水性區域少；(3)很多IDP與如轉錄因子、CBP等共激活因子、細胞內信號傳遞蛋白質、p53等細胞周期的控制因子、細胞膜融合因子，RNA結合蛋白質等其他蛋白質相結合，發揮功能；(4)這些蛋白質的功能與不規則區域密切相關。之前的研究中顯示，IDP普遍存在于幾乎所有的生物中，與所有的生物體功能相關。據說，真核細胞中形成的蛋白質的約20%為IDP、不規則區域也達到50 500個殘基。IDP通常具有沒有高級結構的不規則序列，但當IDP與標靶蛋白結合時，則誘發結構、IDP發 車功能。通常來說，很多轉錄因子中具有不規則區域。轉錄因子是控制在基因表達中的轉錄過程的開始或抑制的蛋白質，根據與受到控制的基因的組合不同，存在多種轉錄因子。據說人基因組中存在1000種以上的轉錄因子的基因。使用DIS0DRED程序(IDP預測程序)由氨基酸序列進行IDP預測時，預測到在人轉錄因子中平均來說多達全長一半(49%)的部分為不規則區域。
一直以來，天然變性蛋白質在生物體內大量存在是事實，而且據說在與信號傳遞系統或基因表達控制等有關的重要的蛋白質中特別多。然而，另一方面，備受關注也是最近才開始的事情，對天然變性蛋白質仍有很多不清楚的方面。本身不形成立體結構或者具有不形成結構的部分的蛋白質事實上在很久以前就是已知的。但是，還從未著眼于對不規則序列進行篩選。非專利文獻I :生物物理49(1)，004-010 (2009)非專利文獻2 Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug24 ； 101 (34) :12682-7.

發明內容
以轉錄因子為首、對多個具有不規則序列的蛋白質進行了調整蛋白質·蛋白質相互作用的低分子化合物的篩選，但獲得具有充分活性的低分子化合物幾乎是不可能的。因 而，本發明的目的在于提供用于獲得天然變性蛋白質的活性調節劑、或天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法。另外，本發明的目的還在于提供利用該篩選方法獲得的化合物、含有該化合物的藥物等。當重疊在結構域和不規則區域上時，通過生物化學方法搞清楚的功能部位的位置在幾乎所有的情況下并非位于結構域、而是位于不規則區域上。這表明蛋白質的不規則區域承擔著生物學上重要的功能。因此可以認為控制IDP是作為各種疾病治療藥的有吸引力的技術。這些物質作為疾病治療藥極為有用，由于不規則序列具有結構域結構，所以通過選出選擇性地與結構域相結合的物質，有可能找到具有選擇性、沒有副作用的理想藥物。另夕卜，如上所述，由于不規則序列主要存在于細胞內，所以變得能夠控制通過之前的藥物無法控制的細胞內的蛋白質/蛋白質相互作用，還能創造出所謂的疑難雜癥的治療藥。因此，本發明人進行了深入研究，結果發現在天然變性蛋白質的活性調節劑、或天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選中，通過著眼于天然變性蛋白質的不規則序列中的相互作用進行篩選，特別是通過使用具有擬肽骨架、具有肽側鏈或與其相類似側鏈的擬肽化合物作為待測物質，能夠高效地篩選出調節天然變性蛋白質活性的化合物。在具有擬肽骨架、具有肽側鏈或與其相類似側鏈的擬肽化合物與天然變性蛋白質的不規則區域發揮相互作用時，認為這些不規則區域高效地變為近似于無規卷曲的變性狀態。如果這樣，則會產生為什么在生物體內不會相互會合并凝集、或者為什么不會被各種蛋白酶(分解酶)分解的疑問。但是，雖然表面上看這與以往普通的想法是相反的，但這也許是天然變性蛋白質的最大特性。S卩，本發明提供下述方式的篩選方法、化合物、天然變性蛋白質的活性調節劑、天然變性蛋白質的活性調節方法及藥物。[I] 一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質的活性調節劑的篩選方法，其包括(I)使該蛋白質或該蛋白質的不規則序列區與待測物質相接觸；(2)對該蛋白質的不規則序列區和待測物質的相互作用進行檢測。[2] 一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法，其包括(I)使該蛋白質或該蛋白質的不規則序列區與待測物質相接觸；(2)對該蛋白質的不規則序列區和待測物質的相互作用進行檢測。