風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙的制作方法

專利名稱：風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型是涉及生物應用技術領域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙
背景技術：
風疹是一種由風疹病毒引起的通過空氣傳播的急性傳染病，可通過胎盤進入胎兒體內，引起胎兒畸形。而且孕婦感染風疹病毒的時間越早，致畸的可能性越大。血清學研究表明，感染過風疹病毒的育齡婦女即使再被感染，懷孕后也不會對胎兒造成危害。但是約有 10%的育齡婦女屬于風疹易感者，她們在懷孕的頭3個月內如果是初次感染風疹病毒，胎兒致畸率高達80%以上。世界上許多發達國家已經將風疹感染的檢查列為孕期常規檢查項目，在優生優育方面發揮著重要作用。目前對風疹病毒檢測的主要方法是風疹病毒特異性抗體檢測。檢測風疹病毒IgM 判定是否為現癥感染，檢測IgG判定是否曾經感染過。檢測兩種抗體有利于對被檢對象的進行全面的判定，指導優生優育。目前風疹病毒抗體的檢測方法主要是ELISA等檢測方法。 在膠體金的檢測方法中，有單獨檢測風疹病毒IgM或IgG的報道，但用膠體金類免疫層析技術同時檢測風疹病毒IgM和IgG抗體的檢測試紙尚未有相關報道。和用兩種試劑分別檢測 IgM和IgG抗體相比，同時檢測IgM和IgG抗體能減少檢測人員的工作量，節約成本；同時減少采血量，減少患者的痛苦。免疫層析膠體金技術是新型的診斷技術，在抗體檢測方面已得到較為廣泛運用， 基本原理如下利用膠體金標記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應的配對抗原或抗體，檢測時當樣品中含相應的特異性抗體或抗原時，膠體金標記顆粒和樣品中配體相結合形成復合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測T線， 通過檢測線的有無實現對結果的判定。具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。
發明內容本實用新型的目的是提供一種風疹病毒IgM和IgG抗體檢測試紙，具有操作簡便、 反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。本實用新型提供一種風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，其特征在于其特征在于塑料支撐板(8) —端連接上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標記風疹病毒特異性的抗原gpEl的膠體金墊O)，膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線Tl (5)、檢測線T2 (6)和質控C線，檢測線Tl (5)為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，檢測線T2 (6)為包被在NC膜上的抗人IgG抗體，質控C線(7) 為包被在NC膜上的抗風疹病毒gpEl抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，其特征在于所述的抗原風疹病毒特異性的抗原gpEl抗原是利用基因工程重組表達的抗原。所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成。所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，所述的抗原的包被方法為以 0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgM抗體配制成l_2mg/ml的溶液，以0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBQ將抗人IgG抗體配制成l-2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以1-1. 5ul/cm的參數進行劃線，包被Tl、T2線，同時在NC膜上部包被抗風疹病毒gpEl抗體作為C線，劃線后將NC膜在干燥間，溫度20-25°C，濕度小于30%，干燥2_5小時。所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，所述的抗原標記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm的膠體金溶液，制備完成后取 IOOml膠體金液放在燒杯內，用0. 2M K2CO3調至pH8. 5，按IOOml膠體金溶液加入0. 5_aiig風疹病毒gpEl抗原，室溫攪拌2小時，加入1 %牛血清白蛋白BSA，1 %聚乙二醇PEG20000封閉 20min, 12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復溶至100ml，按Iml溶液鋪20cm2 的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間，溫度20-25 V，濕度小于30 %，干燥2-5小時，制成膠體金墊。所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，所述的試紙的裝配方法為在干燥室內，溫度20-25°C，濕度小于40 %，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼，在膠體金墊另一側搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/5 ；在NC膜C線一側搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10 ；最后用裁剪機將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條，切好的試紙條可以再裝入塑料卡內，形成檢測卡。所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，檢測方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入5-20ul被檢樣品，再加入50-100ul的樣品稀釋液，使膠體金溶解并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在15分鐘內C、T1、T2線的出現情況，并判定檢測結果。本實用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術檢測風疹病毒IgM 和IgG抗體的新型試紙。采用膠體金標記風疹病毒特異性抗原gpEl，包被抗人IgM和IgG 抗體實現對血液中抗風疹病毒抗體的檢測，一次檢測獲得兩種檢測指標，節約時間和成本， 減輕患者的痛苦。具有操作簡便、反應快速、敏感性高、特異性強、適合現場檢測和經濟實用等優點。

圖1風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙結構示意圖。附圖符號說明1 上樣墊；2 膠體金墊；3 =NC膜；4 吸樣墊5 檢測線Tl ；6 檢測線T2 ；7 質控C線；8 塑料支撐板
具體實施方式