[3] 一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法，其包括(I)使該蛋白質或該蛋白質的不規則序列區、該協同蛋白和待測物質相接觸；(2)對該蛋白質的不規則序列區和待測物質的相互作用進行檢測。[4] 一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法，其包括·(I)使該蛋白質或該蛋白質的不規則序列區、該協同蛋白和待測物質相接觸；(2)對該蛋白質的不規則序列區和該協同蛋白的相互作用進行檢測。[5]如[I] [4]中任一項所述的篩選方法，其中，待測物質為擬肽化合物。[6]如[I] [5]中任一項所述的篩選方法，其中，天然變性蛋白質為轉錄調節因子、信號傳遞系統的蛋白質、細胞內蛋白質。[7]如[I] [6]中任一項所述的篩選方法，其中，檢測相互作用利用雙雜交法(Y2H)、免疫共沉淀法、蛋白質芯片法、立體結構解析、Farwestern印跡法、交聯(crosslinking)法、突光粹滅法進行。[8] 一種化合物，是利用[I] [7]中任一項所述的篩選方法獲得的。[9] 一種化合物，其與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合。[10] 一種天然變性蛋白質的活性調節劑，其含有與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物。[11] 一種調節天然變性蛋白質活性的方法，其使用與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物。[12] 一種藥物，其含有與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物。


[圖I]表示利用免疫沉淀法將ICG-001和CBP拉下(pulldown)時的數據。由該實驗可知，ICG-001與CBP相結合。[圖2]為ICG-001與CBP的N末端相結合的實驗結果。圖2的實驗數據顯示在利用免疫沉淀法拉下在大腸桿菌中表達的CBP(I-Ill)和β-聯蛋白時，由于ICG-001的添力口、CBP(I-Ill)離去，由此可知不會結合在與CBP相似性很高的Ρ300上。[圖3]為表示CBP的結構的圖。圈的部分為規則序列，線的部分為不規則序列。(P. Ε. Wright, Nature Review2009)[圖4]表示以在大腸桿菌中表達的CBP(I-Ill)為樣品進行NMR分析，獲得X軸表示C-13數據、Y軸表示N-15數據的2D光譜結果。[圖5]表示對使在大腸桿菌中表達的CBP(I-Ill)與5μ M的ICG-001共存的樣品進行NMR分析，獲得X軸表示C-13數據、Y軸表示Ν-15數據的2D光譜結果。[圖6]表示對使在大腸桿菌中表達的CBP(I-Ill)與15μΜ的ICG-001共存的樣品進行NMR分析，獲得X軸表示C-13數據、Y軸表示Ν-15數據的2D光譜結果。
具體實施例方式以下對本發明詳細地進行說明。本說明書中的基因操作技術只要無特別說明，則可根據《Molecular Cloning》(Sambrook, J 等，ColdSpring Harbor Laboratory 出版，1989年)等公知技術進行實施，蛋白質操作技術只要無特別說明，則可根據《蛋白質實驗規程》(秀潤社，1997年)等公知技術進行實施。天然變性蛋白質只要是如上所述具有不規則序列的蛋白質，則可以是任何蛋白質，既可以是蛋白質整體為不規則序列的蛋白質，也可以是其一部分、例如N末端區域、C末端區域、中間區域含有不規則序列的蛋白質。另外，還可以是它們的組合。作為它們的例子，可舉出具有不規則序列的轉錄調節因子、信號傳遞系統的蛋白質或其他細胞內功能蛋白質。具體地說，可舉出CBP、c-Myc、Fos、SRF、EGR-4、c-Myb、TBX3等僅由DNA結合結構域和不規則序列構成的轉錄調節因子，進而還可以舉出p53、IRF-3、E2F-1、Ets-I、HIF-I α、AR、NF-ATl、SREBP-I等具有DNA結合結構域、其他結構域、不規則序列的轉錄調節因子等。協同蛋白包含與上述天然變性蛋白質發生相互作用的全部蛋白質。例如在天然變·性蛋白質為 CBP 時，如 HIF-l、SYT、p53、p73、Mdm2、Stat-2、TAL-l、Ets-l、TBP、NF-kB、HNF-4、CREB, SREBP, c_JUN、c_Myb、ATF, BRCA-U Sapl、NF-E2、TFIIB、P/CAF、MyoD, c_Fos、Ets-UC/EBP、E2F、GATA-I、MI、SYT, p53、Smad, SRC-I、p/CIP、YYl 是顯示相互作用的協同蛋白。當在篩選中使用天然變性蛋白質時，其可以是自然存在的狀態、也可以將不規則部分切出后使用。不規則部分只要是能夠檢測到與待測物質的相互作用，則可以是任何形態，也可以結合有具有不規則序列部分和結構域結構的部分。作為待測物質，可舉出低分子化合物、肽、蛋白質、擬肽化合物、核酸、核酸類似化合物、膽固醇類或維甲酸、前列腺素等生理活性物質或它們的衍生物或類似物。優選擬肽化合物，更具體地可舉出α螺旋模擬化合物、β折疊模擬化合物、β轉角模擬化合物。擬肽化合物是指例如其骨架具有與α螺旋、β折疊及/或β轉角非常近似的空間結構，其側鏈在與肽非常近似的方向上突出，其側鏈優選是具有氨基酸側鏈或類似結構的側鏈。擬肽化合物的骨架并不具有如肽鍵那樣易于被分解的結構，可以具有類似的藥效團，例如可舉出在 W092/13878、W094/03494、W095/00534、W095/25120、W096/30035、W096/30396、W098/05333、W097/15577、W098/49168、W001/00210, W097/15589、W002/092010, W02003/030907, W02003/031448, W02004/093828, W02005/116032、W02004/108731, W02006/101858, W02007/056513, W02007/056593, W02007/062243、W02007/139346, W02009/051397, W02009/051398, W02009/051399, W02010/027114,W02010/120112公報中給出的骨架。除此之外，具有類似骨架的化合物作為待測物質也優選。本發明中，天然變性蛋白質的活性調節劑的篩選如下進行(1)使天然變性蛋白質或該蛋白質的不規則序列區與待測物質相接觸；(2)對該蛋白質的不規則序列區與待測物質的相互作用(即分子間結合)進行檢測。另外，本發明中天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選如下進行(1)使天然變性蛋白質或該蛋白質的不規則序列區與待測物質相接觸，或者使天然變性蛋白質或該蛋白質的不規則序列區與其協同蛋白與待測物質相接觸；(2)對天然變性蛋白質的不規則序列區與待測物質的相互作用(即分子間結合)或天然變性蛋白質的不規則序列區與協同蛋白的相互作用(即分子間結合)進行檢測。對天然變性蛋白質的不規則序列區與待測物質的相互作用進行檢測的方法只要是能夠檢測不規則序列區與待測物質的相互作用的方法，則無特別限定。另外，還可以檢測待測物質對天然變性蛋白質和與其發生相互作用的協同蛋白的相互作用造成的影響。無論如何，優選并非僅對相互作用進行檢測，而是著眼于天然變性蛋白質的不規則區域對相互作用進行檢測。作為它們的檢測方法，例如可舉出雙雜交法(Y2H)、免疫共沉淀法、蛋白質芯片法、立體結構解析、Farwestern印跡法、交聯(crosslinking)法、突光粹滅法等。這些方法是公知的方法，雙雜交法(Y2H)為利用2個分子發生結合、才顯示活性的方法。舉出酵母雙雜交系的一個例子，說明雙雜交系統的原理。酵母雙雜交系利用了擁有2個可分離功能性結構域的多種多樣的真核生物轉錄因子的特征。2個結構域中的I個是特異性識別順式作用元件并結合的DNA結合結構域(有時簡稱為“DBD”)，另I個是活化 轉錄的轉錄活化結構域(有時簡稱為“AD”)。在該雙雜交系統中，在酵母內作為融合蛋白表達含有DNA結合結構域(GAL4bd或IexA)和感興趣的蛋白質“A”的所謂誘餌蛋白(Baitprotein)。同時，在相同酵母細胞內還表達含有DNA活化結構域(GAL4ad或VP16)和蛋白質“B”的狩獵蛋白(Fish protein) 0誘餌蛋白與狩獵蛋白發生相互作用時，這些融合蛋白的DNA結合結構域和轉錄活化結構域變得接近，結果所產生的蛋白質復合體誘導報告基因(例如HIS3或IacZ)的表達。該表達通過在不含組氨酸的選擇性培養基上的該酵母細胞的培養或者IacZ基因的活化，可以容易地進行監測。例如，編碼未知狩獵蛋白的DNA序列可通過將對應的質粒分離、接著進行堿基序列分析來容易地鑒定。