實施例制備風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙[0019]1主要材料1. 1風疹病毒特異性gpEl抗原、gpEl抗體北京中原公司產品，為重組抗原，gpEl 抗原用于膠體金標記，gpEl抗體用于NC膜質控線包被；鼠抗人IgM和IgG抗體=Arista公司產品，用于NC膜包被；氯金酸Sigma公司產品；硝酸纖維素(NC)膜=Millipore公司產品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma產品。其它常用試劑均為分析純試劑。1. 2臨床血清由公司在相關醫院獲得，其中風疹病毒IgG抗體陽性樣本80份，IgM 抗體陽性樣本20份，其中包括兩種抗體均陽性樣本15份。兩種抗體全為陰性正常人樣本 50份。1. 3風疹病毒IgM抗體檢測試劑盒(ELISA法)，風疹病毒IgG抗體檢測試劑盒 (ELISA法)國內已注冊的商用產品。2 方法2. 1風疹病毒gpEl重組抗原的膠體金標記氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為 40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2M K2CO3將溶液調到pH7. 5、pH8. 5 和pH9. 0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入0. 5mg、lmg、l. 5mg 將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續攪拌2小時，再滴加入到終濃度為0. 1% 的PEG2000和1 %的BSA進行封閉20min，標記結束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按原體積復溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩沖液，PH8. 0，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性劑中。然后將標記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無紡布上，在溫度20-25°C， 相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-4小時，制成膠體金墊。2. 2NC膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS將鼠抗人 IgM分別稀釋成0. 5mg/mlUmg/ml,2mg/ ml,鼠抗人IgG分別稀釋成0. 5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml，然后用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm 進行分別劃線包被，同時在NC膜上部包被抗gpEl抗體，用于產品的質控，包被完成后將NC 膜在在溫度20-25°C，相對濕度在< 30%的干燥間干燥2-5小時。2. 3風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙的組裝在干燥室內(溫度20_25°C，相對濕度< 30% )取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T 線一側搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼，在膠體金墊另一側搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5)；在NC膜C線一側搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10)；然后用裁剪機將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內，形成風疹病毒IgM 和IgG抗體聯合檢測試劑卡。2. 4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入IOul被檢樣品，若樣品中含抗風疹病毒IgM或IgG抗體，則和樣品墊上的標記gpEl抗原的膠體金結合，形成復合物，并擴散到NC膜上進一步層析，當遇到包被在NC膜上Tl線處的鼠抗人IgM時，復合物則又和包被抗IgM抗體結合，被捕獲在包被處；當遇到包被在NC膜上T2線處IgG時，復合物則又和包被抗體結合，被捕獲在包被線T2處；當被捕獲的膠體金復合物達到一定數量時，則形成一條肉眼可見的Tl或T2線；若血清中不含特異性抗體，則不能形成免疫復合物，亦不能形成T線，C線作為試劑的質控標準，陽性和陰性樣品檢測時均會出現。用肉眼直接觀察在5、10、15、20、和30分鐘內C、T線的出現情況，并判定檢測結果。[0028]2. 5試紙工藝參數調試將濃度不同標記、包被的試劑進行組合配對，制備小樣，利用質控血清對試劑進行測試，發現最佳組合。2. 6臨床血清檢測用本試劑按檢測方法對所有臨床血清進行檢測，同時用商用檢測ELISA試劑進行對照檢測。3 結果3. 1試紙參數確定根據小樣的檢測結果，確定了試紙的最佳標記pH值為8. 0 ；重組混合抗原的最佳標記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為IOmM硼酸酸鹽緩沖液，PH8. 5，含0. 5% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳包鼠抗人IgM和IgG 包被濃度均為1.5mg/ml。檢測結果的最佳判定時間為5_15分鐘。但以上參數在制備不同批次產品時可能需要適當調整。3. 2臨床血清檢測以ELISA試劑為對照，對IgG抗體進行檢測，本試劑IgG檢測出陽性78份，ELISA檢測出IgG陽性80份，靈敏度=78/80 = 97.5% ；本試劑IgG陰性樣本檢測均為陰性，相對特異性100%。P > 0. 05。以ELISA試劑為對照，對IgM抗體進行檢測， 本試劑IgM檢測出陽性19份，ELISA檢測出IgM陽性20份，靈敏度=19/20 = 95. 0% ；本試劑IgM陰性樣本檢測均為陰性，相對特異性100%。P > 0. 05。IgM和IgG同時為陽性的樣本本試劑檢測和ELISA試劑完全一致。臨床檢測表明本試劑的性能和ELISA試劑相比無顯著性差異，適合用于臨床檢測。
權利要求1.一種風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，其特征在于塑料支撐板(8) —端連接上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標記風疹病毒特異性的抗原gpEl的膠體金墊 O)，膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線Tl (5)、檢測線T2 (6)和質控C線，檢測線Tl (5)為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，檢測線T2(6)為包被在NC膜上的抗人IgG抗體，質控C線(7)為包被在NC膜上的抗風疹病毒gpEl抗體，NC的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。
2.根據權利要求1所述的風疹IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，其特征在于所述的抗原風疹病毒特異性抗原gpEl是利用基因工程重組表達的抗原。
3.根據權利要求1所述的風疹病毒IgM和IgG抗體聯合檢測試紙，其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構成。
專利摘要本實用新型公開了一種風疹病毒IgM和IgG聯合檢測試紙。特征在于塑料支撐板(8)一端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標記風疹病毒特異性的抗原gpE1的膠體金墊(2)，膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，膜上包被有相互分離的檢測線T1(5)、檢測線T2(6)和質控C線，檢測線T1(5)為抗人IgM抗體，檢測線T2(6)為抗人IgG抗體，質控C線(7)為抗風疹病毒gpE1抗體，NC膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。檢測時將樣品加在上樣墊上，15分鐘內肉眼直接觀察，判定檢測結果。具有操作簡便、快速、適合現場檢測和經濟實用等優點。
文檔編號G01N33/569GK202153226SQ20112018610
公開日2012年2月29日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司