需要說明的是，在雙雜交系統中，有時將作為試驗對象一方的蛋白質、成為探索的靶標的蛋白質稱作靶標蛋白、獵物(prey)蛋白質或狩獵(fish)蛋白等,將成為革巴標蛋白對象的蛋白質稱作誘館(bait)蛋白。進而，還開發了雙雜交系統的多個改變體系。為了對生物學體系中可見的各種相互作用進行鑒定、檢測和分析，認為必須使用不同的雙雜交系統，實際上其他的雙雜交技術也有所發展，也可在不同的生物體及/或不同的細胞區室內研究蛋白質-蛋白質相互作用。雙雜交系統可通過分子生物學方法在生物體內迅速進行從準備欲確認相互作用的受試蛋白至蛋白質相互作用的篩選階段，可以省去在保持感興趣的蛋白質的生物活性的同時要進行分離/純化、進行受試的麻煩。而且，雙雜交系統在能夠簡單地分離編碼相互作用對手的對應的核酸序列方面也優選。即，認為在檢測蛋白質相互作用時，利用雙雜交系統在迅速性、容易性、成本等方面均有利。本發明中，以天然變性蛋白質或其不規則序列區作為靶標蛋白(狩獵蛋白)、以天然變性蛋白質的協同蛋白組作為誘餌蛋白，可以從待測物質(例如擬肽化合物)中篩選調節天然變性蛋白質的活性的化合物、或者調節天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合活性的化合物。免疫共沉淀法是利用免疫沉淀法將蛋白質復合體回收的方法。進一步擴展該方法，則產生被稱作“下拉分析”(pull down assay)的方法，該方法代替抗原抗體反應使用標簽的特異結合性。通過在這些方法中組合質量分析，則可以明確與已知蛋白質發揮相互作用的未知蛋白質的本來面目。本發明中，通過將特異地結合于天然變性蛋白質或其不規則序列區的待測物質(例如擬肽化合物)回收，確定該化合物的結構或者鑒定該化合物，可以篩選本申請的特異性調節天然變性蛋白質活性的化合物。另外，還可用于特異性阻礙天然變性蛋白質與顯示相互作用的協同蛋白的結合的化合物篩選中。關于免疫沉淀法的具體方法，可參照《Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第 2 版》(Maniatis, T.等編(1989)Cold Spring Harbor 出版)等。簡單地說，可以利用使用能夠與經鑒定的多肽的抗原性結構域相結合的抗體、優選FLAG(注冊商標)單克隆抗體、Ml、M2或M5的免疫沉淀試驗對該蛋白質進行檢測。如上所述，利用經鑒定的多肽將細胞轉化，使其在培養液中增殖，接著使其溶解，獲得細胞所產生的標記蛋白質樣物質溶液。將該溶液與單克隆抗體溶液孵育，通過沉降研究形成在細胞中的經鑒定的多肽標記的蛋白質與抗體的所有復合體。然后，從沉降物中將蛋白質/抗體復合體分離。接著，利用常規的分析方法、例如在蛋白質/抗體復合體的解離條件下使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光間接拍攝法確認標記蛋白質的存在。另外，還可使用質量分析或HPLC鑒定與該復合體相結合的待測化合物或擬肽化合物。蛋白質芯片法是使用表面等離子體共振技術等對相互作用進行檢測的方法的方法。不僅可對平衡狀態進行解析，還可進行結合·解離的動力學解析。 作為使用的測定方法，除了表面等離子體共振技術之外，例如還可舉出消散場分子成像法、熒光成像分析法、固相酶免疫分析法、熒光偏振消偏法及熒光相關光譜法等。表面等離子體共振技術是指通過在金屬/液體界面發生相互作用的分子激發表面等離子體，利用反射光的強度變化對其進行測定的方法(Cullen，D. C.，等.，Biosensors, 3 (4) ,211-225(1987-88))。使用該方法進行蛋白質-分子間相互作用的測定或解析時，C末端標簽化蛋白質有必要利用上述方法進行固相化，但靶標分子不需要進行標記化。作為用于將C末端標簽化蛋白質固相化的底座，使用在玻璃等透明底座上形成有金、銀、鉬等金屬薄膜的底座。作為透明底座只要是通常表面等離子體共振裝置用中使用的底座即可，通常由相對于激光為透明的材料(例如玻璃)構成，其厚度使用0. I 5_左右。另外，優選金屬薄膜的膜厚為100 ~ 2000人左右。作為這種表面等離子體共振裝置用固相底座也可以使用市售品。c末端標簽化蛋白質在上述底座上的固相化可利用上述方法進行。本方法中作為使靶標分子與C末端標簽化蛋白質接觸的方法，只要是兩分子以對于相互作用來說充分的程度進行接觸的方法，則可以是任何方法，優選可使用使固相化的C末端蛋白質與以適當濃度在生物化學中通常使用的緩沖液中溶解有靶標分子的溶液相接觸的方法。這些過程可通過市售的表面等離子體共振裝置、例如BIAcore2000 (PharmaciaBiosensor公司制)進行。使兩分子接觸后，使用其本身已知的表面等離子體共振裝置，通過測定各個反射光的相對強度的時間變化，從而可以解析固相化后的C末端標簽化蛋白質與革巴標分子的相互作用。該方法中，作為同時進行多個解析的方法，例如使用在上述表面等離子體共振裝置中使用的底座上使每個蛋白有一個地址地固相化多個C末端標簽化蛋白質的方法；或者使多種靶標分子與I種固相化后的C末端標簽化蛋白質相接觸的方法等。消散場分子成像法是Funatsu, T.,等·，Nature, 374, 555-559 (1995)等中記載的方法，為使第2分子作為溶液接觸于固相化在玻璃等透明體上的分子，以向其產生消散場的角度照射激光等光源，利用檢測器對瞬逝光進行測定或解析的方法。這些操作可以使用其本身已知的消散場熒光顯微鏡裝置進行。使用該方法進行蛋白質-分子間相互作用的測定或解析時，有必要利用上述方法將C末端標簽化蛋白質和靶標分子的任一者固相化。靶標分子在固相化時，不需要進行標記，但以未固相化的狀態進行使用時，有必要利用上述標記物質進行標記化。
作為用于將C末端標簽化蛋白質或靶標分子固相化的底座，使用玻璃等材質的底座，優選使用石英玻璃。另外，為了防止激光的散射等，優選對表面進行超聲波洗滌。本方法中，作為用于使未被固相化的C末端標簽化蛋白質或標記化靶標分子與固相化分子相接觸的方法，只要是兩分子以對于相互作用來說充分的程度進行接觸的方法，則可以是任何方法，優選制作以適當的濃度在生物化學中通常使用的緩沖液中溶解有未經固相化的C末端標簽化蛋白質或標記化靶標分子的溶液，將其滴加在固相表面上的方法。使兩分子接觸后，使用CCD相機等檢測器對通過消散場照明所激發的熒光進行測定，從而可以鑒定與經固相化的分子發生相互作用的分子。該方法中，作為同時進行多個解析的方法，例如使用在上述底座上使每個蛋白有一個地址地固相化多個C末端標簽化蛋白質或標記化靶標分子的方法。熒光成像分析法是使標記化分子與經固相化的分子相接觸、通過兩分子的相互作用由停留在經固相化的分子上的標記化分子發出熒光，使用市售的熒光成像分析儀對所發出的熒光進行測定或解析的方法。使用該方法進行蛋白質-分子間相互作用的測定或解析時，C末端標簽化蛋白質或靶標分子的任一者有必要利用上述方法進行固相化。靶標分子在經固相化后使用時，可利用經標記者、也可利用未經標記者。另外，以未固相化的方式進行使用時，有必要利用上述標記物質進行標記化。C末端標簽化蛋白質可以利用介由標簽部經固相化者，也可利用通過標簽部以外的部分經固相化者。作為用于將C末端標簽化蛋白質或靶標分子固相化的底座，還可使用通常在固定化蛋白質或核酸等中使用的硝基纖維素膜或尼龍膜或者塑料制微孔板等。本方法中，作為使標記化靶標分子或C末端標簽化蛋白質與固相化分子相接觸的方法，只要是兩分子以對于相互作用來說充分的程度進行接觸的方法，則可以是任何方法，優選制作以適當的濃度在生物化學中通常使用的緩沖液中溶解有標記化靶標分子或C末端標簽化蛋白質的溶液，將其與固相表面相接觸的方法。使兩分子接觸后，優選進行利用相同緩沖液等對過量存在的標記化靶標分子或C末端標簽化蛋白質進行洗滌的工序，通過使用市售的成像分析儀對由停留在固相上的靶標分子或C末端標簽化蛋白質的標記物質所發出的熒光信號或由經固相化的標記化分子所發出的熒光與停留在固相上的標記化分子所發出的熒光混合而成的信號進行測定或解析，可以鑒定與經固相化的分子發生相互作用的分子。本發明中，作為同時進行多個解析的方法，例如使用在上述固相表面上使每個蛋白有一個地址地固相化多個C末端標簽化蛋白質或者標記化或非標記化的靶標分子的方法；或者使未固相化的多種C末端標簽化蛋白質或標記化靶標分子與I種C末端標簽化蛋白質或者標記化或非標記化革巴標分子相接觸的方法等。使多種C末端標簽化蛋白質或標記化靶標分子接觸時，利用緩沖液的濃度差等使停留在固相上的該分子解離并獲得，利用已知的方法對其進行分析，從而可以鑒定。固相酶免疫分析法(EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISA) Crowther,J. R.,Methods in Molecular Biology, 42 (1995))是使含有抗體的溶液與固定化在固相上的抗原相接觸，通過兩分子的相互作用(抗原抗體反應)，使用市售的檢測器(ELISA讀取器)對由與停留在經固相化的抗原上的抗體特異性結合的標記化分子(IgG等)所發出的熒光、或者由以標記化分子為底物的色素所發出的信號進行測定或解析的方法。使用該方法進行蛋白質-分子間相互作用的測定或解析時，有必要利用上述方法將成為抗原的C末端標簽化蛋白質固相化。另外，成為抗體的靶標分子有必要利用上述標記物質進行標記化。作為用于將成為抗原的C末端標簽化蛋白質固相化的底座，還可使用通常ELISA
所用的塑料制微孔板等。本方法中，作為使成為抗體的標記化靶標分子與固相分子相接觸的方法，只要是兩分子以對于相互作用來說充分的程度進行接觸的方法，則可以是任何方法，優選制作以適當的濃度在生物化學中通常使用的緩沖液中溶解有標記化靶標分子的溶液，將其注入到微孔板中的方法。使兩分子接觸后，優選進行利用相同緩沖液等對過量存在的未結合于固相化分子的標記化分子進行洗滌的工序，通過使用市售的ELISA讀取器對由停留在固相上的標記分子所發出的熒光進行測定或解析，可以鑒定與經固相化的抗原分子發生相互作用的分子。本方法中，作為同時進行多個解析的方法，例如使用在上述微孔板的各個孔內分別固相化不同的多個標記化靶標分子的方法。熒光偏振光法(Perran,J.，等·，J. Phys. Rad.，I，390-401 (1926))是利用通過熒光偏振光激發的突光分子在處于激發狀態之間、保持穩定狀態時，在同一偏振光平面上放射熒光；但一旦經激發的分子在激發狀態下進行轉動布朗運動等時，則所放射的熒光與激發光處于不同平面的方法。分子運動受到其大小的影響，當熒光分子為高分子時，幾乎沒有激發狀態之間的分子運動、放射光處于保持偏振光的狀態，而為低分子的熒光分子時，由于運動速度快，因而消除了放射光的偏振光。因此，通過在最初的平面和與其垂直的平面上測定由通過平面偏振光激發的熒光分子放射的熒光的強度，由兩平面的熒光強度的比例可以獲得該分子的運動性及與其存在狀態有關的信息。通過該方法，即便是雜質對其也沒有影響，可以追蹤與經熒光標簽化的分子發生相互作用的靶標分子的行為。這是由于僅在經熒光標簽化的分子與靶標分子發生相互作用時，該行為作為偏振光度的變化能夠測定。作為用于進行該方法的裝置，例如市場有售BECON (Panyera公司制)等，本方法也可使用這些裝置進行。使用該方法進行蛋白質-分子間相互作用的測定或解析時，C末端標簽化蛋白質和靶標分子的任一者均需要以溶液的形式提供。靶標分子無需進行標記。另外，與想要研究相互作用的C末端標簽化蛋白質相比、分子量明顯小的分子由于對C末端標簽化蛋白質的布朗運動沒有影響，因而在本發明中并不適合。本方法中，作為使靶標分子與C末端標簽化蛋白質相接觸的方法，只要是兩分子以對于相互作用來說充分的程度進行接觸的方法，則可以是任何方法，優選通過向市售的熒光偏振消偏裝置的測定用孔中投入以適當的濃度在生物化學中通常使用的緩沖液中溶解有C末端標簽化蛋白質的溶液，進而投入以適當的濃度在相同緩沖液中溶解有靶標分子的溶液的方法來進行。由于認為本方法中測定的與C末端標簽化蛋白質及靶標分子之間的相互作用并非必須如抗原抗體方法那樣特異性很高，因而為了檢測最佳的組合，將相互作用的程度數值化是有效的。作為表示相互作用程度的指標，例如可以使用相對于一定濃度的C末端標簽化蛋白質賦予最大熒光偏振光度的最小靶標物濃度的值。該方法中，作為同時進行多個解析的方法，例如使用向上述熒光偏振消偏法測定裝置的各測定用孔中分別投入不同的多個C末端標簽化蛋白質、向其中投入特定的靶標分子溶液或者特定的C末端標簽化蛋白質，向各孔中投入相互間不同的多種靶標分子溶液的方法。突光相關光譜法(FluorescenceCorrelation Spectroscopy (FCS) Eigen, Μ., 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，91，5740-5747 (1994))是在共聚焦激光顯微鏡等下測定粒子的流動速度或擴散率、容積收縮等的方法，本發明中，通過利用C末端標簽化蛋白質與靶標分子之間的相互作用，測定原來的標簽化分子I分子的平移布朗運動的變化，從而可測定發生相互作用的分子。具體地說，試樣粒子被激發光激發，在試樣液容積的一部分中放射突光，測定該放射光，獲得光子比例。該值隨著在特定時間內觀測的存在于空間容積中的粒子數一起變化。上述各種參數可以使用自相關函數由該信號的變動求得。用于進行該FCS的裝置也由CarlZeiss(Zeiss)公司等出售，本方法中也可使用這些裝置進行解析。使用該方法進行蛋白質-分子間相互作用的測定或解析時，C末端標簽化蛋白質和靶標分子的任一者均需要以溶液的形式提供。靶標分子無需進行標記。另外，與想要研究相互作用的C末端標簽化蛋白質相比，分子量明顯小的分子由于對C末端標簽化蛋白質的布朗運動沒有影響，因而在本發明中并不適合。本方法中，作為使靶標分子與C末端標簽化蛋白質相接觸的方法，只要是兩分子以對于相互作用來說充分的程度進行接觸的方法，則可以是任何方法，優選通過向市售的FCS裝置的測定用孔中投入以適當的濃度在生物化學中通常使用的緩沖液中溶解有C末端標簽化蛋白質的溶液，進而投入以適當的濃度在相同緩沖液中溶解有靶標分子的溶液的方法進行。該方法中，作為同時進行多個解析的方法，例如使用向上述FCS裝置的各測定用孔中分別投入不同的多個C末端標簽化蛋白質、向其中投入特定的靶標分子溶液或者特定的C末端標簽化蛋白質，向各孔中投入相互間不同的多種靶標分子溶液的方法。本申請發明中，為了進行天然變性蛋白質或其不規則序列區與待測物質的分子間相互作用的測定，可以使用上述方法。立體結構解析在利用X射線衍射或NMR等明確復合體的具體結構時，通過在天然變性蛋白質或其不規則序列區和待測物質的存在下制作結晶、進行X射線解析，可以對其結合進行解析。另外，通過對天然變性蛋白質或其不規則序列區和待測物質存在的溶液測定NMR，可以對該不規則序列區與待測物質的結合進行解析。
交聯(crosslinking)法通過利用低分子化合物將復合體的蛋白質分子間交聯、固定，在天然變性蛋白質或其不規則序列區和待測物質的存在下進行交聯，由此可以對不規則序列區與待測物質的相互作用進行檢測。檢測天然變性蛋白質的不規則序列區與待測物質的相互作用時，或者檢測到天然變性蛋白質的不規則序列區與協同蛋白的相互作用降低時，用于該測定的待測物質被鑒定為調節天然變性蛋白質的活性的化合物、或調節天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合活性的化合物。這樣，通過本發明的篩選方法可獲得天然變性蛋白質的活性調節劑、或者天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑。另外，本發明還提供含有通過該篩選方法獲得的化合物的藥物。結合于天然變性蛋白質的不規則序列區的化合物(例如利用本發明的篩選方法獲得的化合物)作為天然變性蛋白質的活性調節劑有效，該化合物根據其類型，可以使用在制劑化中通常使用的藥理學上允許的載體、賦形劑及/或其他添加劑以藥物組合物的形·式進行制備。作為給藥方式，例如可舉出片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、細粒劑、散劑或口服液劑等口服給藥，或者靜脈注射(包含點滴)、肌肉注射或皮下注射等的注射劑，栓劑、經皮給藥劑或經粘膜給藥劑等非口服給藥。特別是為在胃中被消化的肽時，優選靜脈注射等非口服給藥。在用于口服給藥的固體藥物組合物中，可以混合I種或多種的活性物質和至少I種惰性的稀釋劑，例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纖維素、羥丙基纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或偏硅鋁酸鎂等。上述組合物可以根據常規方法含有惰性稀釋劑以外的添加劑、例如潤滑劑、崩解劑、穩定劑或溶解劑或助溶劑等。片劑或丸劑還可根據需要被糖衣或胃溶性或腸溶性物質等膜包覆。用于口服的液體藥物組合物例如可包括乳濁劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑或酏劑，可含有通常使用的惰性稀釋劑，例如純化水或乙醇。上述組合物還可含有惰性稀釋劑以外的添加劑、例如濕潤劑、混懸劑、甜味劑、芳香劑或防腐劑。作為用于非口服的注射劑，可以包括無菌的水性或非水性的溶液劑、混懸劑或乳濁劑。水溶性的溶液劑、混懸劑中作為稀釋劑例如可以含有注射用蒸餾水或生理用鹽水等。作為非水溶性的溶液劑或混懸劑的稀釋劑，例如可含有丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)、醇類(例如乙醇)或聚山梨醇酯80等。上述組合物還可進一步含有濕潤劑、乳化齊U、分散劑、穩定劑、溶解劑或助溶劑或者防腐劑等。上述組合物例如可以利用通過除菌濾器的過濾、殺菌劑的配合或照射進行無菌化。另外，制造無菌的固體組合物進行使用時，還可溶解在無菌水或其他無菌用注射用介質中進行使用。給藥量可考慮有效成分、即通過本發明的篩選方法獲得的物質的活性強弱、癥狀、給藥對象的年齡或性別等適當確定。實施例以下舉出實施例說明本發明，但本發明并非限定于這些實施例進行解釋。實施例I作為本發明的確實的證據，以下示出已經發表的論文(Proc Natl Acad Sci U SA. 2004 Aug 24 ； 101 (34) =12682-7)的實驗概要。該論文中雖未公開本發明的發明思想，但該論文所記載的內容構成了本說明書。該論文中僅給出了作為擬肽化合物的ICG-OOl僅與CBP相結合、進而與CBP的N末端序列相結合，但不與p300結合。但是，清楚的是其證明了本發明的技術思想。將ICG-001示于化學式1，將對ICG-001進行生物素化的產物示于化學式2(ICG-002)。將使用這些物質、利用免疫沉淀法進行分析的結果示于圖I。將SW480細胞(來自人結腸癌的細胞株)的核抽提物與在鏈霉親和素瓊脂糖微球上結合有ICG-002的產物進行孵育的結果作為條帶I。用ICG-001拉下的結果為條帶2。
權利要求
1.一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質的活性調節劑的篩選方法，其包括 (1)使所述蛋白質或所述蛋白質的不規則序列區與待測物質相接觸； (2)對所述蛋白質的不規則序列區和待測物質的相互作用進行檢測。
2.一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法，其包括 (1)使所述蛋白質或所述蛋白質的不規則序列區與待測物質相接觸； (2)對所述蛋白質的不規則序列區和待測物質的相互作用進行檢測。
3.一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法，其包括 (1)使所述蛋白質或所述蛋白質的不規則序列區、所述協同蛋白和待測物質相接觸； (2)對所述蛋白質的不規則序列區和待測物質的相互作用進行檢測。
4.一種活性調節劑的篩選方法，其為天然變性蛋白質與其協同蛋白的結合的活性調節劑的篩選方法，其包括 (1)使所述蛋白質或所述蛋白質的不規則序列區、所述協同蛋白和待測物質相接觸； (2)對所述蛋白質的不規則序列區和所述協同蛋白的相互作用進行檢測。
5.如權利要求I 4中任一項所述的篩選方法，其中，待測物質為擬肽化合物。
6.如權利要求I 5中任一項所述的篩選方法，其中，天然變性蛋白質為轉錄調節因子、信號傳遞系統的蛋白質、細胞內蛋白質。
7.如權利要求I所述的篩選方法，其中，檢測相互作用利用雙雜交法(Y2H)、免疫共沉淀法、蛋白質芯片法、立體結構解析、Farwestern印跡法、交聯(crosslinking)法、突光粹滅法進行。
8.一種化合物，是利用權利要求I 7中任一項所述的篩選方法獲得的。
9.一種化合物，其與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合。
10.一種天然變性蛋白質的活性調節劑，其含有與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物。
11.一種調節天然變性蛋白質活性的方法，其使用與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物。
12.一種藥物，其含有與天然變性蛋白質的不規則序列區相結合的化合物。
全文摘要
對于以轉錄因子為首的具有多個不規則序列的蛋白質進行了調整蛋白質·蛋白質相互作用的低分子化合物的篩選，但幾乎無法獲得具有充分活性的低分子化合物。本發明人發現在調整天然變性蛋白質與協同蛋白的相互作用的蛋白質的篩選中，通過著眼于不規則序列進行篩選、進而從具有擬肽骨架且具有肽側鏈或與其相類似側鏈的擬肽化合物中選擇候選化合物，可以高效地選擇調整天然變性蛋白質活性的化合物，進而完成了本發明。
文檔編號G01N33/50GK102906566SQ201180008060
公開日2013年1月30日 申請日期2011年2月2日 優先權日2010年2月3日
發明者小路弘行 申請人:株式會社棱鏡生物實驗室